利用口腔前庭溝進行口腔微生態(tài)干預的可行性探究：以益生菌棉條為例

潘彬惠，施江敏，季夏薇，陳華森，徐昌隆

1.溫州醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027

人類口腔中存在許多微生物，成年人口腔中有500～1 000億細菌，其中占主要部分的有200多種[1]。多種口腔微生物的協(xié)同和相互作用，可以幫助人體抵御外界不良刺激的入侵[2]。當口腔微生態(tài)平衡被打破時，致病菌特別是兼性厭氧菌大量繁殖，通過直接入侵或引起免疫-炎癥反應擴散至全身循環(huán)中，導致疾病的發(fā)生。研究表明，失衡的口腔菌群不僅與齲齒[3-4]、牙周炎[5]、口腔癌癥[6]等多種口腔疾病相關，還在全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[7-10]。作為全身微生態(tài)系統(tǒng)的一份子，與身體其他部位相比，口腔中的菌群獨特且易于獲得。因此，以口腔微生態(tài)為切入點研究口腔及全身系統(tǒng)性疾病，是一種無創(chuàng)、簡單且有效的手段。

口腔前庭溝為位于唇、頰與牙列、牙齦及牙槽骨、牙弓之間的蹄鐵形的潛在腔隙，見圖1。此處溫暖潮濕，密閉性好，是口腔微生物特別是厭氧致病菌易于聚集性生長之處。利用此間隙容納異物的能力，可構建一種吸水性強、異物感弱的載體模型，該載體不僅可以對口腔原生態(tài)菌液進行提取，研究口腔微生態(tài)及相關代謝產(chǎn)物的構成，并且可以通過該載體人工干預口腔原生態(tài)環(huán)境。目前臨床上通過干預口腔原生態(tài)環(huán)境影響口腔健康及系統(tǒng)相關性疾病的研究尚不完善，通過口腔前庭溝干預口腔菌群的工作鮮見報道。本研究以口腔前庭溝的利用為切入點，探討干預口腔微生態(tài)的方法，以期為口腔保健及全身系統(tǒng)相關疾病研究提供一種新的思路。

圖1 口腔前庭溝示意圖

1 對象和方法

1.1 材料 無菌棉條購自南昌恩惠醫(yī)用衛(wèi)生材料有限公司，無菌凍存管購自美國Corning公司，唾液采集器購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，凍干菌粉購自上海奕農(nóng)生物科技有限公司。

1.2 受試者和分組 選取溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科的研究生10名，根據(jù)是否齲齒將受試者分為2組（每組n=5）：齲齒組、正常對照組。

納入標準：①成年志愿者，身體健康狀況良好；②日?？谇恍l(wèi)生習慣良好，每日早晚各刷牙一次；③研究期間能接受并嚴格遵守試驗規(guī)則，不使用除本干預措施之外的任何口腔護理產(chǎn)品（包括含抗生素的漱口液、抑菌牙膏、木糖醇口香糖等），保證受試期間飲食平衡與平常一致。排除標準：①體質(zhì)量指數(shù)（bady mass index, BMI）＞30 kg/m2；②任何可能干擾研究結(jié)果的家族遺傳性疾病或者嚴重系統(tǒng)性疾??；③近1個月內(nèi)服用抗生素，6個月內(nèi)服用激素或者免疫抑制劑，6個月內(nèi)接受過防齲治療；④日常食用益生菌習慣者，日常咀嚼木糖醇口香糖習慣者；⑤口腔黏膜發(fā)生有臨床意義的病變：如鵝口瘡、感染性口炎、地圖舌、口角炎、慢性唇炎等。本研究獲得溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 棉條菌液采集有效性觀察 隨機選取正常對照組中的2名受試者（受試者A和B），分別通過無菌棉條（受試者A：Cott 1；受試者B：Cott 2）及唾液采集器（受試者A：Sali 1；受試者B：Sali 2）采集口腔唾液，對比分析其唾液中的菌群組成及短鏈脂肪酸含量。具體操作過程：①無菌棉條留取棉條唾液：a.由同一工作人員于受試者入睡前將無菌棉條用無菌鑷子置于口腔內(nèi)過夜，位置為雙側(cè)下頜第一磨牙與正對頰黏膜之間的空隙；b.囑受試者入睡至次晨勿飲水、漱口、飲食、刷牙；c.次晨5點由同一工作人員用無菌鑷將無菌棉條取出，置于2 mL凍存管中，記錄濕重，并記錄取出棉條的位置，保存于-80 ℃冰箱中。②唾液采集器采集液體唾液：a.在采集唾液樣本前30 min，囑受試者用飲用水將口腔內(nèi)的雜物洗漱干凈；b.用舌尖抵住上顎或下顎齒根以富集唾液，向采集漏斗中輕輕吐入唾液至刻度線高度；c.使唾液與唾液保存液充分混勻后保存于-80 ℃冰箱中。③檢測樣本中菌群組成及短鏈脂肪酸含量：利用16S rDNA擴增測序及靶向代謝組學技術檢測并比較棉條唾液及唾液采集器采集的唾液中的菌群組成及短鏈脂肪酸含量。

1.4 益生菌棉條干預口腔微生態(tài) 將浸潤凍干菌粉的益生菌棉條，分別置于齲齒組及正常對照組的口腔中過夜，次晨取出。重復7 d后，檢測受試者口腔中的細菌，觀察分析組成變化。具體步驟：受試者分為兩組（每組n=5，齲齒組和正常對照組）。①利用無菌棉條分別留取兩組受試者的口腔菌液，將益生菌棉條未干預之前的一天認定為第0天；②用1 mL 0.9%氯化鈉溶液將1 g凍干菌粉融化后浸潤無菌棉條，使棉條充分吸收富含益生菌的液體，制備益生菌棉條；③將益生菌棉條置于兩組受試者的口腔中過夜，位置為雙側(cè)下頜第一磨牙與正對頰黏膜之間的空隙，次晨取出丟棄，重復7 d；④第8天，再次利用無菌棉條留取兩組受試者的口腔菌液；⑤利用16S rDNA擴增測序技術檢測兩組受試者益生菌棉條干預對口腔菌液中菌群的影響。C0：正常對照組第0天，即益生菌棉條干預前口腔菌液的物種信息；C8：正常對照組第8天，即益生菌棉條干預后口腔菌液的物種信息；T0：齲齒組第0天，即益生菌棉條干預前口腔菌液的物種信息；T8：齲齒組第8天，即益生菌棉條干預后口腔菌液的物種信息。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage、PD_whole_tree指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、等級聚類（Rank Abundance）曲線、物種累積曲線，并使用R軟件進行α多樣性指數(shù)組間差異分析；使用R軟件繪制PCA、PCoA和NMDS圖。PCA分析使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，PCoA分析使用R軟件的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，NMDS分析使用R軟件的vegan軟件包。同時使用R軟件進行α和β多樣性指數(shù)組間差異分析，分別進行參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗，2組間比較采用t檢驗或Wilcox檢驗，多于2組選用Tukey檢驗或agricolae包的Wilcox檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 通過棉條采集的菌液可以有效反映口腔菌群組成與功能 將正常對照組受試者A/B分別通過唾液采集器及無菌棉條采集的唾液，根據(jù)聚類得到操作分類單位（operational taxonomic units, OTUs）結(jié)果和研究需求，對棉條唾液及液體唾液進行均一化處理，分析液體唾液與棉條唾液之間共有、特有的OTUs。通過韋恩圖發(fā)現(xiàn)，棉條唾液與液體唾液之間存在大量重疊的功能單位，即通過棉條采集的唾液中檢測到的菌群和通過常規(guī)方式獲取的唾液中檢測到的菌群之間在很大一部分上是相同的，而通過棉條這一口腔菌液載體可檢測到的微生物更豐富，見圖2A、圖2B。將樣本中的功能單位按相對豐度由大到小排序得到對應的排序編號，再以OTUs的排序編號為橫坐標，OTUs中的相對豐度為縱坐標，將這些點用折線連接，繪制得到Rank Abundance曲線。從曲線可以看出，通過棉條獲取的口腔菌液相比于通過常規(guī)方式獲得的口腔菌液有更好的物種豐度和均勻度。見圖2C和圖2D。

圖2 基于OTUs的韋恩圖（A、B）和Rank Abundance曲線（C、D）

為進一步分析兩種方式獲取的口腔菌液之間的菌群構成差異，我們比較了兩標本中基于屬水平物種豐度排名前10 的菌類。通過對比發(fā)現(xiàn)，通過棉條獲得的口腔菌液與通過唾液采集器采集的唾液之間菌群構成相似，如受試者A都是以鏈球菌屬（Streptococcus）為主要占比菌屬，而受試者B則都是以嗜血桿菌屬（Haemophilus）為主要占比菌屬，但是棉條唾液中相對可測的微生物較液體唾液更完整，表明通過棉條收集的唾液可以更直觀地反映口腔菌群的組成。見圖3A和圖3B。

圖3 基于屬水平的最大豐度排名物種柱狀圖

除此之外，我們檢測了兩種方式獲得的口腔菌液的短鏈脂肪酸濃度，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸，見表1。作為細菌最為豐富且常見的代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸濃度可以直接反映菌群的代謝活躍程度，從而從另一方面提示了菌群的功能。通過棉條獲取的口腔菌液，相比于通過唾液采集器收集的菌液，擁有更為豐富的短鏈脂肪酸豐度，尤其體現(xiàn)在乙酸和丙酸這兩種特殊的短鏈脂肪酸上。

表1 不同采集方式下唾液中短鏈脂肪酸含量（μg/mL）

2.2 通過棉條采集的菌液可以體現(xiàn)齲齒患者與正常受試者之間的口腔菌群差異 根據(jù)韋恩圖所示，齲齒組患者與正常對照組患者之間在OTUs上存在差異。在干預之前，兩組患者享有539個共同的功能單位，齲齒組患者的功能單位總數(shù)（OTUs=742）略多于正常對照組（OTUs=722），見圖4A。而在干預之后，兩組之間共同的功能單位減少為503個，并且正常對照組的菌群功能單位數(shù)目（OTUs=812）明顯多于齲齒組中的功能單位總數(shù)（OTUs=616），見圖4B。由此可見，齲齒患者與正常受試者之間的口腔菌群在數(shù)量上是不同的。

另外，我們選取并分析了齲齒組和正常對照組受試者基于屬水平最大豐度排名前10的物種發(fā)現(xiàn)，兩組在口腔菌群的菌屬組成類別相似，但是在組成豐度方面存在一定的差異。在未進行干預之前，兩組受試者都是以鏈球菌屬（Streptococcus）為主要組成菌屬，其次為嗜血桿菌屬（Haemophilus）、變形菌屬（Prevotella），但是鏈球菌屬在齲齒患者中的占比明顯高于對照組中，而變形菌屬在齲齒組的占比則明顯低于對照組，見圖4C。對樣本的菌群同樣進行了物種差異性顯著分析。通過α多樣性分析中的LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，在齲齒組和正常對照組之間，普氏菌（Prevotellaceae）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4D。

圖4 齲齒組與正常對照組之間物種差異

2.3 益生菌棉條可以干預口腔菌群組成 通過韋恩圖對所有樣本進行均一化，發(fā)現(xiàn)益生菌棉條干預前后的口腔菌群存在功能單位的差異。正常對照組干預之后的菌群OTUs較干預之前上升，而齲齒組干預后的口腔菌群OTUs相較于干預之前有所減少，見圖5A和圖5B?；讦炼鄻有缘奈锓N分析提示對照組及齲齒組在干預之前樣本中的物種總數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但通過益生菌棉條干預之后，發(fā)現(xiàn)正常對照組與齲齒組之間的物種總數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5C。Shannon指數(shù)提示益生菌棉條干預前后的正常對照組（C0-C8）與齲齒組（T0-T8）均存在顯著的物種差異（P＜0.05），見圖5D。

我們進一步通過t檢驗對樣本中的物種進行了基于屬水平的統(tǒng)計學比較。益生菌棉條干預之后，正常對照組馬賽菌屬（Massilia）及節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）顯著升高（P＜0.05），毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）顯著降低（P＜0.05）；而在齲齒組中，泛菌屬（Pantoea）及嗜二氧化碳噬細胞菌屬（Capnocytophaga）在益生菌棉條干預之后顯著升高（P＜0.05）。利用LEfSe分析對組間的物種豐度數(shù)據(jù)通過秩和檢驗的方法來檢測不同分組間的差異物種并通過線性判別分析（linear discriminant anlysis, LDA）實現(xiàn)降維從而評估差異物種的影響大小，得到LDA值，繪制差異物種的LDA值分布柱狀圖。我們分析了LDA值大于設定值（默認設置為4）的物種，即組間差異有統(tǒng)計學意義的標志物。通過益生菌棉條干預，正常對照組中變形桿菌和丙型變形桿菌顯著升高，反之，厚壁菌（Firmicutes）顯著降低，見圖5E；而在齲齒組中，干預之后的菌群相較于尚未干預的菌群，黃桿菌（Flavobacteriales）顯著升高，見圖5F。

圖5 益生菌棉條干預之后的齲齒組和正常對照組物種差異

3 討論

目前，臨床上研究口腔微生態(tài)系統(tǒng)的方式包括牙菌斑、漱口水、唾液采集器等多種方法，但都存在一定的局限性。如唾液采集器或者使用漱口水采集唾液，由于受試者口腔暴露容易影響口腔微生態(tài)環(huán)境，且最終研究結(jié)果極易受唾液供者的口腔唾液分泌條件影響，因此無法客觀、準確地反映真實的口腔微生態(tài)情況；牙菌斑的局部內(nèi)環(huán)境及菌群的構成較為穩(wěn)定，能更好地反映口腔的微生態(tài)情況，因此被廣泛應用于臨床試驗，但是牙菌斑的供給量較少，對提取技術的要求較高，大大局限了后續(xù)的進一步研究。因此，目前亟需一種簡易、穩(wěn)定且精確的提取并干預口腔微生態(tài)的方式。

口腔前庭溝過去常被作為口腔局麻常用的穿刺及手術切口部位[11]，目前鮮見研究報道其在口腔原生態(tài)提取及干預方面的應用。本研究以棉條作為載體充分檢測并比較了樣本中的物種信息，確定了通過口腔前庭溝采取口腔菌液方法的優(yōu)勢。結(jié)果表明，棉條采集與常規(guī)方式采集的菌液中菌群組成相似，但前者的菌群豐度更高、均一度更好，并且具有更加豐富的短鏈脂肪酸含量。短鏈脂肪酸作為菌群發(fā)酵食物產(chǎn)生的最常見的代謝產(chǎn)物[12]，被廣泛應用于微生物相關研究中。以乙酸和丙酸為代表的短鏈脂肪酸，不僅代表了菌群的生理活躍程度，而且在調(diào)節(jié)宿主代謝、免疫系統(tǒng)和細胞增殖等方面發(fā)揮了重要的作用[13-14]。研究結(jié)果中健康志愿者棉條提取唾液中的高濃度短鏈脂肪酸，不僅反映了該新型方法對口腔相關菌群的有效收集，更反映了宿主的健康口腔環(huán)境。

作為與口腔菌群最直接且密切相關的疾病，我們進一步探索了該方法在提取齲齒患者口腔菌群特點信息的有效性。最近一項對齲齒兒童和健康兒童的口腔菌群進行的宏基因組分析發(fā)現(xiàn)與健康兒童相比，齲齒兒童口腔菌群結(jié)構明顯改變，其中普氏菌、衛(wèi)星沙特爾沃思氏菌、成雙厭氧球形菌等豐度顯著升高[15]。在此之前，格氏鏈球菌、血鏈球菌、變異鏈球菌等鏈球菌屬成員被廣泛認為是致齲微生物，在齲齒患者中擁有較高的水平[16-17]，這與本研究利用棉條研究口腔菌群情況后得出的結(jié)論類似。本研究比較了棉條唾液提取條件下齲齒患者與正常對照組之間的口腔菌群組成情況，結(jié)果提示齲齒患者中普氏菌顯著升高，而鏈球菌屬在口腔中可測菌群中的占比也明顯升高。因此，本研究認為，通過棉條提取的口腔菌液良好地傳遞了齲齒患者與健康者之間的口腔菌群差異信息。

益生菌作為目前常用的微生態(tài)制劑，可顯著調(diào)節(jié)口腔菌群的組成[18]。我們利用益生菌聯(lián)合棉條，制備益生菌棉條，延長了益生菌在口腔中停留的時間，從而舉例說明了口腔前庭溝這一特殊解剖部位在干預口腔原生態(tài)方面的應用前景。相比于益生菌棉條干預之前，干預之后的口腔菌液在物種豐度、物種組成方面都發(fā)生了顯著的變化，而且齲齒患者和健康志愿者在變化趨勢方面也存在差異。但是，這種變化對宿主的影響是朝向怎樣的方向發(fā)展、這種變化的效應大小以及這種影響的持續(xù)時間即長期效應尚需進一步探討。

本研究表示，通過棉條獲取的菌液不僅可以有效反映口腔菌群的組成及功能，并且益生菌棉條可以顯著干預口腔微生態(tài)環(huán)境，從而說明口腔前庭溝的利用是一種新穎的、可有效采集并顯著干預口腔原生態(tài)的方法，這對于發(fā)掘并推廣更簡單且高效的口腔保健方式、進一步探索口腔菌群在口腔乃至全身相關疾病中的機制具有現(xiàn)實意義。