賀椿媛， 梁金環(huán)， 王 翠， 徐 倩

(滄州醫(yī)學高等?？茖W校基礎醫(yī)學部生物化學教研室， 河北 滄州 061000)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)是內分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，包括分化型甲狀腺癌(乳頭狀癌、濾泡狀癌)、甲狀腺未分化癌和甲狀腺髓樣癌[1]。近年來，其發(fā)病率逐漸升高，且女性患者居多；臨床治療方法仍以手術治療為主，放、化療為輔的綜合模式治療，但晚期分化型、未分化型甲狀腺癌對臨床常用的放化療治療敏感度較差，且對患者的生存率并無明顯提高[2]，故尋找更佳的治療手段為臨床研究的重點。硼替佐米(Bortezomib)是一種蛋白酶體抑制劑，在治療難治性或復發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤以及某些實體腫瘤中具有令人矚目的療效[3]，最近，一項局部晚期或轉移性甲狀腺髓樣癌的臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗研究顯示，硼替佐米在治療中具有安全性和耐受性好的特點[4]；體外研究也顯示硼替佐米可誘導TC細胞凋亡[5]，是尚無確定治療方案的TC患者的一種有前途的治療方法。然而，關于硼替佐米在甲狀腺癌中的作用的報道很少。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的激活與甲狀腺腫瘤細胞凋亡和細胞周期停滯密切相關[6,7]，而硼替佐米可誘導AMPK激活，進而誘導骨髓瘤細胞、人結腸癌細胞凋亡和自噬[8,9]；硼替佐米對TC細胞凋亡的誘導作用是否與AMPK/mTOR通路有關還未知，因此本研究以TC細胞為對象，探究硼替佐米對人TC細胞凋亡、侵襲的影響及潛在的作用機制；以明確硼替佐米的具體作用機制，從而為硼替佐米應用于甲狀腺癌治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞:人甲狀腺乳頭狀癌細胞株B-CPAP(美國ATCC)購自上海子實生物科技有限公司，貨號：os100407。在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔天換液，每2-3d傳代一次，在細胞達到指數(shù)增長期時開始實驗。

1.2主要試劑與儀器:注射用硼替佐米(萬珂，意大利BSP Pharmaceuticals SRL，分包裝：西安楊森制藥有限公司，批準文號：國藥準字J20171067)；Compound C(AMPK抑制劑，美國TargetMo，貨號：S7840)；AICAR(AMPK激活劑，碧云天生物科技公司，貨號：S1515)；胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；人工重構基底膜膠(Matrigel)(美國BD公司，貨號：356234)；Transwell小室(美國Corning公司，貨號：3413)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司；AMPK(ab32047)、p-AMPK(ab133448)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab109268)、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)(ab2606)、p-4EBP1(ab278686)、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)(ab196495)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspases-3)(ab184787)、E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)(ab133597)、β-連接素(β-catenin)(ab32572)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均購自英國abcam公司。細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；倒置熒光顯微鏡(IX73，日本Olympus公司)；多功能酶標儀(iMark680)、流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ)、蛋白轉膜裝置購自美國Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1MTT法篩選硼替佐米的實驗濃度及時間:取指數(shù)增長期的甲狀腺癌B-CPAP細胞，以2×103細胞/孔的濃度接種到96孔板中(邊緣孔用PBS填充)，待細胞貼壁并鋪滿孔底后，棄去原培養(yǎng)基，更換含低濃度(2%)血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24h后，加入含不同濃度硼替佐米(0、12.5、25、100、200nmoL/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。然后在各孔中加入5g/L MTT試劑20μL；繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清后加入150μL的DMSO；在490nm處測定各組細胞的OD值，將不含細胞的培養(yǎng)基作為空白對照組，計算細胞存活率；并采用GraphPad軟件計算硼替佐米對細胞的半數(shù)抑制濃度(the half inhibitory concentration,IC50)。細胞存活率=(實驗組OD-空白對照組OD)/(對照組OD-空白對照組OD)×100%

1.3.2流式細胞術檢測細胞凋亡:取指數(shù)增長期的甲狀腺癌B-CPAP細胞，按每孔2×106個接種于24孔板，分為對照組、AICAR組(AMPK激活劑2mmoL/L)[10]、硼替佐米(50nmoL/L)組、硼替佐米+Compound C組(硼替佐米 50nmoL/L+AMPK抑制劑Compound C 5μmoL/L)[7]；給予相應的處理后在37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)48h后，胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，EP管中加入100μL單細胞懸液，然后加入Annexin V-FITC和PI各5μL，避光孵育15min后加入1×Blinding Buffer 400μL，1h內使用流式細胞儀檢測各組B-CPAP細胞凋亡率。

1.3.3Transwell實驗檢測細胞侵襲能力:細胞按照1.3.2項下操作步驟進行分組和培養(yǎng)，取培養(yǎng)48h后的各組B-CPAP細胞，用無血清的細胞培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×104個/mL，將Matrigel膠稀釋后加到Transwell上室，風干過夜后，分別加入200μL細胞懸液(無血清)，下室加入400μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出Transwell小室，95%乙醇固定，0.1%結晶紫染液染色，ddH2O清洗小室下表面，用濕棉簽小心擦除上室底部膜表面的細胞。晾干后在顯微鏡下隨機取3個視野，拍照；取細胞穿膜數(shù)，計算平均值表示細胞侵襲能力。

1.3.4Western Blot檢測細胞凋亡、侵襲以及AMPK/mTOR/4EBP1通路相關蛋白的表達:使用RIPA裂解液提取各組細胞中蛋白質，BCA試劑盒測量上清液中的總蛋白濃度。取等量蛋白質樣品(30μg)上樣，然后在SDS-PAGE上進行電泳分離，并將其轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，并在4℃下與一抗(AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、Bcl-2、Caspases-3、E-cadherin、β-catenin、β-actin)孵育過夜。第2天，洗去一抗，加入二抗(IgG)孵育2h，然后使用化學發(fā)光試劑盒(ECL)進行顯色。以β-actin為內參，分析結果。

2 結 果

2.1硼替佐米的體外細胞實驗濃度:不同濃度的硼替佐米能不同程度的抑制B-CPAP細胞的生長，見表1；不同濃度的硼替佐米在培養(yǎng)24h時，與對照組相比，細胞存活率差異不甚明顯；不同濃度的硼替佐米在培養(yǎng)48h時，與對照組相比，細胞存活率顯著降低，硼替佐米對B-CPAP細胞的IC50為53.21nmoL/L，因此，選擇50nmoL/L的硼替佐米作用48h作為后續(xù)實驗濃度和時間。

表1 硼替佐米對B-CPAP細胞活力的影響±s，%，n=3)

2.2各組甲狀腺癌B-CPAP細胞凋亡率:與對照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組細胞凋亡率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；見圖1、表2。

圖1 各組B-CPAP細胞凋亡檢測結果

表2 各組B-CPAP細胞凋亡率的比較±s，%，n=3)

2.3各組甲狀腺癌B-CPAP細胞侵襲能力:與對照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細胞進入Transwell小室下層的數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組B-CPAP細胞進入Transwell小室下層的數(shù)量無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組B-CPAP細胞進入Transwell小室下層的數(shù)量明顯增加(P<0.05)；見圖2、表3。

圖2 各組B-CPAP細胞的侵襲能力

表3 各組B-CPAP細胞侵襲能力的比較±s，個，n=3)

2.4各組甲狀腺癌B-CPAP細胞凋亡、侵襲相關蛋白的表達:與對照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細胞Caspases-3、E-cadherin、β-catenin的表達顯著增加，Bcl-2的表達顯著降低(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組B-CPAP細胞上述蛋白表達量無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組B-CPAP細胞Caspases-3、E-cadherin、β-catenin的表達明顯降低，Bcl-2的表達明顯增加(P<0.05)；見圖3、表4。

圖3 各組甲狀腺癌B-CPAP細胞凋亡、侵襲相關蛋白的表達

表4 各組B-CPAP細胞凋亡侵襲相關蛋白的表達比較±s，個，n=3)

2.5各組甲狀腺癌B-CPAP細胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相關蛋白的表達:與對照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細胞p-AMPK/AMPK的比值顯著增加，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值顯著降低(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組B-CPAP細胞上述蛋白表達量無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組B-CPAP細胞p-AMPK/AMPK的比值明顯降低，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值明顯增加(P<0.05)；見圖4、表5。

圖4 各組甲狀腺癌B-CPAP細胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相關蛋白的表達

表5 各組B-CPAP細胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相關蛋白的表達比較±s，n=3)

3 討 論

硼替佐米是一種人工合成的雙肽基硼酸鹽二肽化合物，具有抗增殖和抗腫瘤活性，可誘導細胞周期停滯和凋亡；已被批準用于難治性/復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤的治療。羅雨等[11]發(fā)現(xiàn)硼替佐米可抑制甲狀腺未分化癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡；Tsumagari等[5]的研究表明硼替佐米和BRAF抑制劑維拉非尼聯(lián)合使用，在體外和體內均可誘導甲狀腺癌細胞生長抑制、G2期細胞周期阻滯和細胞凋亡增加，并使甲狀腺癌細胞對BRAF抑制劑敏感。E-cadherin普遍存在于各類上皮細胞中，通常與β-catenin形成E-鈣黏附蛋白/連接蛋白復合體，從而介導上皮細胞間的黏附。當E-cadherin、β-catenin表達減低或缺失會使腫瘤細胞間的黏附性減弱，易于脫離和遷移，侵入周圍組織和血管。本研究結果顯示，硼替佐米可顯著降低甲狀腺癌B-CPAP細胞的存活率和Bcl-2的表達，增加E-cadherin、β-catenin、Caspases-3的表達，促進其凋亡；與以上研究結果一致，提示硼替佐米具有抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲，促進凋亡的作用。

在甲狀腺癌的發(fā)病過程中，某些基因發(fā)生突變或移位、甲基化等異常時，會通過激活相關的信號通路導致細胞異常增殖或者凋亡，導致癌變。研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌組織中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的陽性率顯著高于癌旁正常組織，且4EBP1、S6K1為mTOR下游信號分子，在癌組織中異常表達，提示三者與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展有密切關系[12]。AMPK是細胞內能量穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)劑，除了在調節(jié)正常細胞代謝中起至關重要的作用外，越來越多的證據(jù)表明，在某些癌癥中，AMPK活性的抑制或喪失可能會增強某些腫瘤細胞生長和增殖的致癌信號通路。本研究結果顯示，在甲狀腺癌B-CPAP細胞中p-AMPK/AMPK的比值較低，而使用AMPK的激活劑AICAR可明顯增加p-AMPK/AMPK的比值，促進B-CPAP細胞凋亡。AMPK是mTOR通路的負調節(jié)劑，AMPK的活化可抑制mTOR的激活，進而抑制4EBP1磷酸化，從而抑制蛋白質合成。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)抑制AMPK/mTOR信號通路的激活，可增強甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和侵襲；而使用雙重AMPK激活劑/mTOR抑制劑可顯著抑制甲狀腺癌細胞的生長[14]。以上研究表明，AMPK的激活對抑制甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展至關重要。而硼替佐米可誘導AMPK磷酸化，并且AMPK敲低減弱了硼替佐米的保護作用，表明AMPK激活是硼替佐米作用的基礎[15]。本研究發(fā)現(xiàn)給予硼替佐米干預后，B-CPAP細胞中p-AMPK/AMPK的比值明顯增加，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值降低，而使用AMPK抑制劑Compound C可升高p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值，明顯減弱硼替佐米對甲狀腺癌B-CPAP細胞的促凋亡作用，提示硼替佐米可能通過激活AMPK，抑制mTOR和4EBP1的活化，誘導甲狀腺乳頭狀癌細胞凋亡。

綜上所述，硼替佐米可抑制人甲狀腺癌細胞增殖、侵襲，并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與激活AMPK，抑制mTOR和4EBP1的活化有關。本研究僅從體外細胞水平上初步探究了硼替佐米對人甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細胞的影響，由于體內外腫瘤微環(huán)境存在差異，尚需要進行體內動物實驗進一步明確硼替佐米對人甲狀腺癌細胞的作用；此外，在甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺未分化癌和甲狀腺髓樣癌中硼替佐米是否發(fā)揮同樣的作用，有待研究確認。