姚燁岑，郭 明，葉 博，許丹丹，鄭云峰，江 濤

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，浙江杭州 311300；2.紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江紹興 312000）

黃酒為我國(guó)的特色食品，含有豐富的葡萄糖、醇類、酯類和18 種氨基酸及多種微量元素等，對(duì)人體健康十分有益[1]。同時(shí)，黃酒中含有的糖化膠質(zhì)，是一種有保健功效的綠色食品。研究表明，黃酒的多種營(yíng)養(yǎng)成分具有功能性，例如：①抗氧化物質(zhì)，包括酚類、硒、類黑精和谷胱甘肽等；②降高血壓物質(zhì)，黃酒中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Converting Enzyme Inhibtion，ACE)在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中能顯著降低血壓；③抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，黃酒中的γ-氨基丁酸(GABA)[2]參與多種代謝活動(dòng)，可降低血壓、改善腦功能、增強(qiáng)長(zhǎng)期記憶、抗焦慮、高效減肥及提高肝、腎機(jī)能等[3]，所以黃酒在食藥領(lǐng)域長(zhǎng)期得到廣泛應(yīng)用。

近年來，我國(guó)黃酒行業(yè)在經(jīng)歷快速發(fā)展期后面臨消費(fèi)市場(chǎng)漸趨飽和的現(xiàn)狀，由于地域性較強(qiáng)，市場(chǎng)拓展較難；同時(shí)由于黃酒為傳統(tǒng)食品行業(yè)，加工技術(shù)相對(duì)較低，進(jìn)入的門檻較低等原因，企業(yè)數(shù)量大量增長(zhǎng)，無序競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致價(jià)值被低估，科技含量不高。另一方面，啤酒、葡萄酒作為競(jìng)爭(zhēng)者都紛紛加大科技投入，研發(fā)時(shí)尚新品種，對(duì)傳統(tǒng)黃酒沖擊較大，傳統(tǒng)黃酒缺乏時(shí)尚元素，難以吸引年輕消費(fèi)者。研發(fā)時(shí)尚黃酒現(xiàn)已成為行業(yè)關(guān)注的共識(shí)熱點(diǎn)，經(jīng)業(yè)界一些企業(yè)努力，目前市場(chǎng)上已有時(shí)尚黃酒，但檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)未見明確報(bào)道。所以現(xiàn)開發(fā)新型時(shí)尚黃酒，推陳出新，提升生產(chǎn)技術(shù)，拓展新消費(fèi)市場(chǎng)，樹立品牌觀念，規(guī)范行業(yè)秩序[4]。但是目前對(duì)于新型時(shí)尚黃酒的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)技術(shù)尚未完全統(tǒng)一，故利用現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法是一個(gè)新的突破。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)是一種結(jié)合色譜高分離能力和質(zhì)譜高鑒別能力的在線分離、定性和定量檢測(cè)技術(shù)，可以檢測(cè)10-12～10-3mg/L 的痕量有機(jī)物[5]，適用于新型時(shí)尚水果黃酒揮發(fā)性成分的分析。由于新型水果黃酒成分復(fù)雜，針對(duì)不同目標(biāo)物采取不同的前處理技術(shù)能夠有效減少分析過程中的實(shí)驗(yàn)誤差[6-7]，故采用的前處理凈化技術(shù)有：①頂空技術(shù)（Headspace technology）：通過直接捕集樣品上空的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)的方法，按照捕集方式可被分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)頂空技術(shù)；②固相微萃取技術(shù)（Solid phase micro extraction，SPME）：一種新型揮發(fā)物萃取技術(shù)，能夠通過熔融石英纖維從氣體或者液體樣品中富集揮發(fā)成分,跟傳統(tǒng)萃取技術(shù)比有操作簡(jiǎn)單、精度高、樣品損耗小等優(yōu)點(diǎn)[8]。

在GC-MS分析時(shí)尚黃酒中建立特征譜圖是期望獲得的結(jié)果。指紋圖譜是指采用一定的分析手段得到的能夠標(biāo)示某些復(fù)雜化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖[9]，已在中藥研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。色譜指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，在產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)評(píng)判和真?zhèn)舞b別中都起到了重要作用。本試驗(yàn)所研究的新型水果時(shí)尚黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜分析借鑒了中藥指紋圖譜的分析方法，將譜學(xué)分析法與化學(xué)計(jì)量學(xué)處理方法相結(jié)合，具有整體性、模糊性和可量化等特點(diǎn)，在新型水果時(shí)尚黃酒感官審評(píng)、種類識(shí)別、品質(zhì)鑒定、真?zhèn)闻袆e等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

新型水果時(shí)尚黃酒：2020 年1 月、3 月、6 月、9月、12 月，5 個(gè)批次的桂花、蜜桃、楊梅和青梅黃酒，均取自浙江塔牌紹興酒業(yè)有限公司。

儀器設(shè)備：7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-17MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（Agilent公司，美國(guó)）；AL204電子天平（檢定分度值為0.001 g，梅特勒公司）；SPME 手柄、頂空瓶及固相微萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）（Supelco美國(guó)）；常規(guī)玻璃儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

頂空瓶?jī)?nèi)的黃酒為2020 年5 個(gè)批次的桂花、蜜桃、楊梅和青梅黃酒。依次將裝有樣品的頂空瓶放置在固相微萃取裝置上（設(shè)置溫度為45 ℃），然后將萃取頭（實(shí)驗(yàn)前先將此萃取頭在色譜儀250 ℃進(jìn)樣口老化30 min）插入手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行頂空萃取，萃取時(shí)間為15 min，萃取結(jié)束后在氣相色譜進(jìn)樣口解析24 min。

色譜條件：色譜柱為DB-17MS石英毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm；進(jìn)樣口溫度為230 ℃，ECD 檢測(cè)器溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；柱溫起始為40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持3 min，不分流模式進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件:EI 電子源，電離能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍(M/Z)為50～550 amu；離子源溫度為230 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度為220 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜的建立及共有峰的確認(rèn)

由GC-MS 檢測(cè)分析得到20 個(gè)黃酒樣品的基礎(chǔ)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析其基峰、質(zhì)核比和相對(duì)豐度，分別得出各峰所代表的揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱，參考NISTO8aL 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果及相關(guān)化合物的保留指數(shù)、分析匹配度對(duì)黃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一法計(jì)算各成分的相對(duì)含量[11-12]。

對(duì)不同批次的黃酒樣品進(jìn)行GC-MS 分析，共檢測(cè)出27 種物質(zhì)，醇類和酯類在揮發(fā)性成分中含量最高，其后依次為醛酮類、其他類、烴類和酚類。

利用Origin2017 軟件繪制同一批次的4 種不同風(fēng)味的新型黃酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 總離子圖，通過圖譜的對(duì)照可以看出，有13 個(gè)共有峰，雖然豐度大小不同，但都在同一時(shí)間出峰，故篩選出13 個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征指紋峰，如圖1 所示。這13 個(gè)共有峰依次為苯丙酸乙酯、十六烷、十六酸乙酯、2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚、丁二酸-乙基-3-甲基丁酯、2-己酸乙酯、α-亞乙基-苯乙醛、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、甲氧基苯基肟和苯甲醛。

圖1 桂花、蜜桃、楊梅和青梅黃酒揮發(fā)性成分GC-MS總離子圖

分別計(jì)算桂花、蜜桃、楊梅、青梅以及所有樣品匯總后的13 個(gè)共有峰面積之和占總峰面積的百分比，從而得到相對(duì)保留面積，發(fā)現(xiàn)其值介于72.53 %～81.06 %之間，分別為76.52 %、81.06 %、75.56 %、73.86 %和72.53 %，平均值為75.91 %，如表1所示。

在比較這13 個(gè)共有峰時(shí)，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為19.582 min 的苯乙醇的峰面積最大且相對(duì)穩(wěn)定，具有良好的對(duì)照效果，選其為參照峰，將苯乙醇的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積都定為1，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算其他所有共有峰的相對(duì)保留值。各共有峰的相對(duì)保留面積和相對(duì)保留時(shí)間分別如表1 和表2 所示。由表2 可知，特征共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD%都小于3 %，說明它們?cè)贕C-MS 譜圖中具有相對(duì)穩(wěn)定性。

表1 各共有峰的相對(duì)保留面積

表2 各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

2.2 指紋圖譜特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和平均相對(duì)峰面積

通過分析，所構(gòu)建的新型黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)字化特征指紋圖譜如表3 所示。從表3 可知，新型黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)的指紋圖譜峰相對(duì)保留時(shí)間主要集中在0.4984～2.4081 之間，其相對(duì)含量從大到小的順序依次為苯乙醇、苯甲醛、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、甲氧基苯基肟、α-亞乙基-苯乙醛、十六酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-己酸乙酯、2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚、苯丙酸乙酯、丁二酸-乙基-3-甲基丁酯、十六烷。黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)主要是醇類、酯類和醛類化合物，主要香氣成分來自醇類化合物，酯類化合物主要是在酵母發(fā)酵與陳釀過程中產(chǎn)生，賦予黃酒芬芳香味。

表3 新型黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)字化指紋圖譜

2.3 新型黃酒指紋圖譜的相似度分析

采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法對(duì)新型黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS 指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。對(duì)桂花、蜜桃、楊梅、青梅和匯總之后的樣品的GCMS 色譜圖進(jìn)行分析，利用13 個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果如表4所示。由表4可知，13 個(gè)特征峰夾角余弦的相關(guān)系數(shù)在0.9436～0.9876 之間，相似度的相關(guān)系數(shù)在0.9124～0.9750之間，說明不同品種的黃酒樣品具有較好的相似度，可用于建立新型黃酒的GC-MS指紋圖譜。

表4 新型黃酒指紋圖譜的相似度分析

采用Origin2017 軟件，對(duì)20 個(gè)新型黃酒的離子色譜圖原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立新型黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS 指紋圖譜，如圖2 所示，1—5 是5個(gè)批次的桂花黃酒，6—10 是蜜桃黃酒，11—15 是楊梅黃酒，16—20是青梅黃酒?？梢钥闯雒糠N風(fēng)味的黃酒除共有峰以外都有其特征出峰位置，如表5所示。表明新型風(fēng)味黃酒具有除了傳統(tǒng)型黃酒的固有風(fēng)味之外的其他水果的特征風(fēng)味。

表5 新型黃酒特征揮發(fā)性成分

圖2 新型黃酒揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜

3 結(jié)論

采用指紋圖譜共有峰來確定新型黃酒的風(fēng)味物質(zhì)，計(jì)算特征峰組的相似度均達(dá)到了0.9124 以上，說明標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以作為新型風(fēng)味黃酒的質(zhì)量分析與鑒別的依據(jù)。分析得出的13 個(gè)共有峰以及新型風(fēng)味黃酒的特征揮發(fā)成分表明新型黃酒既有傳統(tǒng)型黃酒的風(fēng)味，也具有創(chuàng)新的果味的特征風(fēng)味。