齊茜，劉鵬，王明義，王玉珊，羅紅

(1.威海市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東威海 264200；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

胃癌(gastric cancer，GC)作為一種高度侵襲性的癌癥[1]，死亡率高，預(yù)后差，平均5年生存率不到20%[2-3]。幽門螺桿菌感染、吸煙、高鹽飲食、高肉類攝入和膽汁反流等均是胃癌的臨床危險(xiǎn)因素[4-5]?；谖赴┑膫鹘y(tǒng)測(cè)序方法是多細(xì)胞水平的，比如轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，是提取器官、腫瘤組織或者細(xì)胞群的混合RNA進(jìn)行測(cè)序，最終得到的信號(hào)值代表多個(gè)細(xì)胞群體水平，無(wú)法精確揭示其中的基因表達(dá)差異等異質(zhì)性的信息，而這些腫瘤生物學(xué)特征差異對(duì)于癌癥的診療及預(yù)后有重要意義[6-7]。二代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地促進(jìn)了對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究[8]。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能更精準(zhǔn)地從細(xì)胞、基因以及分子層面揭示GC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制，提高GC的診斷和個(gè)體化治療以及預(yù)后評(píng)估水平。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

隨著流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)[9-10]、激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection, LCM)[11-12]以及微流控(microfluidics)[13]等單細(xì)胞分離技術(shù)的出現(xiàn)以及新一代測(cè)序平臺(tái)的廣泛應(yīng)用，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[14]。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)高通量測(cè)序的局限性，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)偏倚、高通量和高分辨率的轉(zhuǎn)錄組分析[15](圖1)，從而揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性并將其歸類分析，進(jìn)行個(gè)性化研究。因此，該技術(shù)可應(yīng)用于檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分子表型分型[16]、發(fā)現(xiàn)早期的腫瘤細(xì)胞、監(jiān)測(cè)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性以及指導(dǎo)靶向精準(zhǔn)治療等[17]。單細(xì)胞測(cè)序主要涵蓋轉(zhuǎn)錄組和基因組兩部分，通過(guò)分析比較單個(gè)細(xì)胞的RNA和DNA序列來(lái)反映轉(zhuǎn)錄組和基因組的變化。

圖1 單細(xì)胞RNA測(cè)序工作流程

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組是基因組和表觀基因組的功能性讀數(shù)。理想情況下，轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)能準(zhǔn)確地捕捉到生物體最小功能單元(單個(gè)細(xì)胞)中所有種類的全長(zhǎng)RNA的精確數(shù)量。Tang等[18]首次使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single cell RNA-Seq，scRNA-Seq)技術(shù)在單個(gè)小鼠卵母細(xì)胞和卵裂球進(jìn)行分析，隨后經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化，包括單細(xì)胞 mRNA 深度測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法、提高測(cè)序通量等，使得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠適用于更多研究中。諸如單細(xì)胞標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄測(cè)序(single-cell tagged reverse transcription sequencing， STRT-seq)[19-20]、模板轉(zhuǎn)換法(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript, SMART-seq)[7]、體外線性(IVT)擴(kuò)增單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的方法(cell expression by linear amplification and sequencing, CEL-seq)[17]、單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)(whole-transcript amplification for single cells，Quartz-seq)[21]以及日本理化所開(kāi)發(fā)的Quartz-seq2[22]等方法的發(fā)展和運(yùn)用，大大拓展了scRNA-seq 分析技術(shù)的應(yīng)用范圍。目前，scRNA-seq分析逐漸成為研究細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組的差異性，揭示細(xì)胞類型、亞型、狀態(tài)和發(fā)展軌跡等的有效方法[23]，在揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞異質(zhì)性、微量樣品的轉(zhuǎn)錄組分析、真核生物轉(zhuǎn)錄組基因復(fù)雜性等方面被廣泛應(yīng)用。

單細(xì)胞基因組擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)在腫瘤發(fā)生機(jī)制研究和臨床診斷中發(fā)揮了不可替代的作用。2011 年，Navin等[24]利用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)全基因組擴(kuò)增及DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自多基因組腫瘤的 100 個(gè)單細(xì)胞和單株原發(fā)腫瘤及其肝轉(zhuǎn)移的100 個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析，揭示了乳腺癌單細(xì)胞水平的基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV) ，推斷出腫瘤的克隆演化過(guò)程。而后，隨著多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification，MDA)[ 25]和多重退火和基于環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增 (multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)[26]等技術(shù)的涌現(xiàn)，基因組覆蓋率得到了提高，PCR錯(cuò)誤率也迅速降低[27]。近年來(lái)，隨著科研人員對(duì)單細(xì)胞全基因組測(cè)序的精確度及覆蓋度的高要求，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)也在不斷改善與提高中，比如利用微流體反應(yīng)器進(jìn)行單鏈測(cè)序(single-stranded sequencing using microfluidic reactors, SISSOR)方法[28]，通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入的線性擴(kuò)增 (linear amplification with transposon insertion，LIANTI)方法[29]等。

2 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在GC研究中的應(yīng)用

2.1GC免疫微環(huán)境方面的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究 腫瘤免疫微環(huán)境(TME)的重要組成部分是腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，包括T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞亞群；這些免疫細(xì)胞既對(duì)腫瘤細(xì)胞起殺傷作用 (例如 CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞)，又能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)展[30]。因此，腫瘤微環(huán)境已成為一個(gè)潛在的抗癌靶點(diǎn)，對(duì)其的研究已成為腫瘤生物學(xué)的熱點(diǎn)[31]。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是分析TME中細(xì)胞成分異質(zhì)性的有力工具，通過(guò)scRNA-seq分析可以檢測(cè)到使用內(nèi)窺鏡切除的腫瘤組織中更多樣的TME免疫細(xì)胞，甚至可以檢測(cè)腫瘤中的B細(xì)胞或Treg細(xì)胞的亞群[32]，故而可作為分析腫瘤微環(huán)境高度可行的平臺(tái)。

為了篩選GC潛在的、新的免疫治療標(biāo)志物和靶點(diǎn)，Sathe等[33]從7例GC患者和1例腸道上皮化生(GIM)患者中獲取組織，對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常胃組織相比，同一種類型的細(xì)胞具有異質(zhì)性。這種異質(zhì)性在腫瘤內(nèi)和腫瘤間均存在，如巨噬細(xì)胞具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，不符合M1/M2型巨噬細(xì)胞；細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)內(nèi)具有腫瘤耗竭T細(xì)胞型亞組等。此外，該學(xué)者通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序和受體配體相互作用分析了TME專有的細(xì)胞間通訊，有助于了解腫瘤生物學(xué)，對(duì)篩選GC的潛在免疫治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。

GC的發(fā)展過(guò)程是從非萎縮性胃炎到慢性萎縮性胃炎，再到腸上皮化生，最終進(jìn)展為GC。在GC進(jìn)展過(guò)程中TME細(xì)胞的變化尚未闡明，因此，scRNA-seq技術(shù)可以幫助檢測(cè)特定的細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄特征，以揭示TME細(xì)胞與GC的關(guān)聯(lián)。Yin等[34]使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在GC發(fā)展過(guò)程中的各個(gè)階段生成了各種 TME 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組圖譜，檢測(cè)出一組與 TME 細(xì)胞致癌相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)變標(biāo)記，如PLAU、S100A8和CLEC10A基因，并描繪了這些細(xì)胞的動(dòng)態(tài)致癌軌跡。因此，未來(lái)可以基于上述的關(guān)鍵轉(zhuǎn)變基因確定免疫抑制檢查點(diǎn)靶點(diǎn)，從而創(chuàng)立新的免疫療法，以有效預(yù)防和控制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[35]。

2.2GC免疫細(xì)胞方面的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究 近年來(lái)，腫瘤免疫療法已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但由于難以確定可用于臨床的生物標(biāo)志物，腫瘤免疫療法仍面臨諸多困難。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)作為研究腫瘤免疫的一個(gè)有力工具，能夠預(yù)測(cè)潛在的抗癌靶點(diǎn)，在GC的免疫治療中有極高的實(shí)用價(jià)值。2020年，F(xiàn)u等[36]利用scRNA-seq對(duì)2例GC患者的組織和3 例GC患者的外周血進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，GC癌組織中耗竭性CD8+T細(xì)胞中的干擾素調(diào)節(jié)因子8(interferon regulatory factor 8, IRF8)表達(dá)下調(diào)，且GC患者外周血中CD8+T細(xì)胞中IRF8的表達(dá)也降低，提示IRF8的表達(dá)與GC相關(guān)，可能成為免疫治療的潛在靶點(diǎn)。該研究從腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換機(jī)制切入，對(duì)不同的免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定，并對(duì)其發(fā)育軌跡進(jìn)行描述，在單個(gè)細(xì)胞水平上揭示了GC患者T細(xì)胞的異質(zhì)性。另有學(xué)者揭示了GC的免疫抑制機(jī)制，并為GC的免疫檢查點(diǎn)療法篩選了潛在靶點(diǎn)[35]。

腫瘤免疫中，CD8+效應(yīng)T細(xì)胞起到重要的抗腫瘤作用，但腫瘤介導(dǎo)的 T 細(xì)胞耗竭阻礙了CD8+T細(xì)胞正常發(fā)揮細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致免疫抑制[37]。研究表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可變啟動(dòng)子(alternative promoters)在腫瘤特異基因表達(dá)的調(diào)控方面發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用[38]。Sundar等[39]用scRNA-seq分析證實(shí)了GC中可變啟動(dòng)子高負(fù)荷表達(dá)的T細(xì)胞活性水平降低，并表現(xiàn)出免疫耗竭的特征。進(jìn)一步對(duì)接受免疫治療的胃腸道癌癥患者分析發(fā)現(xiàn)，可變啟動(dòng)子高負(fù)荷表達(dá)與低負(fù)荷表達(dá)相比，GC的無(wú)進(jìn)展生存期更短。這提示了可變啟動(dòng)子與GC患者免疫細(xì)胞之間具有相關(guān)性，借助單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步揭示了GC的免疫抑制機(jī)制，為今后GC患者的臨床治療提供了潛在的免疫治療新思路。

2.3GC細(xì)胞異質(zhì)性方面的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究 腫瘤異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤藥物治療耐藥性的重要原因，也是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療所面臨的挑戰(zhàn)。胃腺癌(GAC)作為一種高度侵襲性的癌癥，死亡率高，分子和臨床特征復(fù)雜[40]。對(duì)GC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分群分析有助于發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物治療耐藥的細(xì)胞類群，對(duì)GC的精準(zhǔn)治療有重要的參考意義。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)無(wú)偏倚地對(duì)GC細(xì)胞進(jìn)行分群。2020年，Zhang等[41]對(duì)9例GC患者和3例非腫瘤患者樣本中的27 677個(gè)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)偏倚的單細(xì)胞測(cè)序，確定了5個(gè)腫瘤細(xì)胞亞群(C1～C5)，并對(duì)其分子特征進(jìn)行了描述。該研究發(fā)現(xiàn)C4亞群特異性表達(dá)基因RNF43富集了WNT相關(guān)信號(hào)通路，這與主細(xì)胞主導(dǎo)型胃底腺癌(GA-FG-CCP)具有一致性。另外，在單細(xì)胞層面描述了主細(xì)胞有可能向解痙肽表達(dá)化生細(xì)胞(SPEM)轉(zhuǎn)變的途徑。該研究在單細(xì)胞水平上闡述了胃化生細(xì)胞的起源和胃癌異質(zhì)性，說(shuō)明在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可用于檢測(cè)罕見(jiàn)腫瘤類型(如GA-FG-CCP)及準(zhǔn)確診斷 GA。

腹膜轉(zhuǎn)移(PC)是晚期GC患者死亡的首要原因之一，發(fā)生在約45%的晚期GAC患者中。Ajani等[42]使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)結(jié)合免疫組化染色檢測(cè)出PC腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，證明了YAP1在PC細(xì)胞中呈高表達(dá)，并使得PC細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的性質(zhì)。該研究還通過(guò)聯(lián)合使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)YAP1高表達(dá)可作為GC患者發(fā)生PC的靶標(biāo)。因此，干擾或抑制YAP1的功能，或與目前的化療藥(如多西紫杉醇)聯(lián)合治療可能對(duì)GC治療有效。YAP1抑制劑可成為新的抗癌藥物，為GC患者帶來(lái)希望。

2.4癌前病變和早期胃癌病變方面的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究 癌前病變向侵襲性疾病進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞通常是罕見(jiàn)的群體，不會(huì)大量出現(xiàn)，無(wú)法輕易通過(guò)常規(guī)的針對(duì)細(xì)胞集合的測(cè)序獲得數(shù)據(jù)。Zhang等[43]對(duì)非萎縮性胃炎(NAG)、慢性萎縮性胃炎(CAG)、腸上皮化生(IM)或早期胃癌(EGC)患者的13例胃竇黏膜樣本進(jìn)行活檢，獲取32 332個(gè)高質(zhì)量的細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，以構(gòu)建單細(xì)胞圖譜，同時(shí)在細(xì)胞和分子2個(gè)層面構(gòu)建不同病變胃上皮的的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)?；趩渭?xì)胞圖譜，該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一組胃癌特異性標(biāo)記基因，其在其他細(xì)胞類型中低表達(dá)，但在癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，該組基因包括SLC11A2、KLK7、SULT2B1和LMTK3等。這些基因作為GC細(xì)胞特異性分子標(biāo)記，可在GC早期階段識(shí)別癌細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)而識(shí)別早期GC[33]。另外，該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)OR51E1可用來(lái)標(biāo)記早期癌變中的內(nèi)分泌細(xì)胞，HES6可能標(biāo)記出杯狀前細(xì)胞簇，這為鑒別早期化生提供重要價(jià)值。

Owen等[44]從6名Barrett食管(Barrett′s Esophagus, BE)患者和2名無(wú)食管病變患者中獲取組織，對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)癌前病變細(xì)胞中與GC進(jìn)展相關(guān)的標(biāo)記基因，如SPINK4和ITLN1基因標(biāo)記Barrett食管杯狀細(xì)胞分化的早期階段的細(xì)胞，有助于鑒別化生。另外，該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)以LEFTY1和OLFM4基因?yàn)闃?biāo)記的Barrett食管中的細(xì)胞與食管黏膜下腺細(xì)胞有轉(zhuǎn)錄重疊，但與胃或十二指腸細(xì)胞沒(méi)有重疊。這些研究揭示了癌前狀態(tài)下正常組織和細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄關(guān)系，有助于對(duì)癌前病變或GC早期診斷。

2.5利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)構(gòu)建GC細(xì)胞圖譜 2018年9月，人類腫瘤圖譜網(wǎng)絡(luò)(Human Tumor Atlas Network，HTAN)計(jì)劃啟動(dòng)。2020年4月，HTAN研究取得的進(jìn)展發(fā)表于Cell雜志。該圖譜將使人們?nèi)嫔钊肓私獍┌Y生物學(xué)，對(duì)腫瘤預(yù)防、監(jiān)測(cè)和治療有重要的指導(dǎo)價(jià)值。2020年6月，Gut雜志發(fā)表了全方位的胃癌表達(dá)譜圖譜[41]，并建立了一種新型的區(qū)分良惡性上皮細(xì)胞的分類方法。該研究著眼于非惡性上皮細(xì)胞，闡述了胃化生細(xì)胞的起源；著眼于惡性上皮細(xì)胞，構(gòu)建了一種量化細(xì)胞分化程度的計(jì)算方法，并揭示分化程度與GC的預(yù)后密切相關(guān)；發(fā)現(xiàn)了一種新型的GC類型：主細(xì)胞主導(dǎo)型GC，并在大規(guī)模數(shù)據(jù)庫(kù)中驗(yàn)證了這種類型GC的存在。該研究為剖析GC異質(zhì)性、預(yù)后和解析GC化生演變進(jìn)程提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源?，F(xiàn)今，GC的基因組圖譜已經(jīng)被描繪出來(lái)。每個(gè)分子亞型的分子特征和新的治療靶點(diǎn)已被鑒定。這些進(jìn)展使臨床將基于基因組和基于表型的診斷和治療方法結(jié)合起來(lái)并應(yīng)用于精確醫(yī)學(xué)時(shí)代的個(gè)體GC患者成為可能[8]。

3 小結(jié)及展望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能表征大量細(xì)胞異質(zhì)性，并為GC異質(zhì)性的研究提供有價(jià)值的資源，為GC的診斷和預(yù)后評(píng)估提供寶貴的參考資料。然而，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還有許多不足之處，迫切需要改進(jìn)與創(chuàng)新。如在獲取單細(xì)胞時(shí)形成的單細(xì)胞懸液，在細(xì)胞分選過(guò)程中其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是否發(fā)生改變，單細(xì)胞檢測(cè)樣品是否能夠較為準(zhǔn)確地揭示細(xì)胞在組織中的空間結(jié)構(gòu)信息，單細(xì)胞是否會(huì)打破組織和器官的整體性。另外，檢測(cè)樣品的制備受到捕獲效率的限制，由于現(xiàn)有技術(shù)的破壞效應(yīng)或其低效率，珍稀的細(xì)胞類群很可能被忽略。因此，提高樣品制備的效率及轉(zhuǎn)錄組和基因組在擴(kuò)增時(shí)的覆蓋率、降低錯(cuò)配率和減少噪音影響，以及建立更完善的生物信息算法用于評(píng)估群體發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化等都十分必要。

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，人們對(duì)GC研究的新思路也不斷涌現(xiàn)， 特別是基于單細(xì)胞多組學(xué)研究技術(shù)，不僅可以對(duì)來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞的多種分子形式進(jìn)行聯(lián)合分析，還可進(jìn)行多個(gè)腫瘤細(xì)胞間的多維數(shù)據(jù)分析，如同步檢測(cè)單細(xì)胞ATAC和單細(xì)胞RNA信息的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)(simultaneous high-throughput ATAC and RNA expression with sequencing，SHARE-seq)[45-46]的開(kāi)發(fā)，實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞中同時(shí)高質(zhì)量、高通量的檢測(cè)基因表達(dá)，為單細(xì)胞多組學(xué)研究提供了一個(gè)可以參考的范例。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)中具有創(chuàng)新性和創(chuàng)造性的方法被不斷開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，其在未來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用前景將十分廣闊。