陸大鵬，蔡秋萍

（湛江市食品藥品檢驗所，廣東湛江 524000）

固相微萃?。⊿olid-phase Microextraction，SPME）法已被廣泛用于萃取食品中的揮發(fā)性成分[1]。根據(jù)該方法的工作原理，通常認(rèn)為對試驗結(jié)果影響較大的萃取參數(shù)是萃取涂層、萃取溫度、萃取時間等[2-3]。同時，氣相色譜（Gas Chromatography，GC）儀器端的條件也直接影響著分析的效果和萃取涂層的使用壽命，大多數(shù)學(xué)者采用兩段升溫程序進(jìn)行分離，分離化合物較聚集[4-5]。為獲得更優(yōu)的SPME的萃取效果及分析效果，需對SPME的萃取參數(shù)和解吸分析參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。本文以鮮牡蠣為試驗材料，建立牡蠣揮發(fā)性成分的分析方法，通過研究頂空固相微萃?。℉eadspace Solid-phase Microextraction，HS-SPME）萃取效果的主要影響因素及優(yōu)化GC的儀器使用條件，建立萃取效率高、分析結(jié)果準(zhǔn)確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

近江牡蠣（Ostrea rivularis），2021年1月購于湛江市霞山區(qū)上坡塘綜合市場，平均重約20.10 g，長約6.0 cm，去殼，洗凈，瀝干，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴振蕩器（SHZ-A，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；電子天平（Qumintix 224-1CN，賽多利斯科學(xué)有限公司）；手動固相微萃取裝置（美國Supelco公司）；萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和 100 μm PDMS，美國Supelco公司）；多樣品均質(zhì)系統(tǒng)（GHS-66北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；凝膠色譜-氣質(zhì)聯(lián)用儀（GPC/GCMS-QP2010，日本島津）；分析天平（ME203E梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 鮮牡蠣預(yù)處理

開殼取鮮牡蠣肉，牡蠣肉洗凈泥沙后勻漿，備用。

1.3.2 HS-SPME萃取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的牡蠣勻漿液置于20 mL的頂空瓶中密封，萃取頭在首次使用時需250 ℃條件下老化1 h。將老化好的固相微萃取針插入樣品瓶中大約1 cm處，推出萃取頭（不要接觸到樣品，以免污染萃取頭），在設(shè)定的溫度下頂空吸附預(yù)設(shè)時間，收回萃取頭后，拔出萃取裝置，迅速插入氣相進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸60 min。

1.3.3 儀器條件

（1）氣相色譜條件。毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm，5%苯基/95%聚二甲基硅氧烷），載氣為高純氦氣（99.999%），流速為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃；柱溫：初始溫度40 ℃，恒溫1 min，以3 ℃/min的速率升到100 ℃，保持10 min，再以5 ℃/min的速率升到150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升高到250 ℃，保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊EI；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描模式：全掃描；掃描質(zhì)子范圍：35～500m/z；EI電子能量：70 eV。各組分經(jīng)過NIST17.0標(biāo)準(zhǔn)普庫檢索匹配。

1.3.4 萃取和解吸條件參數(shù)的優(yōu)化

SPME法提取牡蠣中的揮發(fā)性成分的影響因素有萃取頭、萃取溫度、萃取時間、樣品量和解吸溫度，按照1.3.2和1.3.3的操作方法和儀器條件，通過試驗優(yōu)化以上條件參數(shù)，確定合適的萃取頭和最佳的萃取溫度、時間、樣品量及解吸溫度。

（1）萃取頭的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，選用4種不同規(guī)格萃取頭，50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和 100 μm PDMS 進(jìn)行加熱萃取，萃取溫度為60 ℃，萃取時間為50 min，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）上機(jī)分析。

（2）萃取溫度的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃溫度下萃取40 min，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

（3）萃取時間的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取時間分別為 30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，然后上機(jī)解吸分析，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

（4）稱樣量的選擇。分別稱取牡蠣樣品1 g、2 g、3 g、4 g、5 g和6 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取40 min，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

（5）解吸溫度的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取40 min，設(shè)置進(jìn)樣口溫度分別為150 ℃、200 ℃、250 ℃和300 ℃解吸，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的確定

萃取頭的萃取材料及涂層厚度對分析物的固相吸附量和平衡時間都有影響[6]。應(yīng)綜合以上因素選擇合適的涂層材料和厚度，萃取頭的優(yōu)化試驗結(jié)果見圖1。4種萃取頭中，萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分總峰面積較大的萃取頭規(guī)格是75 μm CAR/PDMS和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取總峰面積最小的是100 μm PDMS規(guī)格萃取頭。雖然理論上膜厚度大的萃取頭吸附容量大，但試驗結(jié)果表明吸附容量大不代表萃取得到的總峰面積大，原因是牡蠣中的揮發(fā)性成分復(fù)雜，萃取頭的固定相具有選擇性，100 μm PDMS規(guī)格萃取頭是單一的固定相，不適合用于萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分。

圖1 不同萃取頭對牡蠣萃取效果的影響

僅從總峰面積評價萃取頭的吸附效果不全面，總峰面積能表明萃取頭吸附較充分，但可能是對牡蠣中的一種揮發(fā)性成分或其中的幾種成分有強吸附作用，吸附的揮發(fā)性成分種類可能不全。因此，需評價峰數(shù)量指標(biāo)。萃取峰數(shù)量最多的萃取頭規(guī)格為50/30 μm DVB/CAR/PDMS， 其 次 是 規(guī) 格 為 65 μmPDMS/DVB的萃取頭，峰數(shù)量越多表明吸附的揮發(fā)性成分種類越多，吸附的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量與萃取頭的固定相有關(guān)，規(guī)格為50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭為3種復(fù)合固定相，比另外3種規(guī)格的固定相復(fù)合度高，用該規(guī)格萃取頭萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分峰數(shù)量最多。結(jié)合總峰面積和峰數(shù)量綜合評價萃取頭，適合萃取牡蠣中揮發(fā)性成分的萃取頭規(guī)格為 50/30 μm DVB/CAR/PDMS。

2.2 萃取溫度的確定

萃取溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素，選取合適的萃取溫度，有利于萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分。萃取溫度的優(yōu)化試驗結(jié)果見圖2。用萃取頭規(guī)格為50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分，萃取的總峰面積隨萃取溫度的升高整體呈先增加后減少的趨勢，在70 ℃達(dá)到頂峰值；峰數(shù)量隨溫度的升高呈先增加后減少再增加的趨勢。在熱作用下，分子間的熱運動隨溫度的升高越來越激烈，當(dāng)揮發(fā)性成分和涂層固定相間的分配系數(shù)達(dá)到最高，萃取效果達(dá)到最高水平，且溫度繼續(xù)升高，熱運動加劇，導(dǎo)致分配系數(shù)減少，萃取量反而減少，因此70 ℃的總峰面積比80 ℃大。此外，溫度過高易導(dǎo)致基質(zhì)中化合物發(fā)生化學(xué)變化，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分發(fā)生變化，不利于樣品真實成分的檢測。因此，需選取萃取效果較佳且盡量保持樣品真實性的的萃取溫度，綜合考慮，確定60 ℃為較佳萃取溫度。

圖2 不同萃取溫度對牡蠣萃取效果的影響

2.3 萃取時間的確定

萃取時間主要是指萃取達(dá)到或接近平衡所需要的時間，長時間的溫?zé)釛l件下，可能產(chǎn)生不利的影響，如微生物的反應(yīng)、化合物間的反應(yīng)等[7]。因此，試驗需選取合適的萃取時間，萃取時間的優(yōu)化試驗結(jié)果如圖3。

圖3 不同萃取時間對牡蠣萃取效果的影響

在同等萃取條件下，萃取的總峰面積和峰數(shù)量在60 min時達(dá)到最高，之后萃取的總峰面積和峰數(shù)量出現(xiàn)小幅度的先下降后升高的變化。在萃取開始時，萃取頭中固定相中物質(zhì)的量增加較快，當(dāng)接近萃取平衡時，萃取的速度下降。但隨著萃取時間的延長，加熱可能會促進(jìn)基質(zhì)中化合物的反應(yīng)，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分發(fā)生變化，萃取涂層的分配系數(shù)發(fā)生變化，因此70 min和80 min時的萃取效果不一致。為保證樣品的穩(wěn)定性和試驗結(jié)果具有良好的萃取效果，綜合考慮，確定60 min為較佳萃取時間。

2.4 稱樣量的確定

稱樣量對萃取效果產(chǎn)生的影響主要來源于樣品量對頂空體積的影響，樣品量間接影響樣品的萃取效果，因此選取合適的稱樣量有利于提升萃取的效果。稱樣量的優(yōu)化試驗結(jié)果見圖4?？偡迕娣e的整體結(jié)果呈先上升后下降的趨勢。樣品量對萃取效果的影響明顯，樣品量太少時，幾乎無法萃取到樣品中的揮發(fā)性成分。此外，頂空體積的變化對萃取效果有一定的影響，樣品量大于1 g時，揮發(fā)性成分的總峰面積整體呈先上升后下降的趨勢，但峰數(shù)量總體呈下降趨勢，樣品量增多的同時，頂空體積減少，頂空基質(zhì)的壓力升高，導(dǎo)致某些揮發(fā)性成分的萃取分配系數(shù)增大，同時部分物質(zhì)萃取分配系數(shù)降低，導(dǎo)致萃取的物質(zhì)數(shù)量與物質(zhì)的量不同步。因此，為獲得更多揮發(fā)性成分的信息，應(yīng)以峰數(shù)量為指標(biāo)，同時參考總峰面積選取最佳樣品量。綜合考慮，樣品量為2 g和3 g時，牡蠣萃取效果較好，因此確定2.5 g為較佳樣品稱樣量。

圖4 不同稱樣量對牡蠣萃取效果的影響

2.5 解吸溫度的確定

解吸溫度為氣相進(jìn)樣口的溫度，其決定樣品是否能被全部氣化解吸進(jìn)樣，從而影響樣品分析的結(jié)果。溫度過高會導(dǎo)致易分解組分分解，分析結(jié)果出現(xiàn)失真情況。因此，須選擇合適的進(jìn)樣口分析溫度，進(jìn)樣口溫度的優(yōu)化試驗結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 不同進(jìn)樣口溫度對牡蠣分析效果的影響

圖6 不同解析溫度含硅化合物的響應(yīng)值比例及含硅化合物的峰數(shù)量

進(jìn)樣口溫度對化合物的分析效果影響較大?？偡迕娣e隨進(jìn)樣口溫度的上升呈先上升后下降的趨勢，但化合物的峰數(shù)量一直呈增加的趨勢。在150 ℃和200 ℃時，牡蠣中的揮發(fā)性成分呈遞增趨勢被解析進(jìn)行分析。但250 ℃時，分析的化合物的總峰面積下降，300 ℃時更低，但此時的峰數(shù)量仍在增加，可能是由于高于250 ℃熱解吸下的化合物被分解，進(jìn)樣口溫度過高導(dǎo)致化合物氣化殘留在進(jìn)樣口周圍未能進(jìn)入色譜柱檢測。因此，對牡蠣中揮發(fā)性成分的分析檢測，進(jìn)樣口的溫度不是越高越好，合適的進(jìn)樣口溫度能保證結(jié)果分析的有效性。此外，試驗中發(fā)現(xiàn)解吸過程中，分析物中含硅化合物的含量增多，高溫加熱后，會將萃取頭涂層中的含硅固定相熱解吸下來，影響萃取頭的使用壽命。

圖6的結(jié)果顯示，含硅化合物峰面積的比例和含硅化合物的峰數(shù)量隨進(jìn)樣口溫度的升高而升高，且兩者增幅趨勢幾乎同步。高溫?zé)峤馕鼘滔辔⑤腿☆^同樣也有解吸作用，過高溫度下萃取頭上的固定材料氣化的量增多，從而縮短該固相萃取頭的使用壽命，甚至?xí)绊懺撦腿☆^下一次萃取的效果。綜上所述，200 ℃下，牡蠣的揮發(fā)性成分的分析結(jié)果較為真實有效，且此溫度下對固相微萃取頭的使用壽命較為友好，因此選取進(jìn)樣口為200 ℃為GC進(jìn)樣口解吸溫度。

3 結(jié)論

頂空固相微萃取的萃取條件對萃取效果有明顯的影響，通過優(yōu)化萃取頭、萃取溫度、萃取時間、樣品量和解吸溫度參數(shù)，得到HS-SPME對牡蠣樣品萃取的最佳萃取參數(shù)為50/30 μm DVB/CAR/PDMS規(guī)格的萃取頭，牡蠣樣品稱樣量為2.5 g，萃取溫度60 ℃，萃取時間為60 min，解吸溫度為200 ℃。此研究為提高鮮牡蠣的市場價值、使用價值提供理論依據(jù)。