MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)非結(jié)核分枝桿菌鑒定的應(yīng)用價(jià)值*

徐茂鎖，劉亞雋，張慧，周聰，齊偉強(qiáng)，申春梅

(上海市第五人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.院感科，上海 200240)

近年來(lái)，我國(guó)非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，全球范圍內(nèi)NTM疾病發(fā)病率和患病率也迅速上升[1-2]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)現(xiàn)廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域，其對(duì)NTM菌種鑒定國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但在Bruker MALDI-TOF MS使用中，需使用分枝桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定才能取得滿意效果[3-5]。本實(shí)驗(yàn)室Bruker MALDI-TOF MS搭載的數(shù)據(jù)庫(kù)為MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)，包含41種分枝桿菌信息，但目前已發(fā)現(xiàn)NTM 190余種，可見(jiàn)該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NTM鑒定能力尚有不足。MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)可補(bǔ)充商品數(shù)據(jù)庫(kù)外的預(yù)測(cè)圖譜信息，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行有效完善，從而提高鑒定準(zhǔn)確率[6]。本研究利用分子生物學(xué)測(cè)序確認(rèn)NTM菌種信息并構(gòu)建自建數(shù)據(jù)庫(kù)，以分子生物學(xué)測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)輔助MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NTM鑒定的可行性，評(píng)價(jià)MALDI-T0F MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NTM鑒定的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月—2021年5月上海市第五人民醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌液體培養(yǎng)陽(yáng)性、抗酸染色確認(rèn)且液體培養(yǎng)物MPT64抗原檢測(cè)陰性的分枝桿菌，剔除同一患者重復(fù)菌株后，共73株，其中，男性41株，女性32株，患者年齡中位數(shù)66歲；標(biāo)本類型：1株為引流液，72株為痰液，主要來(lái)源科室依次為結(jié)核門診、結(jié)核病房、觀察室及ICU。

1.2儀器與試劑 Microflex質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)，MGIT 320全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀(美國(guó)BD公司)，Mastercycler nexus PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一生物科技公司)，ABI 3739XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；結(jié)核分枝桿菌MPT64抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法，韓國(guó)標(biāo)準(zhǔn)診斷公司)，中性羅氏培養(yǎng)基(上海申啟生物科技公司)，抗酸染色液(珠海貝索公司)，質(zhì)譜試劑IVD細(xì)菌試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品(IVD Bacterial Test Standard，IVD BTS)和IVD HCCA基質(zhì)溶液(德國(guó)布魯克·道爾頓公司)，無(wú)水乙醇(中國(guó)賽默飛世爾公司)，甲酸、乙腈(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，DNA-EZ Reagents V DNA提取液和PCR擴(kuò)增試劑2×SanTaq PCR Mix預(yù)混液(上海生工生物公司)，質(zhì)譜分析軟件Flexcontrol 3.4和Biotyper OC 3.1(德國(guó)Bruker公司)。

1.3方法

1.3.1NTM菌株的篩選 分枝桿菌液體培養(yǎng)陽(yáng)性，液體培養(yǎng)物進(jìn)行抗酸染色確認(rèn)和MPT64抗原膠體金法檢測(cè)，篩選MPT64抗原陰性分枝桿菌。

1.3.2自建數(shù)據(jù)庫(kù)用菌株及待檢NTM菌株的確認(rèn) 對(duì)MPT64抗原陰性分枝桿菌使用DNA-EZ Reagents V DNA提取液處理，80 ℃金屬浴5 min后取上清液作模板DNA。應(yīng)用16S RNA編碼基因(16SDNA)、熱休克蛋白65編碼基因(hsp65)和RNA聚合酶的β亞基(rpoB)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列參照文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1，由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×SanTaq PCR Mix預(yù)混液25 μL,DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，雙蒸水20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 5 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，送上海生工生物公司使用ABI 3739XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行一代測(cè)序，同源序列比對(duì)使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)“Microbes”目錄下“blastn”模塊進(jìn)行分析，以16SDNA序列比對(duì)結(jié)果為準(zhǔn)，如無(wú)法區(qū)分，依次參考hsp65和rpoB序列比對(duì)結(jié)果確定MPT64抗原陰性分枝桿菌菌種。菌種信息確定后，以首次分離的NTM菌種作為自建數(shù)據(jù)庫(kù)用菌株，其余均為待檢菌株。

表1 hsp65、rpoB和16S DNA的引物序列

1.3.3質(zhì)譜標(biāo)本的前處理 質(zhì)譜前處理方法依據(jù)文獻(xiàn)[9-10]和廠家建議對(duì)甲酸提取法進(jìn)行改良。具體操作：取適量新鮮菌落轉(zhuǎn)移至含150 μL蒸餾水的1.5 mL離心管中，渦旋震蕩形成均勻的混懸液，95 ℃ 30 min熱滅活處理，待冷卻后加入450 μL無(wú)水乙醇，渦旋震蕩2 min，14 000 r/min離心菌體細(xì)胞2 min，重復(fù)1次，棄上清液，37 ℃干燥5 min待乙醇完全揮發(fā)，加入20 μL乙腈和適量0.5 mm直徑的玻璃珠，渦旋震蕩2 min，加入20 μL 70%甲酸溶液，渦旋震蕩2 min，14 000 r/min離心微生物提取物2 min，將1 μL提取物移取到靶板上晾干，覆蓋1 μL IVD HCCA基質(zhì)溶液并晾干。

1.3.4MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)采集和建立 使用FlexControl 3.4軟件采集圖譜，軟件設(shè)置：采用線性正離子模式，激光頻率60 Hz,加速電壓為20.00 kV，延遲提取電壓18.10 kV，聚焦電壓6.00 kV，延遲時(shí)間為150 ns，激光功率37.0%。圖譜采集前使用IVD BTS手動(dòng)校準(zhǔn)儀器, 圖譜采集時(shí)手動(dòng)采集數(shù)據(jù)，確保指紋圖譜質(zhì)量，信號(hào)強(qiáng)度>10 000。建庫(kù)的NTM，每株需制備8個(gè)靶位，每個(gè)靶位采集3張蛋白質(zhì)圖譜，計(jì)24張圖譜，使用Biotyper軟件Show Normalized Spectra in GelView模塊評(píng)估圖譜之間重復(fù)性，除去低質(zhì)量的圖譜，使用Creat MSP模塊創(chuàng)建該菌種的預(yù)測(cè)圖譜，其他NTM自建數(shù)據(jù)庫(kù)用菌株同等要求建立各自預(yù)測(cè)圖譜，構(gòu)建自建數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.5自建數(shù)據(jù)庫(kù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證 重復(fù)性驗(yàn)證：選取菌種信息確認(rèn)的4株膿腫分枝桿菌、3株堪薩斯分枝桿菌和3株偶發(fā)分枝桿菌(來(lái)源：9株臨床分離株，1株室間質(zhì)評(píng)菌株)進(jìn)行固體培養(yǎng)，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)菌落時(shí)進(jìn)行首次檢測(cè)，每天3次，連續(xù)3 d，比較質(zhì)譜結(jié)果符合率；準(zhǔn)確性驗(yàn)證：選取菌種信息確認(rèn)的膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌各10株(來(lái)源：臨床分離株)進(jìn)行固體培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)菌落時(shí)進(jìn)行檢測(cè),共30個(gè)檢測(cè)結(jié)果，比較質(zhì)譜結(jié)果與分子生物學(xué)測(cè)序結(jié)果之間的符合率。

1.3.6MALDI-TOF MS鑒定 使用Biotyper OC 3.1軟件調(diào)入待檢NTM圖譜，以“自建數(shù)據(jù)庫(kù)+MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)”鑒定待檢NTM作實(shí)驗(yàn)組，以“MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)”鑒定待檢NTM作對(duì)照組，記錄MALDI-TOF MS第一位鑒定結(jié)果及得分，鑒定結(jié)果得分≥1.7為可信，得分<1.7為不可信。以分子測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)NTM的鑒定結(jié)果符合率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DNASTAR SeqMan軟件分析序列峰圖，DNASTAR SeqBuilder軟件編輯序列，MEGA-X軟件繪制并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)聚類分析。采用SPSS 20.0軟件處理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組鑒定效能比較使用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 應(yīng)用hsp65、rpoB和16SDNA3對(duì)同源序列比對(duì)鑒定，73株MPT64抗原檢測(cè)陰性分枝桿菌均能鑒定到種水平，其中72株為NTM，1株為結(jié)核分枝桿菌。72株NTM包括：胞內(nèi)分枝桿菌21株、膿腫分枝桿菌17株、堪薩斯分枝桿菌13株、鳥(niǎo)分枝桿菌4株、偶發(fā)分枝桿菌4株、緩黃分枝桿菌3株、哥倫比亞分枝桿菌3株、戈登分枝桿菌3株、類戈登分枝桿菌2株和海分枝桿菌2株。10株NTM自建數(shù)據(jù)庫(kù)用菌株同源序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。自建庫(kù)用類戈登分枝桿菌16SDNA、hsp65和rpoB基因Blast鑒定結(jié)果序列匹配率依次為99.08%、98.74%和99.39%，利用MAGE-X軟件基于16SDNA、hsp65和rpoB基因進(jìn)行序列比對(duì)計(jì)算遺傳距離(p-distance)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)聚類分析，見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

表2 10株自建數(shù)據(jù)庫(kù)用菌株的菌種信息

注：1-Nucleotide Sequence，戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株；2-Nucleotide Sequence，類戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株。

注：1-Nucleotide Sequence，戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株；2-Nucleotide Sequence，類戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株。

注：1-Nucleotide Sequence，戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株；2-Nucleotide Sequence，類戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株。

2.2NTM自建數(shù)據(jù)庫(kù)的驗(yàn)證 自建數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)性與準(zhǔn)確性驗(yàn)證符合率均為100%。

2.3MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別對(duì)62株待檢NTM進(jìn)行鑒定，以分子生物學(xué)測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組NTM鑒定率為51.61%(32/62)，實(shí)驗(yàn)組NTM鑒定率為95.16%(59/62)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.102，P<0.001)；剔除MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)中缺失的分枝桿菌后，對(duì)照組NTM鑒定率為86.48%(32/37)，實(shí)驗(yàn)組NTM鑒定率為97.30%(36/37),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.902，P=0.088)，見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)組鑒定結(jié)果中1株類戈登分枝桿菌被錯(cuò)誤鑒定為戈登分枝桿菌，得分1.713，戈登與類戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)指紋圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 MALDI-TOF MS戈登與類戈登分枝桿菌自建庫(kù)菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜

表3 MALDI-TOF MS對(duì)62株待檢NTM的鑒定效能

3 討論

近年來(lái)，NTM病呈快速增多趨勢(shì)，NTM肺病感染癥狀可與肺結(jié)核病相似，鑒別診斷困難，且NTM對(duì)很多一線抗結(jié)核藥物天然耐藥，并有研究發(fā)現(xiàn)某些特定菌種對(duì)藥物的耐藥機(jī)制與特定耐藥基因有關(guān)[11-12]。因此，快速準(zhǔn)確的鑒定NTM，對(duì)NTM感染治療和結(jié)核病防治至關(guān)重要。

MALDI-TOF MS通過(guò)微生物中提取的肽和蛋白質(zhì)成分獲取指紋圖譜，使用評(píng)分算法匹配參考圖譜實(shí)現(xiàn)微生物的鑒定，已迅速取代傳統(tǒng)生化和表型分析鑒定方法[13]。分枝桿菌細(xì)胞壁組成成分復(fù)雜且穩(wěn)定，胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)難以釋放，指紋圖譜難以獲取，易導(dǎo)致分枝桿菌鑒定失敗。95 ℃ 30 min熱處理有助細(xì)菌滅活和增加細(xì)胞壁通透性，0.5 mm直徑的玻璃珠漩渦震蕩或研磨有助于細(xì)菌物理破壁釋放蛋白質(zhì)[9-10]。研究表明，使用改良甲酸提取法處理分枝桿菌，可提升Bruker質(zhì)譜商品數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)分枝桿菌的鑒定率和準(zhǔn)確性，但在Vitek質(zhì)譜中卻并不適用[14]。

利用MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)功能可對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行有效完善，從而提升鑒定準(zhǔn)確率，已有報(bào)道表明自建數(shù)據(jù)庫(kù)可提升對(duì)酵母菌和絲狀真菌的鑒定能力[15-16]。本研究建立的自建數(shù)據(jù)庫(kù)包含10種NTM預(yù)測(cè)圖譜信息，實(shí)驗(yàn)組對(duì)62株待檢NTM的鑒定率較對(duì)照組由51.61%提升至95.16%；剔除MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)欠缺的分枝桿菌后，實(shí)驗(yàn)組NTM鑒定率較對(duì)照組由86.48%提升至97.30%，表明自建數(shù)據(jù)庫(kù)輔助MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)可顯著提升對(duì)NTM的鑒定效能，主要體現(xiàn)在MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)缺失的分枝桿菌上。綜上，自建數(shù)據(jù)庫(kù)可豐富MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)信息，使其對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)外的分枝桿菌具備鑒定能力，提升MALDI-TOF MS對(duì)NTM的鑒定效能。MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)具有共享功能，可為不同終端提供互助支持，使其臨床應(yīng)用價(jià)值更為突出。

類戈登分枝桿菌由Kim等[17]基于hsp65基因序列測(cè)定鑒定病原菌發(fā)現(xiàn)并命名為類戈登分枝桿菌49061型，并證明16SDNA、hsp65和rpoB基因序列的獨(dú)特性。類戈登分枝桿菌49061型與戈登分枝桿菌ATCC1447016SDNA基因序列相似度為99.04%，構(gòu)建的16SDNA進(jìn)化樹(shù)聚類分析表明兩者親緣關(guān)系密切，可見(jiàn)類戈登分枝桿菌16SDNA基因序列雖具有獨(dú)特性，但與戈登分枝桿菌16SDNA基因序列高度相似，無(wú)法作為鑒別兩者的特征性序列；類戈登分枝桿菌與戈登分枝桿菌hsp65基因序列相似度為95.10%，BLAST比對(duì)鑒定序列匹配率為98.74%，構(gòu)建的hsp65進(jìn)化樹(shù)聚類分析顯示兩者雖具有相近親緣關(guān)系，但可以對(duì)兩者進(jìn)行鑒別，可見(jiàn)hsp65基因可作為鑒定類戈登分枝桿菌的特征性序列；類戈登分枝桿菌與戈登分枝桿菌rpoB基因序列相似度為97.39%,BLAST比對(duì)鑒定序列匹配率為99.39%，構(gòu)建的rpoB進(jìn)化樹(shù)聚類分析顯示多種NTM親緣關(guān)系密切，無(wú)法作為鑒別兩者的特征性序列。綜上，16SDNA和rpoB基因序列測(cè)定無(wú)法鑒別菌種，僅hsp65基因序列測(cè)定可對(duì)類戈登分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)缺失類戈登分枝桿菌預(yù)測(cè)圖譜，戈登分枝桿菌與類戈登分枝桿菌蛋白質(zhì)指紋圖譜顯示，位置3 766、5 653、6 352、7 243和10 619 m/z附近存在相似高強(qiáng)度特征性波峰，兩者蛋白質(zhì)指紋圖譜相似，是導(dǎo)致此次鑒定錯(cuò)誤的原因，這與楊本善等[18]研究使用Bruker Mycobacteria Library 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定類戈登分枝桿菌的結(jié)果相一致。Bruker Mycobacteria Library 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)在3.0版基礎(chǔ)上豐富了類戈登分枝桿菌預(yù)測(cè)圖譜，委托布魯克(北京)科技有限公司上海分公司采用Bruker Mycobacteria Library 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)待檢類戈登分枝桿菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果正確，得分2.115。可見(jiàn)MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇直接影響NTM鑒定結(jié)果。

本研究存在一定的局限性。本研究中MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)用菌株使用的是臨床分離株，雖經(jīng)分子生物學(xué)測(cè)序，但非標(biāo)準(zhǔn)模式菌株，其生化特征和蛋白質(zhì)表達(dá)的穩(wěn)定性無(wú)法保證；收集的NTM的種類和數(shù)量較少，無(wú)法覆蓋所有NTM臨床分離株，對(duì)本文未涉及和數(shù)量較少的NTM菌株，則需要大范圍、多中心的合作研究以豐富MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NTM的鑒定能力評(píng)價(jià)。

綜上，MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)選擇直接影響NTM鑒定結(jié)果，MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NTM鑒定能力尚有不足，自建數(shù)據(jù)庫(kù)可輔助MBT DB5989數(shù)據(jù)庫(kù)顯著提升對(duì)NTM的鑒定效能，這項(xiàng)工作也可為MALDI-TOF MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)外其他微生物提供借鑒。