許永娣, 馬星光, 孫亞偉

[中國石油大學(華東) 化學化工學院,山東 青島 266580]

核酸藥物是一類能夠直接作用于致病靶基因的藥物,可在分子水平上調(diào)控致病基因的表達,目前已經(jīng)成為臨床醫(yī)藥學的重要組成部分[1-2]。核酸藥物的發(fā)展對非天然核苷提出了更高的需求,科研工作者們設(shè)計并合成了大量不同結(jié)構(gòu)和功能的非天然核苷和非天然寡聚核苷酸來滿足研發(fā)基因藥物的需求。

非天然寡聚核苷酸的結(jié)構(gòu)修飾策略大致分為3類,一是對核糖或脫氧核糖單元進行化學修飾或結(jié)構(gòu)改造,比如在核糖2′-位引入不同構(gòu)象的鹵素原子、醚基、胺基或者烷基單元[3-5],以改善其形成高級結(jié)構(gòu)的化學和生物學穩(wěn)定性;二是對核苷酸中磷酸二酯進行化學結(jié)構(gòu)改造,比如將其中的磷氧雙鍵替換為磷硫雙鍵,可有效改善核酸藥物的抗酶降解能力[6-7];三是對核苷酸上的堿基進行官能團修飾或結(jié)構(gòu)改造,來調(diào)節(jié)核酸高級結(jié)構(gòu)形成的熱力學和動力學,以及改善其抗酶切能力[8-9]。

上世紀90年代,Shigeki Sasaki課題組[10-11]提出,在天然核苷的堿基上引入乙烯基團,可使其與臨近核苷上堿基中的胺基發(fā)生Michael反應,實現(xiàn)堿基之間的交聯(lián)。他們將可交聯(lián)核苷修飾到寡聚核苷酸結(jié)構(gòu)中,通過DNA的鏈間交聯(lián)實現(xiàn)基因的定點誘變,從而進行基因表達的調(diào)控。該類型的可交聯(lián)核苷在分子生物學,基因藥物以及DNA材料等領(lǐng)域表現(xiàn)出很大的應用價值[12-13]。研究中發(fā)現(xiàn),乙烯基團的高化學活性使得其無法直接用于DNA的化學合成和修飾,因此需要對其進行適當?shù)谋Ｗo。目前對乙烯基的保護策略是使用甲硫基作為保護單元,該基團在DNA固相合成中的氧化步驟中會被氧化為亞砜基團,而亞砜基團在DNA氨解時會發(fā)生β消除,暴露出乙烯基(Chart 1)。

Chart 1

近年來,隨著研究人員對可交聯(lián)類核苷及相關(guān)衍生物研究的不斷深入,其市場需求也增長,因此對原有的合成路線進行工藝改進和優(yōu)化具有十分重要的現(xiàn)實意義。目前可交聯(lián)類核苷的合成方法是以脫氧鳥苷(dG)為原料,經(jīng)過5步單元反應來實現(xiàn)(Scheme 1)。該方法工藝路線成熟,但是原料成本較高,工藝過程較為繁瑣。為了簡化純化步驟,優(yōu)化合成工藝,本論文以商業(yè)化的1-氯-2-脫氧-3,5-二-O-對甲苯甲?；?D-呋喃核糖為原料,將五步合成縮短為四步,并使用結(jié)晶來對中間體進行純化,以較好的收率實現(xiàn)了目標產(chǎn)物的合成,為大規(guī)模生產(chǎn)該類化合物提供了新的思路。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RE52CS型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);Bruker AMX-400 MHz型核磁共振譜儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標);6510 Q-TOF型質(zhì)譜儀;XT-4型顯微熔點儀。

1-氯-2-脫氧-3,5-二-O-對甲基苯甲?；?D-核糖、2-氨基-6-氯-嘌呤、二(三甲基硅基)氨基鈉,氯化鋰、四(三苯基膦)鈀、三丁基錫乙烯、氯化銨、20%甲硫醇鈉溶液、無水乙腈,分析純,上海泰坦科技股份有限公司;二氯甲烷、1,4-二氧六環(huán)、甲醇、氨水、乙酸乙酯、無水硫酸鈉,分析純,國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 合成

(1) 化合物8的合成

將30.7 mL(27.7 mmol)的二(三甲基硅基)氨基鈉分散在100 mL乙腈中,攪拌下于55 ℃加入16.9 g(100 mmol) 2-氨基-6-氯-嘌呤,反應2 h。將44.6 g(120 mmol) 1-氯-2-脫氧-3,5-二-O-對甲基苯甲?；?D-核糖分散在200 mL乙腈中,一次性加入到反應體系中,攪拌下于55 ℃反應8 h(TLC檢測)。向反應液中加入10 mL水和5 mL飽和氯化銨溶液淬滅反應。旋蒸除去乙腈,殘余物加入400 mL乙酸乙酯和200 mL水,分液,有機相濃縮,殘余物經(jīng)硅膠柱層析[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1∶1]純化。

化合物8： 白色固體,收率65.5%, m.p.55 ℃;1H NMRδ: 2.33(s, CH3, 3H), 2.36(s, CH3, 3H), 2.69～2.73(m, ArH, 1H), 3.17～3.22(m, ArH, 1H), 4.49～4.53(m, CH2, 2H), 4.58～4.62(m, ArH, 1H), 5.71～5.72(t, ArH, 1H), 6.36～6.38(q, ArH, 1H), 6.99(s, CH2, 2H), 7.25～7.27(d, ArH, 2H), 7.32～7.33(d, ArH, 2H), 7.79～7.81(d, ArH, 2H), 7.89～7.90(d, ArH, 2H), 8.32(s, ArH, 1H);13C NMRδ: 21.71, 35.96, 64.60, 75.56, 82.20, 83.96, 124.23, 127.03～127.09, 129.81～129.98, 141.66, 144.36～144.64, 150.25, 154.21, 160.35, 165.73, 166.00; ESI-MSm/z: Calcd for C26H24ClN5O5{[M+H]+}522.1466, found 522.1539。

(2) 化合物9的合成

稱取1.54 g化合物8,780 mg(0.7 mmol)四(三苯基膦)鈀和270 mg(6.4 mmol)氯化鋰分散在20 mL 1, 4-二氧六環(huán)中,攪拌20 min后加入7.8 mL(26.7 mmol)三丁基錫乙烯,體系升溫回流15 h。反應結(jié)束后,向體系中加入50 mL乙酸乙酯和20 mL氨水,有機相用飽和食鹽水洗滌后,加入無水硫酸鈉干燥,粗產(chǎn)品用柱層析分離純化(V(二氯甲烷)/V(乙酸乙酯)=3/1)。

化合物9： 黃色固體,收率80%, m.p.43～44 ℃;1H NMRδ: 2.33(s, CH3, 3H), 2.37(s, CH3, 3H), 2.46～2.47(t, ArH, 1H), 2.68～2.72(m, ArH, 1H), 3.19～3.24(m, ArH, 1H), 5.71～5.72(q, ArH, 1H), 5.80～5.83(q, ArH, 1H), 6.52(s, CH2, 2H), 6.77～6.81(q, ArH, 1H), 6.90～6.95(q, ArH, 1H), 7.26～7.28(d, CH2, 2H), 7.33～7.34(d, CH2, 2H), 7.51～7.53(q, ArH, 1H), 7.57～7.64(td, ArH, H), 7.81～7.82(d, ArH, 2H), 7.90～7.91(d, ArH, 2H), 8.27(s, ArH, 1H);13C NMRδ: 21.76, 35.88, 64.67, 75.68, 82.06, 83.56, 125.10, 125.74, 127.07, 127.12, 129.84, 130.00, 133.15, 141.02, 144.36, 144.64, 153.79, 154.17, 160.75, 165.74, 166.03; ESI-MSm/z: Calcd for C28H27N5O5{[M+H]+}514.2012, found 514.2085。

(3) 化合物10的合成

稱取620 mg化合物9分散在20 mL無水乙腈中,然后加入700 μL 20%的甲硫醇鈉水溶液,30 min后TLC檢測反應完全。旋蒸除去乙腈溶劑,然后向體系中加入50 mL乙酸乙酯和50 mL水,有機相用50 mL飽和食鹽水洗滌之后用無水硫酸鈉干燥,粗產(chǎn)品以待下一步反應。

化合物10： 淡黃色固體,收率89%, m.p.48～49 ℃;1H NMRδ: 2.05(s, CH3, 3H), 2.33(s, CH3, 3H), 2.36(s, CH3, 3H), 2.66～2.70(m, ArH, 1H), 2.88～2.90(t, CH2, 2H), 3.07～3.10(t, CH2, 2H), 3.18～3.23(m, ArH, 1H), 4.49～4.52(t, CH2, 2H), 4.59～4.62(m, ArH, 1H), 5.70～5.72(m, ArH, 1H), 7.27～7.28(t, ArH, 2H), 7.33～7.34(d, ArH, 2H), 7.82～7.83(d, ArH, 2H), 7.90～7.91(d, ArH, 2H), 8.19(s, ArH, 1H);13C NMRδ: 15.08, 21.72, 21.76, 31.71, 32.81, 35.83, 64.68, 75.70, 82.02, 83.56, 126.38, 127.07～127.13, 129.85～129.99, 140.07, 144.36, 144.63, 152.90, 160.76, 161.13, 165.74, 166.03; ESI-MSm/z: Calcd for C29H31N5O5S{[M+H]+}562.2045, found 562.2119。

(4) 化合物6的合成

將上一步粗產(chǎn)品濃縮溶于10 mL二氯甲烷和4 mL飽和氨的甲醇溶液中,將體系置于耐壓反應管內(nèi)80 ℃攪拌反應,反應時間8 h,得到的粗產(chǎn)品通過乙酸乙酯結(jié)晶可得到純品。

化合物6： 白色固體,收率83%, m.p.79～80 ℃;1H NMRδ: 2.05(s, CH3, 3H), 2.17～2.21(m, ArH, 1H), 2.46～2.47(t, ArH, 1H), 2.57～2.62(m, ArH, 1H), 2.88～2.91(t, CH2, 2H), 3.07～3.09(t, CH2, 2H), 3.45～3.49(m, ArH, 1H), 3.52～3.55(m, ArH, 1H), 3.78～3.80(m, ArH, 1H), 4.32～4.34(m, ArH, 1H), 4.94～4.96(m, ArH, 1H), 5.26(d, ArH, 1H), 6.19～6.22(q, ArH, 1H), 6.44(s, CH2, 2H), 8.18(s, ArH, 1H);13C NMRδ: 15.07, 31.74, 32.77, 62.25, 71.31, 83.12, 88.15, 126.29, 140.06, 152.84, 160.66, 160.86; ESI-MSm/z: Calcd for C13H19N5O3S{[M+H]+}326.12086, found 326.1281。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿種類以及用量的優(yōu)化

在文獻報導的可交聯(lián)核苷類似物的合成方法中,Shigeki Sasaki課題組選擇脫氧鳥苷(dG)作為起始原料。脫氧鳥苷價格較高,而且其在多種有機溶劑中溶解性均很差,操作較為困難。本文選擇了商業(yè)化的1-氯-2-脫氧-3,5-二-O-對甲苯甲?；?D-呋喃核糖作為起始原料,通過SN2反應將鳥嘌呤以C—N糖苷鍵連接到脫氧戊糖環(huán)上,構(gòu)建脫氧鳥苷類似物(Scheme 2)。本文考察了不同類型的堿在反應中的作用[14](表1),以及反應時間和反應溫度對于目標產(chǎn)物收率的影響,最終選擇二(三甲基硅基)氨基鈉作為堿,在55 ℃下反應8 h能以較高的收率得到目標產(chǎn)物。

表1 有機堿種類對化合物8產(chǎn)率的影響

2.2 有機錫試劑的用量的優(yōu)化

在鳥嘌呤可交聯(lián)核苷類似物的合成過程中,需要使用三丁基乙烯基錫作為乙烯基試劑,通過Stille反應將嘌呤6-位上的氯轉(zhuǎn)化為乙烯基[15]。文獻報道中有機錫試劑使用量為原料物質(zhì)的量的6倍,有機錫試劑價格昂貴,且化學毒性較大,因此我們希望減少其在合成中的使用量。本文考察了反應中有機錫的使用量,表2中的實驗結(jié)果證實,將有機錫試劑使用量降為2倍物質(zhì)的量時,收率仍維持在80%左右,與使用6倍物質(zhì)的量時的收率相當;但當錫試劑量進一步降低為1.5倍物質(zhì)的量時,化合物9的收率即會大大下降。我們最終選擇使用2倍物質(zhì)的量的三丁基乙烯基錫作為乙烯基試劑,該比例在保證轉(zhuǎn)化率的同時降低了有機錫試劑的用量,降低了實驗成本,減少了環(huán)境污染。

表2 有機錫試劑用量對化合物9收率的影響

2.3 脫氧核苷羥基保護基團的選擇與脫除

在目標分子的合成過程中需要對脫氧核糖中3′-和5′-端的兩個羥基進行保護來避免副反應的發(fā)生,常見的保護方法有酯類保護(乙酸酯保護,碳酸環(huán)酯保護和對甲基苯甲酸甲酯保護等)和醚類保護(硅醚保護,芐醚保護和烷氧基甲基醚保護等)[16-18]。酯類保護基團的脫除多通過堿性水解來實現(xiàn),而硅醚類保護基團多通過含氟的季銨鹽,如四烷基氟化銨TBAF(四丁基氟化銨)來脫除。Shigeki Sasaki課題組選用了TBDMS(叔丁基二甲基硅醚)來作為脫氧核苷中羥基的保護基團,并使用TBAF來進行脫保護。我們在重復實驗時發(fā)現(xiàn), TBAF是一種強親核氟化劑[19],處理不干凈對后續(xù)的反應會產(chǎn)生極大的干擾,并且其脫保護時間很長(24 h以上)。因此本文選擇了含有Tol保護基團(對甲基苯甲酸甲酯)來對脫氧戊糖環(huán)的羥基進行保護,使用氨氣的飽和甲醇溶液來切除保護基團。論文對實驗的反應時間以及溫度進行了探究,來探索脫保護的最佳條件。表3中的實驗結(jié)果證實切除保護基團的氨解反應在溫度80 ℃,時間2 h可以得到較高的收率。脫除保護基團的化合物6在乙酸乙酯溶劑中進行結(jié)晶即得到高純度的結(jié)晶。

Scheme 2

表3 氨解反應時間及溫度對化合物6收率的影響

報道了一種合成可交聯(lián)嘌呤類脫氧核苷類似物的新方法。該方法以商業(yè)化的氯糖為起始原料,經(jīng)過4步有機合成制備了可交聯(lián)鳥嘌呤脫氧核苷。通過優(yōu)化反應條件,在降低實驗成本的同時減少了環(huán)境的污染,并改進了脫保護的條件和最終產(chǎn)品的純化方法。