乳果糖對(duì)失血性休克大鼠急性肺損傷的作用及機(jī)制

鄭強(qiáng) 唐勇 周程繼 谷子 劉世平

1成都市第二人民醫(yī)院急診科（成都617000）；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科（四川南充637000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是創(chuàng)傷失血性休克（hemorrhagic traumatic shock，HTS）晚期死亡的主要原因，而創(chuàng)傷失血性休克早期即可出現(xiàn)ALI［1］。氫氣是自然界含量豐富、易得、廉價(jià)、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單及方便的一種分子量極小的氣體，它可以自由并快速地在組織間穿梭，從而加快氫分子與細(xì)胞內(nèi)分子的生化反應(yīng)［2］。最新國(guó)內(nèi)外研究［3-6］發(fā)現(xiàn)，氫氣對(duì)腦、腸、腎、脊髓等器官通過(guò)抗氧化、清除氧自由基等方式，對(duì)于缺氧缺血及再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用。乳果糖是一種人工合成的雙糖，可被定植在胃腸道的菌群分解，產(chǎn)生大量的氫氣，氫氣快速進(jìn)入組織，通過(guò)抗氧化等方式發(fā)揮組織保護(hù)作用［7］，但具體機(jī)制尚不清楚。因此本研究推測(cè)在失血性休克動(dòng)物模型中，乳果糖可通過(guò)動(dòng)物模型胃腸道的菌群分解產(chǎn)生氫氣，氫氣快速進(jìn)入組織發(fā)揮抗氧化等作用，抑制炎癥因子的釋放，進(jìn)而對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。故本研究擬采用乳果糖灌胃干預(yù)失血性休克大鼠模型，探討乳果糖對(duì)模型急性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，從而為臨床干預(yù)創(chuàng)傷失血性休克提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源 雄性SD 大鼠由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2 試劑與設(shè)備 IL-6、IL-1β 試劑盒由武漢六合生物技術(shù)有限公司提供；SOD、MDA、MPO 試劑盒由南京建成科技有限公司提供；抗兔HMGB1 單抗購(gòu)自美國(guó)Santa 公司；抗羊二抗購(gòu)自上海基因科技有限公司。以上標(biāo)本的檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)設(shè)備均按照操作說(shuō)明書進(jìn)行并嚴(yán)格遵守成都天府生命科技園各實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

1.1.3 倫理審核 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及成都市第二人民醫(yī)院科研委員會(huì)批準(zhǔn)了所有的研究方案。

1.2 方法

1.2.1 建模 選用250 ～300 g 的雄性SD 大鼠，使用1%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉，固定，碘伏消毒，外科手術(shù)分離左右股動(dòng)、靜脈并置管，股動(dòng)脈連接三通管后接壓力轉(zhuǎn)換器（Pclab-530C生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)）、計(jì)算機(jī)行持續(xù)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)和抽血，股靜脈用于輸液。經(jīng)股靜脈緩慢抽血放血30 min，使平均動(dòng)脈壓（MAP）逐漸降至35 mmHg，并維持60 min，在90 min 時(shí)給予生理鹽水復(fù)蘇，使MAP 控制在（50±2）mmHg，維持60 min。150 min后，以血液回輸及生理鹽水復(fù)蘇，使MAP 控制在≥80 mmHg，并維持120 min。270 min（復(fù)蘇成功）后處死，采集血液及肺組織。

1.2.2 分組 失血性休克模型制備前60 min，先分為乳果糖預(yù)灌胃組即實(shí)驗(yàn)組2（10 只）：在模型制備前60 min給予乳果糖0.25 g/kg（稀釋到0.75 mL/kg）灌胃。將實(shí)驗(yàn)組2 及未進(jìn)行乳果糖預(yù)灌胃處理的SD 大鼠同時(shí)麻醉，左右股動(dòng)靜脈置管成功后再將未進(jìn)行乳果糖預(yù)灌胃處理的SD 大鼠分為三組：假手術(shù)組即空白組（10 只）：僅作置管；生理鹽水復(fù)蘇組即對(duì)照組（10 只）：在MAP 降至35 mmHg時(shí)等體積生理鹽水灌胃；乳果糖治療組即實(shí)驗(yàn)組1（10 只）：在MAP 降至35 mmHg 時(shí)給予乳果糖0.25 g/kg（稀釋到0.75 mL/kg）灌胃。四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置管成功后制備失血性休克模型。

1.2.3 標(biāo)本收集及處理 （1）在實(shí)驗(yàn)期間，持續(xù)監(jiān)測(cè)生命體征（Pclab-530C 生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)）。（2）在0、30 及270 min 分別測(cè)定血?dú)夂腿樗嶂担ˋBL90 血?dú)夥治鰞x）。（3）Western blot 法檢測(cè)270 min 肺組織高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）行聚丙烯酰胺凝膠電泳：將目標(biāo)蛋白移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，PBS 洗膜后，一抗（抗兔HMGB1 單抗）4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗（抗羊二抗），37 ℃孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光劑避光反應(yīng)，將硝酸纖維素膜放至暗室中曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白與其相比進(jìn)行半定量分析；Elisa 法檢測(cè)270 min 血IL-6、IL-1β。（4）270 min 取肺組織一部分用10%甲醛溶液固定24 h，逐級(jí)乙醇脫水、二甲苯浸泡、浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼、HE 染色后由我院病理科2 位有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)生采用雙盲法對(duì)每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行分析。（5）270 min 取5g 肺組織碾磨并生理鹽水定量稀釋后用比色法檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、TBA法檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間差異比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 25.0 軟件包進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 基本實(shí)驗(yàn)資料 0 min MAP:（130.0±15.7）mmHg，30 min MAP：（35.0 ± 1.3）mmHg，90 min MAP：（50±1.8）mmHg，270 min MAP：（112±13.8）mmHg。符合實(shí)驗(yàn)失血性休克各階段建模要求。見圖1。

圖1 失血性休克模型MAP 和心率電腦采集圖（Pclab-530C 生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)）Fig.1 MAP and heart rate computer acquisition map of hemorrhagic shock model（Pclab-530c biomedical signal acquisition system）

2.2 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 動(dòng)物模型血?dú)饧叭樗嶂捣治?在270 min 時(shí)，對(duì)照組PO2值明顯低于空白組、實(shí)驗(yàn)組1及實(shí)驗(yàn)組2（P＜0.05）。其余動(dòng)脈血?dú)夥治黾叭樗嶂蹈鹘M間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 血?dú)饧叭樗嶂礣ab.1 Blood gas and lactic acid values of blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 ±s

表1 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 血?dú)饧叭樗嶂礣ab.1 Blood gas and lactic acid values of blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 ±s

注：在225 min 時(shí)，對(duì)照組 分別與空白組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 比較Po2，*P ＜0.05

pH Po2（mmHg）Pco2（mmHg）HCO3-（mmol/L）堿剩余（mmol/L）乳酸（mmol/L）時(shí)間（min）0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270空白組7.39±0.02 7.27±0.04 7.30±0.02 98.7±2.4 83.6±3.1 95.5±4.7 41.5±1.6 31.7±0.7 38.7±3.1 23.5±1.7 15.2±1.4 18.7±1.2 3.1±0.3-15.8±1.6-5.8±0.6 1.7±0.2 13.2±1.7 7.3±0.5對(duì)照組7.41±0.03 7.22±0.03 7.26±0.03 96.8±3.5 78.5±5.8 81.6±6.1 42.7±0.5 30.5±1.3 37.5±2.5 23.4±2.3 13.7±2.5 18.0±1.8 3.1±0.4-18.2±2.2-8.2±1.1 1.6±0.3 15.4±2.1 8.6±1.6實(shí)驗(yàn)組1 7.40±0.03 7.27±0.03 7.31±0.03 98.8±3.0 86.6±4.9 97.2±3.7 42.1±1.4 30.6±1.2 38.6±1.9 22.2±2.0 15.2±2.2 19.1±2.2 3.0±0.4-15.7±1.6-6.9±1.3 1.5±0.2 13.8±1.9 8.0±1.5實(shí)驗(yàn)組2 7.41±0.02 7.28±0.04 7.32±0.03 98.6±2.8 83.1±3.3 96.8±4.2 41.5±1.0 31.8±1.1 38.8±1.5 21.8±2.6 15.1±1.9 19.4±2.5 3.2±0.3-15.5±1.4-7.2±1.1 1.6±0.2 14.0±1.2 8.1±0.9 P 值0.40 0.41 0.28 0.39 0.18 0.04*0.39 0.21 0.29 0.18 0.14 0.09 0.36 0.11 0.18 0.22 0.10 0.09

2.3 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 的IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 與空白組比較，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 均較高（P＜0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2 分別比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPOTab.2 Blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 IL-6，IL-1β，SOD，MDA，MPO ±s

表2 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPOTab.2 Blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 IL-6，IL-1β，SOD，MDA，MPO ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組1 比較，&P ＜0.05

組別空白組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2 IL-6（pg/mL）15.3±5.5 74.6±16.5*66.8±14.2*60.6±13.6*#&IL-1β（pg/mL）25.2±18.2 149.5±44.6*145.5±46.3*130.3±48.5*#&SOD（u/g）52.6±15.3 206.5±36.4*224.4±32.8*237.7±33.6*#&MDA（nmol/mg）38.6±11.3 186.5±20.6*181.2±22.8*175.2±24.6*#&MPO（ng/mL）69.2±12.5 279.2±48.6*272.5±40.6*248.5±32.6*#&

2.4 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 的HMGB1 蛋白免疫印跡 對(duì)照組HMGB1 分別與空白組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 的HMGB1 蛋白免疫印跡Fig.2 Western blot of HMGB1 protein in blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2

2.5 空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組（1、2）的肺組織病理切片 實(shí)驗(yàn)組1 較實(shí)驗(yàn)組2 肺泡內(nèi)皮及肺泡組織明顯破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組1及實(shí)驗(yàn)組2 肺泡內(nèi)皮及肺泡組織破壞嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯。見圖3。

圖3 空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 肺組織病理切片（HE 染色×200）Fig.3 Pathological sections of lung tissues in blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2（HE×200）

3 討論

嚴(yán)重失血是創(chuàng)傷導(dǎo)致死亡的主要原因，約占創(chuàng)傷致死的30% ～40%［8］。在失血性休克發(fā)生后肺往往是最先和最易受累的器官，一般發(fā)病早期即可出現(xiàn)ALI，ALI 的發(fā)生率高達(dá)80%以上［9］。創(chuàng)傷失血性休克的處理主要在于早期的液體復(fù)蘇，恢復(fù)機(jī)體有效血容量，滿足組織的灌注阻止器官組織缺血壞死［10］。然而，在液體復(fù)蘇時(shí)，往往引起組織再灌注損傷。組織產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基可作為信息分子，廣泛激活炎癥系統(tǒng)，在肺組織中會(huì)有大量炎性細(xì)胞的聚集，并產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、趨化因子、氧自由基及其他一些炎性介質(zhì)等，可引起肺部炎癥和ALI［11-14］。

HMGB1 是一種保守的非組蛋白核蛋白，廣泛分布于淋巴、腦、肝、肺、心、腎等組織中，胞核HMGB1 可調(diào)控核小體穩(wěn)定、DNA 的重組復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄。研究［15］表明，HMGB1 參與了失血性休克急性肺損傷的過(guò)程，失血性休克可引起組織中HMGB1 濃度升高，HMGB1 可誘導(dǎo)NF-κB、IL-1β等炎癥因子釋放進(jìn)而誘發(fā)ALI，抑制HMGB1 信號(hào)可減輕ALI。

氫氣可選擇性的作用于活性氧簇ONOO-和OH-，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，能減輕組織缺血再灌注損傷。研究［16］證明，在鼠膿毒癥模型中，吸入氫氣，可抑制氧化應(yīng)激，降低血液、肝、腎、肺組織中HMGB1 的濃度。在肝缺血再灌注損傷大鼠模型中，氫氣同樣可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制HMGB1 的釋放，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮肝保護(hù)作用［17-19］。

乳果糖是一種人工合成的雙糖，常被用于便秘和肝性腦病等的治療。乳果糖可被定植在胃腸道的菌群分解，產(chǎn)生大量的氫氣，發(fā)揮組織保護(hù)作用［20］。在大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型中，乳果糖通過(guò)胃腸道的菌群分解產(chǎn)生氫氣，氫氣進(jìn)入腦組織減輕氧化性損傷、細(xì)胞凋亡，減少梗死面積［21］。在70%部分肝切除肝再生大鼠模型中，乳果糖通過(guò)胃腸道的菌群分解產(chǎn)生氫氣，氫氣進(jìn)入肝組織可升高SOD 水平，抑制HMGB1，進(jìn)而降低ALT、AST及丙二醛MDA 的水平，促進(jìn)肝細(xì)胞再生［22］。

IL-6、IL-1β 具有較強(qiáng)的促炎活性，可誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子，并最終導(dǎo)致廣泛的炎癥事件。SOD 是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，降低MDA、MPO 及多種炎性介質(zhì)的水平，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分［23］。本研究結(jié)果顯示空白組IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 分別與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 比較均有明顯差異，且對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 上述指標(biāo)均大幅度增高；實(shí)驗(yàn)組2 除SOD 結(jié)果高于對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組1 外，IL-6、IL-1β、MDA、MPO 較對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組1 低；然而實(shí)驗(yàn)組1 較對(duì)照組上述指標(biāo)無(wú)明顯差異，可能與最后實(shí)驗(yàn)采集標(biāo)本時(shí)間過(guò)短有關(guān)，未能達(dá)到預(yù)期值。在肺病理學(xué)切片結(jié)果可以看出實(shí)驗(yàn)組1較實(shí)驗(yàn)組2肺泡內(nèi)皮及肺泡組織明顯破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組1及實(shí)驗(yàn)組2 肺泡內(nèi)皮及肺泡組織破壞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯。血?dú)夥治鼋Y(jié)果可以看出在225 min 時(shí)，對(duì)照組Po2明顯低于空白組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2，提示失血性休克模型引發(fā)了模型急性肺損傷，而乳果糖減輕了模型的急性肺損傷，增加了氧飽和度。以上結(jié)果說(shuō)明乳果糖預(yù)灌胃組對(duì)肺組織保護(hù)作用要優(yōu)于失血性休克造模后乳果糖灌胃組，進(jìn)一步說(shuō)明乳果糖對(duì)失血性休克大鼠的肺組織具有保護(hù)作用。

HMGB1 可調(diào)控核小體穩(wěn)定、DNA 的重組復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)多種炎性因子的釋放，如IL-6、IL-1β 等，進(jìn)而造成多種器官的損傷［24］。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組1 較實(shí)驗(yàn)組2 HMGB1 蛋白水平高。對(duì)照組較空白組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 HMGB1蛋白含量最高。從上述結(jié)果可以看出失血性休克時(shí)可引起體內(nèi)HMGB1 蛋白含量迅速增高，而實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 HMGB1 蛋白含量明顯低于對(duì)照組，提示乳果糖可降低失血性休克大鼠模型的HMGB1 蛋白含量，進(jìn)而降低IL-6、IL-1β 等炎性因子，保護(hù)肺組織。

綜上所述，在失血性休克模型中，乳果糖可通過(guò)胃腸道的菌群分解產(chǎn)生氫氣，氫氣快速進(jìn)入組織可促進(jìn)SOD 的生成并抑制HMGB1 的生成，進(jìn)而抑制IL-6、IL-1β、MDA、MPO 等炎性介質(zhì)的釋放，保護(hù)肺組織，這將為臨床搶救失血性休克患者、預(yù)防ALI 提供參考及干預(yù)的靶點(diǎn)。