羅婷婷 潘煒倫 涂嫣紅 李博 鄭磊

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州510515）

癌癥是危害人類健康的重大疾病之一，納米醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展為癌癥的精準(zhǔn)治療提供了一個(gè)有效的方案。但納米藥物在臨床轉(zhuǎn)化方面仍存在挑戰(zhàn)，如納米顆粒的潛在生物毒性、腫瘤的耐藥性、藥物到達(dá)病灶效率低下等。因此，對(duì)納米藥物在人體內(nèi)的去向，以及其在腫瘤灶中的治療效果進(jìn)行追蹤監(jiān)測(cè)勢(shì)在必行。診療一體化是一種將疾病的診斷或監(jiān)測(cè)與治療有機(jī)結(jié)合的新型生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，對(duì)于提高癌癥的治療效果和減小副作用等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種常用的化療藥物，被廣泛用于腫瘤治療，但仍存在脫靶嚴(yán)重、對(duì)正常細(xì)胞毒性高等缺陷［1］。脂質(zhì)體［2-4］（liposomes，LPs）是兩性分子在水相環(huán)境中形成的類似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層封閉囊泡，其生物相容性好、穩(wěn)定性佳、毒性低，且能夠負(fù)載種類多樣的治療靶向藥物，是實(shí)行癌癥診療一體化策略的良好載體［5］。脂質(zhì)體類納米藥物在到達(dá)癌癥病灶后主要依靠胞吞作用與膜融合效應(yīng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體（cationic liposomes，CLPs）［3，6］由正電荷脂質(zhì)構(gòu)成，與陰離子脂質(zhì)體相比，對(duì)細(xì)胞膜有更強(qiáng)的膜融合效果，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)體入胞效率，提升藥物治療效率。此外，DOX 具有可激發(fā)熒光信號(hào)，便于觀察藥物與細(xì)胞間的相互作用。本研究通過對(duì)DOX 作用于腫瘤細(xì)胞的方式進(jìn)行改進(jìn)，以CLPs 作為載體，DOX 作為治療劑與成像分子，通過一鍋法制備CLPs-DOX 納米載藥系統(tǒng)［7］，用作乳腺癌細(xì)胞的治療與成像，達(dá)到診療一體化的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 二油酰氧基丙基三乙銨（DSPC）、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPEPEG-COOH）購(gòu)自Aladdin 公司、膽固醇、氯仿、鹽酸-阿霉素、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、磷酸鹽緩沖液（PBS，1×，pH 7.4）、DMEM 培養(yǎng)液、96 孔板、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液、青霉素-鏈霉素溶液、CCK8 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州學(xué)友生物科技有限公司。

1.2 合成CLPs 和CLPs-DOX 一鍋法合成CLPs-DOX 和CLPs：DSPC（80 μL，1.0 mmol/L），DSPEPEG-COOH（80 μL，1.0 mmol/L）、膽固醇（25 μL，1.0 mmol/L）和不同濃度DOX 混勻于3 mL 氯仿。減壓蒸干氯仿后，底部可見一層不透明薄膜，加入2 mL 純水或PBS 重懸，然后依次通過0.2 μm 的聚碳酯纖維膜反復(fù)擠壓20 次，得到粒徑均一的CLPs、CLPs-DOX 溶液，放置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擠出法合成CLPs-DOX：通過將上述合成的CLPs 中加入相同濃度的DOX，超聲混勻后，將上述混合物通過0.2 μm 的聚碳酯纖維膜反復(fù)擠壓20 次，得到粒徑均一的CLPs-DOX 溶液，放置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與成像 用培養(yǎng)皿培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞，添加含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液和1%青霉素-鏈霉素，在37 ℃和5%CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液洗滌兩次，在每一個(gè)皿分別加入PBS、1 × 1010個(gè)CLPs、CLPs-DOX 和對(duì)應(yīng)濃度的DOX，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS 緩沖液洗滌兩次進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。成像實(shí)驗(yàn)中使用共聚焦顯微鏡觀察，用波長(zhǎng)為488 nm 的激光激發(fā)，收集對(duì)應(yīng)通道的熒光信號(hào)。

1.4 CCK8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將乳腺癌細(xì)胞按照每孔約5 000 個(gè)細(xì)胞種在96 孔板中，加入含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，并置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。每板分別加入0、0.1×108、1×108、5 × 108、1 × 109個(gè)CLPs、CLPs-DOX 和對(duì)應(yīng)濃度的DOX，每個(gè)濃度設(shè)置六個(gè)子孔并置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48 h。棄去各孔中的培養(yǎng)液，加入100 μL DMEM 不完全高糖培養(yǎng)基，及10 μL CCK-8試劑并在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 納米流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比一鍋法和擠出法的DOX裝載效率 納米流式細(xì)胞儀是一種能夠檢測(cè)納米級(jí)別顆粒（30～200 nm）的新型檢測(cè)手段，可以區(qū)分出無熒光的CLPs 和有熒光的CLPs-DOX，并有效排除游離DOX 的影響。在同樣的DOX 濃度下（圖1A），一鍋法比擠出法的裝載效率高（70.8%），后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇一鍋法合成具有治療與成像效果的CLPs-DOX。

2.2 DOX 轉(zhuǎn)載入CLPs 的條件優(yōu)化及驗(yàn)證 對(duì)DOX 轉(zhuǎn)載入CLPs 的濃度進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果表明（圖1B）熒光響應(yīng)值與DOX 裝載量相關(guān)，隨著DOX濃度的升高，熒光響應(yīng)值逐漸增大，當(dāng)DOX 濃度達(dá)到150 nmol/L 時(shí)，裝載量達(dá)到飽和。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均用150 nmol/L DOX 合成CLPs-DOX。且CLPs-DOX 治療平臺(tái)在熒光發(fā)射光譜上與DOX 相一致（圖1C），CLPs-DOX 應(yīng)用于癌細(xì)胞成像時(shí)，無需重新選取熒光發(fā)射光譜。此外，CLPs-DOX 被Triton X-100 裂解前后的熒光響應(yīng)值增加（圖1D），說明CLPs 裝載DOX 后會(huì)減弱DOX 的熒光值，當(dāng)CLPs-DOX 被Triton X-100 裂解后，DOX 從CLPs 中 釋放導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了DOX 已成功裝載入CLPs 中。

圖1 CLPs-DOX 合成條件優(yōu)化及性能驗(yàn)證Fig.1 Optimization of CLPs-DOX synthesis conditions and performance verification

2.3 CLPs-DOX與CLPs表征 圖2A表示CLPs粒徑集中在85 nm處，CLPs-DOX 粒徑集中在81 nm 和118 nm 處，且CLPs 在裝載前后表現(xiàn)出良好的粒徑分布，大小處于200 nm 之內(nèi)。且CLPs-DOX 相比CLPs 電位降低（圖2B）。對(duì)CLPs-DOX 與CLPs 的粒徑變化持續(xù)監(jiān)測(cè)10 d，顯示穩(wěn)定性良好（圖2C）。

2.4 CLPs-DOX 的體外治療效果 CCK-8 檢測(cè)法是用于測(cè)量活細(xì)胞數(shù)量的高靈敏度方法，能夠反應(yīng)CLPs-DOX 的細(xì)胞殺傷能力。圖2D 表示通過對(duì)不同濃度DOX 的熒光檢測(cè)得到DOX 標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出與CLPs-DOX 同等的DOX 濃度。圖3 中CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的活性隨DOX、CLPs-DOX 濃度的升高而降低，當(dāng)CLPs-DOX 數(shù)量為1 × 108個(gè)時(shí)，細(xì)胞死亡率達(dá)80%，近似于DOX 的殺傷效率，證明了CLPs-DOX在體外對(duì)于細(xì)胞的毒性殺傷能力和DOX 可比性高，DOX 包裹進(jìn)脂質(zhì)體內(nèi)沒有減弱其細(xì)胞毒性能力。

圖2 CLPs 和CLPs-DOX 表征Fig.2 Characterization of CLPs and CLPs-DOX

圖3 MDA-MB-231 細(xì)胞與不同濃度CLPs、DOX、CLPs-DOX 孵育后的細(xì)胞活性Fig.3 Cell viability of MDA-MB-231 cells after incubation with different concentrations of CLPs，DOX and CLPs-DOX

2.5 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證CLPs-DOX的癌細(xì)胞成像效果，將適量的乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞接種共聚焦皿中，分別加入1 × 1010個(gè)CLPs、CLPs-DOX和對(duì)應(yīng)濃度的DOX，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

圖4 表示使用共聚焦顯微鏡對(duì)所處理細(xì)胞的觀察結(jié)果：對(duì)照組PBS 和CLPs 皆無熒光，而實(shí)驗(yàn)組DOX 和CLPs-DOX 中呈現(xiàn)出強(qiáng)熒光，說明細(xì)胞內(nèi)的熒光來自于DOX，CLPs-DOX 能夠較好地進(jìn)入細(xì)胞當(dāng)中發(fā)揮細(xì)胞成像作用。

圖4 不同處理組的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig.4 Confocal microscopy observation results of different treatment groups

圖5 表示共聚焦顯微鏡分析軟件ZEN 查看熒光圖片的算數(shù)熒光強(qiáng)度，由圖可知，DOX、CLPs-DOX 在細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度分別為8.37 和9.62（a.u.）。DOX 裝載入CLPs 后熒光信號(hào)變強(qiáng)，可以說明DOX 裝載入CLPs 后進(jìn)入細(xì)胞的能力更強(qiáng)，具有更優(yōu)的成像效果。

圖5 MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度Fig.5 Average fluorescence intensity of MDA-MB-231 cells

3 結(jié)論

目前臨床腫瘤藥物治療具有毒副作用較大，治療效果難以及時(shí)評(píng)估等缺陷，其中納米技術(shù)的診療一體化通過將納米材料遞送至腫瘤部位，并指示腫瘤病灶，在抗腫瘤診療中有較大的發(fā)展前景。本研究采用一鍋法合成的CLPs-DOX，粒徑均一在200 nm 以內(nèi)，穩(wěn)定性良好，藥物裝載效率高。并在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證其負(fù)載DOX 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行熒光標(biāo)記的可行性。由于脂質(zhì)體表面陽(yáng)離子電荷使CLPs-DOX 具有更高的細(xì)胞內(nèi)化效率，可有效發(fā)揮抗腫瘤效果。CLPs-DOX 作為乳腺癌細(xì)胞診療一體化平臺(tái)其優(yōu)勢(shì)如下：（1）CLPs 膜融合作用效果顯著，增強(qiáng)藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率，提高病灶藥物濃度；（2）癌細(xì)胞常處于組織深部，游離化療藥物難以到達(dá)，CLPs-DOX 可通過癌細(xì)胞誘導(dǎo)形成的血管間隙聚集在病灶，同時(shí)減輕高濃度游離藥物引起的不良反應(yīng)；（3）能夠通過成像技術(shù)分析載藥體系與腫瘤細(xì)胞的相互作用，監(jiān)測(cè)藥物治療過程和反饋藥物治療效果［8］；（4）體內(nèi)可被生物降解，免疫原性小。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，用脂質(zhì)體載DOX 治療的小鼠腫瘤在實(shí)驗(yàn)過程中體積遞減，與對(duì)照組相比具有顯著性差異［9］。此外，游離DOX 注入荷瘤小鼠中，體外成像可見其熒光強(qiáng)度隨時(shí)間不規(guī)則地變化，然后分散到其他組織或代謝后排泄，而載DOX 納米膠束在腫瘤中的積累大于游離DOX［10］，因此CLPs-DOX 有望成為極具潛力的腫瘤診療一體化平臺(tái)。

然而，由于本實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體，作為腫瘤診療一體化方案缺乏腫瘤靶向性。因此可通過工程化改造的方法對(duì)CLPs-DOX進(jìn)行修飾和改造，以達(dá)到更精準(zhǔn)靶向治療診斷的效果。例如，cRGD 環(huán)肽具有靶向惡性腫瘤細(xì)胞的作用［11］，將cRGD 修飾在納米顆粒表面可增加載藥納米顆粒的靶向性［12-13］。透明質(zhì)酸與其受體CD44具有較強(qiáng)的結(jié)合效應(yīng)［14］，CD44 較多表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞表面，有文獻(xiàn)報(bào)道，通過在納米載藥顆粒表面修飾透明質(zhì)酸具有靶向腫瘤部位的作用［14-16］，因此，理論上cRGD 或透明質(zhì)酸修飾的CLPs-DOX 也具有靶向腫瘤細(xì)胞的效果。除了對(duì)CLPs-DOX 的修飾，也可對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行進(jìn)一步的改造。目前pH敏感載藥脂質(zhì)體也已有較多的研究［17-18］，腫瘤細(xì)胞由于代謝旺盛，腫瘤微環(huán)境為酸性環(huán)境，pH 敏感載藥脂質(zhì)體在到達(dá)腫瘤細(xì)胞酸性環(huán)境中后發(fā)生相變，釋放內(nèi)部裝載藥物，也可以達(dá)到靶向腫瘤治療的效果。此外，脂質(zhì)體雜交腫瘤細(xì)胞外泌體也是改善腫瘤靶向性的策略之一［19-20］。腫瘤細(xì)胞來源外泌體作為腫瘤細(xì)胞釋放的脂質(zhì)納米囊泡，繼承了腫瘤細(xì)胞的部分膜表面蛋白，不僅可以發(fā)揮免疫逃避的作用，也具有攜帶納米抗腫瘤藥物歸巢的效果，通過將CLPs-DOX 與腫瘤外泌體融合，可提高細(xì)胞傳遞效率。以上方案均為CLPs-DOX修飾和改造后，提高腫瘤靶向診療效率提供借鑒和理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究構(gòu)建了CLPs-DOX 診療一體化平臺(tái)，證實(shí)其在體外乳腺癌腫瘤細(xì)胞成像，及抗乳腺癌治療的可行性，為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用CLPs-DOX 腫瘤診療一體化提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為腫瘤精準(zhǔn)診療提供發(fā)展新方向。