去甲腎上腺素在百草枯中毒致肺纖維化小鼠模型中的作用研究

湯濤 陳銅兵 王輝

[摘要]目的探討去甲腎上腺素（NE）在百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化中的作用。方法選取蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院急診科收治的41例百草枯中毒患者和6只實驗小鼠的血漿，實驗組和對照組小鼠各3只，實驗組用百草枯處理，高效液相色譜電化學(xué)法檢測血漿中 NE 濃度。采用微滲透泵構(gòu)建小鼠模型，實驗組9只，對照組小鼠3只，實驗組用百草枯加 NE 處理，對照組僅用百草枯處理。模擬 NE 受體阻斷劑普萘洛爾對百草枯中毒引起的肺纖維化模型，實驗組和對照組小鼠各18只，實驗組用百草枯加 NE 加普萘洛爾處理，對照組中普萘洛爾換成等量的乙醇。結(jié)果研究顯示百草枯中毒患者的 NE 水平顯著提高，而中毒實驗小鼠 NE 并沒有提高。體外細胞實驗顯示， NE 在體外可誘導(dǎo)人肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而協(xié)同百草枯中毒致肺纖維化，小鼠實驗發(fā)現(xiàn)實驗組用 NE 處理的小鼠肺纖維化程度高于對照組。普萘洛爾實驗顯示，實驗組加了普萘洛爾后百草枯中毒小鼠的肺纖維化程度明顯低于對照組。結(jié)論 NE 可能是導(dǎo)致臨床百草枯中毒致肺纖維化療效不佳的重要原因，普萘洛爾在臨床上對百草枯中毒所致的肺纖維化有一定的預(yù)防作用。

[關(guān)鍵詞]百草枯;肺纖維化;去甲腎上腺素;間質(zhì)轉(zhuǎn)化;普萘洛爾

[中圖分類號] R965? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）08-0027-05

The? study? on? effect? of norepinephrine? in? mouse? models? of pulmonary fibrosis induced by paraquat poisoning

TANG? Tao??? CHEN? Tongbing??? WANG? Hui

Department of Pathology， the First People’s Hospital of Changzhou， Jiangsu， Changzhou 213003， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of norepinephrine in pulmonary fibrosis induced by paraquat poisoning. Methods The plasma of 41 paraquat poisoning patients who were admitted to the emergency department of the Third Affiliated Hospital of Soochow University and plasma of 6 experimental mice were selected， with 3 mice each in the experimental group and the control group. The experimental group was treated with paraquat， and the high-performance liquid chromatography with electrochemical detection was used to determine the concentration of norepinephrine in plasma. A micro-osmotic pump was used to construct a mouse model， with 9 mice in the experimental group and 3 mice in the control group. The experimental group was treated with paraquat plus norepinephrine， and the control group was treated with paraquat only. A model of pulmonary fibrosis induced by paraquat poisoning with propranolol， a norepinephrine receptor blocker， was established. There were 18 mice in each of the experimental group and the control group. The experimental group was treated with paraquat plus norepinephrine plus propranolol， and propranolol in the control group was replaced with the same amount of ethanol. Results The study showed that the level of norepinephrine in paraquat poisoned patients was significantly increased， while it did not increase in poisoned experimental mice. In vitro cell experiments showed that norepinephrine induced epithelial-mesenchymal transition in human alveolar type Ⅱ epithelial cells in vitro， thereby cooperating with paraquat poisoning to induce pulmonary fibrosis. Experiments in mice found that the degree of pulmonary fibrosis in mice treated with norepinephrine in the experimental group was higher than that in the control group. The propranolol experiment showed that the degree of pulmonary fibrosis in the paraquat poisoned mice in the experimental group with addition of propranolol was significantly lower than that of the control group. Conclusion Norepinephrine may be an important reason for the poor efficacy of clinical pulmonary fibrosis induced by paraquat poisoning. Propranolol has a certain clinical preventive effect on pulmonary fibrosis induced by paraquat poisoning.

[Key words] Paraquat; Pulmonary fibrosis; Norepinephrine; Mesenchymal transition; Propranolol

百草枯（paraquat， PQ）中毒是較常見的農(nóng)藥中毒之一，毒性可累及全身多個臟器，但主要以肺為靶器官，早期臨床表現(xiàn)為急性肺損傷，后期可出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化[1-2]。肺纖維化是 PQ 中毒患者致死的主要原因，病死率高達70%[3]。全球關(guān)于 PQ 中毒致肺纖維化的防治在細胞和動物實驗中已經(jīng)取得不錯的療效[4-6]，然而在實際臨床治療中， PQ 中毒致肺纖維化的療效還不盡如人意，特別是在提高生存率方面。不同于實驗動物，人作為高級情感動物，PQ 中毒患者常處于應(yīng)激狀態(tài)。人應(yīng)激狀態(tài)下，機體分泌以去甲腎上腺素（norepinephrine， NE）為代表的壓力相關(guān)激素[7-9]。是否正是由于人長期處于應(yīng)激狀態(tài)而實驗動物沒有處于應(yīng)激狀態(tài)才導(dǎo)致人的 PQ 中毒致肺纖維化的療效遠低于實驗動物？基于此，本研究通過細胞實驗和小鼠動物實驗探討 NE 在 PQ 中毒致肺纖維化中的作用。

1材料與方法

1.1 細胞及試劑

1.1.1 細胞株肺癌人類肺泡基底上皮細胞 A549肺癌胞株購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。A549細胞株可合成卵磷脂，并且含有高度不飽和脂肪酸，廣泛用于Ⅱ型肺上皮細胞模型在藥物代謝的體外模型。

1.1.2 試劑 DMEM 細胞培養(yǎng)液購于 Invitrogen 公司;胎牛血清購于美國Hyclone公司; E-cadherin 和 Vimentin 抗體購于北京中杉金橋生物有限公司。1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞用含10%滅活胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素和2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖 DMEM 完全培養(yǎng)液，于37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天用0.25%胰蛋白酶和0.5% EDTA 混合液傳代。

1.2.2? PQ 中毒致肺纖維化小鼠模型建立外源性 NE 微滲透泵實驗鼠模型，其中小鼠許可證號：SYKX（蘇）2016-0049。將含有 NE 的微滲透泵植入實驗雌性 C57BL/6小鼠背部皮下，可緩慢持續(xù)釋放 NE。為解決 NE 半衰期過短的問題，本研究在動物實驗部分采用小鼠皮下植入含 NE 的微滲透泵（Alzet model 1004，Durect， Cupertino， CA），24 h 不間斷（最長達4周）持續(xù)給予外源性 NE。該泵的工作原理是利用膠囊與所植入部位的組織或器官之間的滲透壓的差異運作。各組小鼠的泵內(nèi)預(yù)先被注入含有56 mM 的 NE，總體積為100μl 的生理鹽水（每天1μmol/100 g）。以不含有藥物的生理鹽水組作為對照組。每只泵內(nèi)還要加入0.2%的抗壞血酸作為抗氧化劑。另外，在植入小鼠體內(nèi)前所有微滲透泵要在無菌生理鹽水浸泡48 h 以保證在植入體內(nèi)后即刻開始釋放藥物。PQ 中毒致肺纖維化模型采用大小實驗鼠均有相關(guān)報道，本研究 PQ 中毒肺纖維化造模采用小鼠。8周齡的 SPF 級 C57BL/6雌性實驗鼠于應(yīng)激第2天一次性腹腔注射 P Q 溶液15 mg/kg 制成 PQ 致肺纖維化模型。PQ 的濃度各文獻報道不一，普遍波動于10～20 mg/kg，觀察時間2～4周。本研究采用方案為15mg/kg，觀察3周。1.2.3 高效液相色譜電化學(xué)法檢測 PQ 中毒患者血漿 NE 水平收集2017年1月至2019年10月蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院急診科收治的41例 PQ 中毒患者血液，采用高效液相色譜電化學(xué)法檢測 NE 濃度，PQ 中毒患者血液采集時間為入院第1、8、15天，以20例正常人的血漿 NE 濃度作為對照組。

1.2.4? NE 處理 PQ 中毒小鼠動物模型實驗中設(shè)計兩組動物，單純對照組3只， PQ 組9只分三個亞組，造模后分別于第7、14、21天處死小鼠并取出肺組織評價造模效果。結(jié)果顯示造模基本穩(wěn)定可靠。在后續(xù)的動物實驗中，用 PQ 中毒致肺纖維化而不含應(yīng)激因素作為對照組。設(shè)兩組，PQ 對照組， PQ+NE 組。每組18只，每組分三個亞組，每亞組6只分別用于 PQ 處理第7、14、21天三個階段分別處死小鼠，并進行病理檢測和評價。

1.2.5 普萘洛爾干預(yù)百草枯中毒小鼠模型小鼠實驗設(shè)兩組， PQ+NE+乙醇組， PQ+NE+普萘洛爾（每天1μmol/100 g）組。每組18只，每組分三個亞組，每亞組6只分別用 PQ+NE+乙醇和 PQ+NE+普萘洛爾（每天1μmol/100 g）處理，對照組的乙醇注射量與實驗組的普萘洛爾注射量相同，都是腹腔注射。在第7、14、21天三個階段分別處死小鼠，進行病理檢測和評價。

1.2.6 免疫熒光、電子顯微鏡掃描免疫熒光、電子顯微鏡掃描等實驗技術(shù)具體操作流程按相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)、參考文獻、試劑盒說明及實驗室操作手冊進行[10]。

2結(jié)果

2.1? PQ中毒小鼠血漿NE水平

本研究首先證實 PQ 中毒小鼠并不處于應(yīng)激狀態(tài)。實驗中設(shè)計兩組，對照組3只， PQ 組3只，造模后分別于第1、8、15天取血100μl，對照組也是同時取血100μl。采用高效液相色譜電化學(xué)法檢測血漿中 NE 濃度，結(jié)果顯示對照組小鼠和 PQ 中毒組小鼠血漿 NE 濃度都在（150±15） ng/L 范圍。即小鼠 PQ 中毒后血漿中 NE 濃度相比于對照組沒有明顯改變，見表1。

2.2? PQ中毒患者血漿NE水平

正常人的血漿 NE 濃度為（308±70）ng/L，41例 PQ 中毒患者入院當天血漿 NE 濃度高達正常對照人群的4.9倍[（1502±416）ng/L]，而且入院第8 和15天的血漿 NE 水平仍維持在正常水平的4.0倍[（1226±339）ng/L]和4.2倍[（1285±372）ng/L]，見表2。研究結(jié)果證實患者在 PQ 中毒后血漿 NE 長期保持在較高水平，即 PQ 中毒后患者長期處于應(yīng)激狀態(tài)。

2.3? NE能誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞A549發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變

使用10μM 的 NE 處理 A549細胞株4 d， A549細胞形態(tài)會發(fā)生改變，可由橢圓形或多邊形的上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗鬆畹某衫w維細胞樣形態(tài)，掃描電子顯微鏡下觀察，微絨毛和偽足都明顯增多，見圖1。免疫熒光染色顯示細胞免疫表型也發(fā)生改變，上皮標記 E - c a d h e r i n 表達缺失，間葉組織標記 Vimentin 表達獲得，見圖2。

2.4? NE協(xié)同PQ致肺纖維化

小鼠模型病理常規(guī) HE 染色結(jié)果顯示，與單純 PQ 組相比，小鼠背部皮下被植入含 NE 的微滲透泵模擬應(yīng)激狀態(tài)下（PQ+NE）兩周后肺纖維化程度加重，表現(xiàn)在肺泡間隔的彌漫性纖維化，肺內(nèi)血管壁增厚，出現(xiàn)蜂窩樣變。見圖3。

2.5 普萘洛爾對百草枯中毒患者肺纖維的作用

病理常規(guī) HE 染色顯示，背部皮下被植入含 NE 的微滲透泵模擬應(yīng)激狀態(tài)（PQ+NE）并腹腔注射普萘洛爾（每天1μmol/100 g）的小鼠與注射乙醇的對照組相比，兩周后，實驗組肺纖維化程度明顯低于對照組，見圖4。

3討論

PQ 是一種速效非選擇性高效接觸型除草劑，對周圍環(huán)境無害，故而曾經(jīng)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11-12]。百草枯中毒時，導(dǎo)致肺纖維化損傷和腎小管壞死[13]。早期采用強化免疫抑制劑治療可減輕中重度 PQ 中毒所誘發(fā)的各臟器功能損害，尤其是減輕肺纖維化[14-15]。

本研究通過對 PQ 中毒患者和小鼠動物實驗的研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒患者體內(nèi) NE 濃度持續(xù)較高，而中毒小鼠體內(nèi) NE 濃度無明顯改變。由于 NE 是具有代表性的壓力相關(guān)激素，人在應(yīng)激狀態(tài)下才會濃度上升[16]。課題組用 NE 處理 A549細胞株，發(fā)現(xiàn) A549細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial– mesenchymal transition， EMT），提示在 NE 作用下 A549細胞已經(jīng)發(fā)生了 EMT。既往研究已經(jīng)證明肺泡上皮細胞在各種因素下轉(zhuǎn)變分化為間質(zhì)型肌成纖維細胞即 EMT，是形成肺纖維化的重要機制[17-18]。本研究進一步通過小鼠動物實驗初步觀察到小鼠背部皮下被植入含 NE 的微滲透泵模擬應(yīng)激狀態(tài)下（PQ+NE）兩周后，結(jié)果顯示肺纖維化程度加重。本研究的實驗結(jié)果在活體水平提示 NE 對 PQ 致肺纖維化起到了協(xié)同作用，細胞和動物實驗也證實 NE 對 PQ 致肺纖維化起到了協(xié)同作用。提示 NE 可能是導(dǎo)致人與動物模型百草枯中毒療效差的原因。本研究使用了 NE 受體的阻斷劑普萘洛爾，結(jié)果顯示普萘洛爾通過阻斷百草枯患者壓力相關(guān)激素 NE 的上調(diào)從而起到改善肺纖維化的作用。提示普萘洛爾可以對 PQ 中毒患者的肺纖維化有一定的預(yù)防作用，對百草枯的治療有重要的臨床意義。研究結(jié)果為百草枯中毒患者的治療提供了新的思路和見解，具有重要的臨床意義。

綜上所述，PQ 中毒患者的治療效果一直不太理想，所以需要從多角度多維度展開研究，本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)普萘洛爾可以通過阻斷 PQ 患者壓力相關(guān)激素 NE 的上調(diào)從而起到改善肺纖維化作用，對百草枯中毒的治療有新的啟示。本研究從NE 入手，通過小鼠實驗從新的角度驗證了普萘洛爾可以對百草枯中毒起到一定的治療作用。在今后的研究中，科研工作者們可以從多個通路對 PQ 中毒展開研究，以期在不久的將來完全治愈 PQ 中毒。

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（收稿日期：2021-09-16）