胡騫予，蔡永占 ，韓小女，符宗偉，劉 舜，楊祖恒，雷 蕾，陳小龍，方 宇，余 磊，黃飛燕

（1.昆明學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；2. 云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；3. 云南省宣威市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 宣威 655400；4.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司原料采購中心，河南 鄭州 450000）

0 引言

【研究意義】煙草黑脛病(Tobacco Black Shank)是由煙草疫霉菌(Phytophthora nicotianae )引起的真菌性土傳病害[1]。其病原菌為卵菌門（Oomycota），游動孢子從莖基部侵入煙株，然后擴(kuò)散至維管束，導(dǎo)致煙株莖基部壞死甚至煙株死亡[2?3]。黑脛病在煙株各個生育期均能發(fā)生[4]，一旦爆發(fā)流行，往往造成煙株大面積死亡，對煙草生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是嚴(yán)重制約煙草產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重病害[5]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[6]，參與植株與土壤環(huán)境之間養(yǎng)分循環(huán)，能量交換。黑脛病作為土傳性真菌病害，煙株感染后勢必會影響煙株根際土壤微生物群落的變化?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，隨著土壤微生物研究的不斷深入，根際土壤微生物與植物病害之間關(guān)系的研究亦引起了高度重視。煙株感病后，根際微生態(tài)細(xì)菌群落的功能會受到破壞，不利于維持種群平衡，易導(dǎo)致土傳病害的發(fā)生[7]，同時病原菌在易感病煙田中的相對豐度較高，不同發(fā)病程度煙株根際主要環(huán)境因子差異中，土壤酶活性受到不同程度抑制，細(xì)菌群落組成發(fā)生改變，土壤微生物多樣性降低[8]。前人的研究著重于土壤理化性質(zhì)、微生物數(shù)量的變化以及各種防治措施對煙草土傳病害的影響[9]，而通過調(diào)節(jié)煙田根際土壤微生態(tài)環(huán)境來抑制煙田土傳病害的發(fā)生已成為研究的熱點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】健康與感染黑脛病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性有待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)分析健康煙株和感染黑脛病煙株根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，探究黑脛病對煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，探討根際土壤細(xì)菌對黑脛病的生態(tài)作用機(jī)理，以期為煙草黑脛病的生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019 年7 月于云南省曲靖市宣威熱水關(guān)營試驗(yàn)地進(jìn)行樣品采集，品種為云煙100。在煙株旺長期隨機(jī)選取3 株煙草黑脛病發(fā)病嚴(yán)重的煙株和3 株健康煙株，去除煙株周圍地表土壤，將煙株連根拔起，去除煙株根系主土壤，收集根須2 mm 范圍土壤根際土。健康煙株根際土（ZCTY）編號為H1、H2、H3；感染黑脛病煙株根際土（HJTY）編號為P1、P2、P3。去除根系及其他雜物，分裝于50 mL 離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于?80 ℃中冷凍保存，待用。

1.2 樣品DNA 提取

參照PowerSoil?DNA 土壤基因組DNA 提取試劑盒，對健康煙株和感黑脛病煙株根際土壤進(jìn)行DNA 的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量。用 無 菌 水 將DNA 稀 釋 至1 ng·μL?1作 為 模 板，選用特異性引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增16S rRNA 基因的V3~V4 可變區(qū)，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性，95 ℃ 3 min；變性，95 ℃ 30 s，36 個循環(huán)（退火，55 ℃ 30 s；延伸，72 ℃ 45 s）再延伸72 ℃10 min。擴(kuò)增體系為 20 μL：4 μL 5×FastPfu 緩沖液；2 μL 2.5 mmol·L?1dNTPs；0.8 μL Forward Primer (5 μmol·L?1)；0.8 μL Reverse Primer (5 μmol·L?1)；0.4 μL FastPfu 聚合酶；0.2 μL BSA；10 ng DNA 模板；加ddH2O 至 20 μL。使用 2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產(chǎn)物，利 用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen,USA) 試劑盒進(jìn)一步純化回收后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行 MiSeq 測序。

1.3 下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控與分析

剔除下機(jī)數(shù)據(jù)中的標(biāo)簽及引物序列，進(jìn)行序列拼接得到原始數(shù)據(jù)；使用Usearch 軟件(Version 7.0)進(jìn)行過濾、去嵌合體序列得到有效序列；利用Mothur軟件(version v.1.30.1)繪制稀釋度曲線，計算文庫覆蓋率、Chao1、ACE、Shannon、Simpson 指數(shù)，對根際土壤微生物群落中的物種多樣性和豐富度進(jìn)行評價；利用Uparse 軟件在97%相似性水平上進(jìn)行OTUs聚類分析；利用RDP classifier 軟件和SILVA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，使用Qiime 軟件進(jìn)行主成分分析，并利用R 語言進(jìn)行繪圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序深度分析

稀釋曲線（Rarefaction curve）既反映了不同測序數(shù)據(jù)量下各樣品中的物種豐度，又可以表示測序深度是否覆蓋了一個環(huán)境樣品中的所有測序?qū)ο?。由圖1 稀釋曲線可知本次測序樣品的曲線斜率逐漸變小，但最終未進(jìn)入到平臺期，表明隨著序列數(shù)的不斷增加，不會產(chǎn)生過多新的OTU 數(shù)。說明此次測序結(jié)果能夠較全面地反映根際土壤樣品細(xì)菌群落與結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況。

圖1 細(xì)菌物種豐富度稀釋曲線Fig. 1 Dilution curve of bacterial species richness

2.2 細(xì)菌的OTU 豐度與Alpha 多樣性

由圖2 可見，健康煙株根際土壤樣本（ZCTY）與感染黑脛病煙株根際土壤樣本（HJTY）共有和特有OTU 所占比例。健康煙株根際土樣和感染黑脛病煙株根際土樣兩組土壤樣本中，共有OTUs 數(shù)3182個。其中，健康煙株根際土樣中特有OTU 有1518個，占總OTU 數(shù)的24.59%；感染黑脛病煙株根際土樣中特有OTU 有1471 個，占總OTU 數(shù)的23.84%；健康煙株根際土樣中特有OTU 豐度高于感染黑脛病煙株根際土樣3%。

圖2 細(xì)菌OTU 分布venn 圖Fig. 2 Venn diagram on fungi identified

由表1 可知ZCTY 和HJTY 的coverage 值均在96%以上，說明樣本序列的檢測概率較高，能夠較全面地反映樣本土壤細(xì)菌群落的真實(shí)分布情況。在Alpha豐富度指標(biāo)中ACE、Chao1 數(shù)值越大說明生物豐度越高， HJTY 的ACE、 Chao1 數(shù) 值 低 于ZCTY 數(shù) 值?21.29%、15.23%，表明感染黑脛病煙株的根際土壤細(xì)菌豐度低于健康煙株根際土壤。在Alpha 多樣性指標(biāo)中Shannon 數(shù)值越高，Simpson 數(shù)值越低，表明樣本生物多樣性指數(shù)越高。ZCTY 的Shannon 數(shù)值高于HJTY 數(shù)值3.05%，ZCTY 的Simpson 數(shù)值低于HJTY數(shù)值9.09%。表明健康煙株的根際土壤細(xì)菌多樣性高于感染黑脛病的煙株。Alpha 多樣性指標(biāo)表明感染黑脛病煙株根際土壤細(xì)菌豐度及多樣性均低于健康煙株根際土壤。

表 1 健康與感染黑脛病煙株根際土壤微細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 1 Microbial diversity indices of rhizosphere soils at tobacco lots infected with black shank disease

2.3 健康與感染黑脛病煙株根際土壤細(xì)菌組成分析

門水平樣品菌落相對豐度堆積圖（圖3）表明：ZCTY 中相對豐度大于1.00%的優(yōu)勢細(xì)菌門分類數(shù)量為9 個：放線菌門(Actinobacteria，35.57%) ＞變形菌門(Proteobacteria，20.14%)＞綠彎菌門(Chloroflflexi，15.40%)＞酸桿菌門(Acidobacteria，11.72%)＞芽單胞菌 門 (Gemmatimonadetes， 5.77%)＞粘 球 菌 門（Myxococcota， 2.65%）＞厚 壁 菌 門 (Firmicutes，2.40%)＞擬桿菌門(Bacteroidota，2.08%)＞硝化螺旋菌門(Nitrospirae，1.14%)；與HJTY 優(yōu)勢細(xì)菌門分類組成比例存在一定差異，其中，綠彎菌門（Chloroflflexi）、芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、 厚 壁 菌 門（Firmicutes）、Methylomirabilota 相 對 豐 度 有 所 增加，分別增加了6.04%、7.79%、34.17%、117.19%。HJTY 中 放 線 菌 門（Actinobacteria）、 變 形 菌 門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、粘球菌門（Myxococcota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）相對豐度分別減少0.73%、5.76%、3.50%、20.38%、59.13%、16.67%。

圖3 門水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structure of bacterial community at phylum level

由圖4 可知，健康煙株土壤樣本中，相對豐度大于4%優(yōu)勢菌屬有Nocardioides （4.99%）、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales（4.50%）；感染黑脛病煙株根際土壤樣本中相對豐度大于4%優(yōu)勢菌屬有norank_f__norank_o__Gaiellales（5.39%）、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales（4.71%）、norank_f__Gemmatimonadaceae（4.31） ；而在健康煙株根際土壤中為優(yōu)勢菌屬的類諾卡氏菌屬（Nocardioides, 4.99%），在感染黑脛病煙株中并未檢測到。在感染黑脛病煙株根際土壤中Gaiella、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）相對豐度分別下降5.52%、23.05%，且此二種菌屬皆為放線菌綱。

圖4 屬水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of bacterial community at genus level

圖5 熱圖上部樣本層級聚類樹表明，健康煙株根際土與感染黑脛病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性存在差異。根據(jù)熱圖所示：P1、H1、H2 聚為一類，H3、P2、P3 聚為一類。其中發(fā)病煙株根際土樣P1 與其余樣本間差異最大，與P2、P3 的差異主要集中在類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、norank_f__Xanthobacteraceae、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、天藍(lán)色鏈霉菌屬（Streptomyces）5個屬。

圖5 屬水平上細(xì)菌群落分布熱圖Fig. 5 Heat map of bacterial community distribution at genus level

在OTU 水平上對健康煙株土壤樣本和感染黑脛病煙株土壤樣本進(jìn)行PCoA 分析。結(jié)果如圖6 所示，PC1、PC2 對樣品差異的解釋度分別為63.43%和17.73%，兩者總計可解釋全部土壤樣品的71.16%，其中PC1 是兩處理產(chǎn)生差異的主要因素，從圖中可以看出PC2 能夠?qū)CTY 和HJTY 區(qū)分開，其中ZCTY樣品主要分布在PC2 的正值區(qū)域，而HJTY 主要分布在負(fù)值區(qū)域，闡明ZCTY 與HJTY 微生物群落組成存在較大差異。

圖6 細(xì)菌OTU 水平樣品PCoA 分析Fig. 6 PCoA analysis on bacterial OTU levels

3 討論

高通量測序技術(shù)能夠揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息[10]，而土壤微生物群落組成在一定程度上反映了土壤健康狀況，當(dāng)土壤中病原微生物大量生長，有益微生物數(shù)量減少時，常引起作物病害的發(fā)生[11]。土壤微生物群落變化是影響植物土傳病害中最重要的因子[12,13]，在控制植物土傳病害中的重要性已經(jīng)得到了研究人員的廣泛認(rèn)可。部分土壤微生物具有拮抗土壤病原菌的功能[14]，對抑制病原體入侵或在根部組織間的二次傳播具有重要作用。土壤細(xì)菌不僅能夠快速、高效地分解與轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)[15]、影響植物對養(yǎng)分的獲取和土壤肥力，而且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異和變化規(guī)律能反映土壤現(xiàn)狀及變化趨勢，可用來指示土壤生態(tài)功能[16]。

測序結(jié)果表明，感染黑脛病煙株煙株根際土壤的Shannon、ACE 和Chao1 指數(shù)分別較健康植株降低了3.05%、21.29%、15.23%。煙株感染黑脛病后根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性及豐富度均有顯著下降。在門水平上，感染黑脛病煙株與健康煙株根際土壤共同優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門，此結(jié)果與向立剛等[17]健康與感染黑脛病煙株根際土壤與莖稈細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，以及王秋君等[18]通過調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)控制辣椒疫病與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相一致。其中放線菌門在健康與感染黑脛病煙株根際土壤中的相對豐度無明顯差異。與健康煙株根際土壤相比，感染黑脛病煙株根際土壤中變形菌門和酸桿菌門相對豐度分別下降5.76%、3.50%；變形菌門和酸桿菌門對土壤生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)建具有重要作用，二者均屬于化能異養(yǎng)細(xì)菌[19]，以土壤中的有機(jī)物質(zhì)作為碳源和能源，其相對豐度的變化通常與土壤肥力水平的變化呈正相關(guān)[20,21]。綠彎菌門和芽單胞菌門相對豐度分別增長6.04%、7.79%，而綠彎菌門和芽單胞菌門都有很強(qiáng)的能力支持基本的生物過程，對于惡劣的環(huán)境的抗性較強(qiáng)，且綠彎菌門在酸化土壤中的相對豐度較高[22]。擬桿菌門、硝化螺旋菌門相對豐度從大于1%下降至1%以下。結(jié)果表明，煙株感染黑脛病后根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暗示在生境惡劣的情況下寡營養(yǎng)細(xì)菌將代替部分富營養(yǎng)細(xì)菌維持土壤細(xì)菌的基本生態(tài)功能[23]。

屬水平上，節(jié)桿菌屬、Gaiella 屬在感染黑脛病土樣中相對豐度均有所降低，而且此二種屬均屬于放線菌綱。本次研究與前人研究結(jié)果一致，但也存在差異，健康與感染黑脛病煙株根際土壤中屬水平的差異還體現(xiàn)在類諾卡氏菌屬、慢生根瘤菌屬、天藍(lán)色鏈霉菌屬。類諾卡氏屬在感染黑脛病煙株根際土壤中未檢出，其在降解有機(jī)污染物在污染區(qū)域的生物修復(fù)中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步說明煙株感染黑脛病會導(dǎo)致其根際土壤生態(tài)失衡，但類諾卡氏屬對煙草疫霉是否存在相互作用及其作用機(jī)理有待進(jìn)一步 研究。

4 結(jié)論

本研究通過高通量測序分析闡明了健康及感染黑脛病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，為煙草黑脛病生物防治提供理論基礎(chǔ)。此外，本研究為煙株感染黑脛病旺長期的調(diào)查分析，尚缺乏對煙株其他生育期細(xì)菌多樣性的分析，有待進(jìn)一步探討。