姚輝耀， 王福超，2， 張 華* ， 尹星福*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)指具有特定功能，采用人工方法生產(chǎn)的三?；视王ィ@種三?；视王ズ懈街诟视椭麈溕系亩喾N短鏈、中鏈和長鏈脂肪酸[1]。不飽和-飽和-不飽和(USU)型結(jié)構(gòu)脂是指通過酶法脂交換技術(shù)模擬母乳脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，使其甘油酯二位(Sn-2)為飽和脂肪酸，一，三位(Sn-1,3)上連接不飽和脂肪酸，在結(jié)構(gòu)上更接近母乳水平的一種結(jié)構(gòu)脂。

人乳脂肪中的甘油三酯含量占整個脂肪的98%以上，60%以上的棕櫚酸(為飽和脂肪酸)分布在甘油三酯的Sn-2位，其他的不飽和脂肪酸主要分布在Sn-1,3位，即屬USU型，如1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)和OPL等[2]。這種結(jié)構(gòu)脂，經(jīng)過消化吸收后，優(yōu)先釋放出來1,3位上的不飽和脂肪酸，很容易被腸道吸收進入到血液中，2位上的棕櫚酸也很容易被腸道所吸收，同時也促進維生素和礦物質(zhì)的吸收[3]。在母乳供應(yīng)不足的情況下，嬰幼兒的配方奶粉成為提供嬰幼兒營養(yǎng)的最佳選擇，但目前國內(nèi)市場的很多配方奶粉中的脂肪多為調(diào)配的植物油，脂肪酸組成與分布都與母乳脂肪差別很大，這些差異會造成嬰幼兒在消化吸收奶粉脂肪過程中出現(xiàn)鈣皂等問題，影響嬰幼兒對脂肪和鈣的吸收[4]。在部分發(fā)達國家，結(jié)構(gòu)脂質(zhì)已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并進入市場。國外相關(guān)研究中，Quinlan等[5]以Rhizomuco miehei 脂肪酶為催化劑，三棕櫚酸甘油酯和油酸為原料進行酸解反應(yīng)。Jiménez等[6]通過兩步酸解法，OPO最佳的得率可達到96%。但我國在這一領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。黃磊等[7]以巴沙鯰魚油和葵花籽油的游離脂肪酸為原料，用 Lipozyme RM IM脂肪酶為催化劑，制備了富含OPO的結(jié)構(gòu)脂；蔣與燕等[8]以三棕櫚酸甘油三酯(PPP)和油酸(OA)為原料，脂肪酶RMIM作催化劑，反應(yīng)制備出OPO結(jié)構(gòu)油脂；鄒孝強等[9]以LipozymeRM IM為催化劑，通過在填充床反應(yīng)器中酸解巴沙鯰魚油，調(diào)節(jié)巴沙鯰魚油中的棕櫚酸、亞油酸含量及Sn-2位棕櫚酸相對含量。

棕櫚硬脂油Sn-2位上富含飽和脂肪酸，棕櫚酸含量為72.04%，硬脂酸含量為9.32%[10-12]；芥菜籽油富含亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸，二者是制備USU型結(jié)構(gòu)脂的理想原料。因此，該試驗用Lipozyme TLIM脂肪酶催化芥菜籽油乙酯與棕櫚硬脂油，反應(yīng)制備USU型結(jié)構(gòu)脂。根據(jù)酶添加量、反應(yīng)時間、底物摩爾比，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交優(yōu)化實驗，得到最佳工藝條件。為實現(xiàn)USU型結(jié)構(gòu)脂利用于人乳替代脂，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚硬脂油(奧斯利化工有限公司，濟南)；芥菜籽油(中企華業(yè)食品有限公司代理，北京)；固定化脂肪酶(Lipozyme TLIM，諾維信，丹麥)；氫氧化鉀；無水乙醇；正己烷；無水硫酸鈉；乙醚；醋酸(阿拉丁試劑有限公司，上海)均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(JA1003J，上海雷韻試驗儀器制造有限公司，上海，中國)；自動控溫往復(fù)式水浴搖床(DP-SHA-B,北京亞歐德鵬科技有限公司，北京，中國)；高速離心機(TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠，上海，中國)；磁力攪拌器(HJ-4，金壇市易晨儀器制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海一科儀器有限公司)；手提式紫外分析儀(WHF-204B，杭州市齊威儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 不飽和脂肪酸乙酯的制備

取120 g芥菜籽油于圓底燒瓶中，加入36.8 g無水乙醇(醇油摩爾比6∶1)，1.2 g氫氧化鉀(芥菜籽油質(zhì)量的0.23%)，用加熱磁力攪拌器在78 ℃、120 r / min下冷凝回流反應(yīng)30 min。反應(yīng)后移入分液漏斗內(nèi)，冷卻后加入100 mL正己烷，充分震蕩后加入50 mL熱蒸餾水洗滌，待溶液澄清后放掉下層液體，多次水洗直至乳化層消失。取上層澄清液體通過裝有無水硫酸鈉的層析柱除去多余的水分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去混合液中的正己烷，得到不飽和脂肪酸乙酯。

1.3.2 USU型結(jié)構(gòu)酯的制備

50 mL離心管中放入一定摩爾比的棕櫚油和芥菜籽脂肪酸乙酯，在水浴搖床中加熱到50 ℃后，加入一定比例的脂肪酶 Lipozyme TLRM，反應(yīng)一定時間后取出，得到含有產(chǎn)物和游離脂肪酸的混合物。

放入離心機中以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層液體加入等體積正己烷，混勻后加入熱蒸餾水洗滌，靜置分層后分別收集上層和下層液體，其中下層液體重復(fù)清洗3次至乳化層完全消失。上層液體合并后用無水硫酸鈉去水，將其過濾后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將正己烷完全去除后稱重即為結(jié)構(gòu)脂的重量。結(jié)構(gòu)脂得率按照下式計算：

1.4 單因素試驗

1.4.1 不同反應(yīng)時間對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

將棕櫚油和芥菜籽油脂肪酸乙酯按1∶3的摩爾比混合，加入混合物質(zhì)量4%的脂肪酶Lipozyme TLIM，在自動控溫往復(fù)水浴搖床中以120 r/min、55 ℃下分別反應(yīng)2、3、4、5和6 h，計算得率，試驗重復(fù)3次。

1.4.2 不同摩爾比對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

將棕櫚油和芥菜籽油脂肪酸乙酯分別按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5(mol∶mol)的摩爾比混合，加入混合物質(zhì)量4%的脂肪酶 Lipozyme TLIM，在自動控溫往復(fù)水浴搖床中以120 r/min、55 ℃反應(yīng)4 h后，計算得率，試驗重復(fù)3次。

1.4.3 不同酶添加量對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

將棕櫚油和芥菜籽油脂肪酸乙酯按1∶3的摩爾比混合，分別加入混合物質(zhì)量2%、3%、4%、5%和6%的脂肪酶Lipozyme TLIM，在自動控溫往復(fù)水浴搖床中以120 r/min、55 ℃反應(yīng)4 h后，計算得率，試驗重復(fù)3次。

1.5 正交試驗

通過單因素試驗可以確定適宜的脂肪酶添加量、底物摩爾比和反應(yīng)時間，由此以脂肪酶添加量、底物摩爾比和反應(yīng)時間為考察因素，分別選取3個水平，以USU型結(jié)構(gòu)酯得率為指標(biāo)進行L9(34)正交試驗。因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.6 脂肪酸乙酯定性分析

為驗證制備的菜籽油脂肪酸乙酯，對酯化產(chǎn)物進行薄層層析分析。用正己烷∶乙醚∶冰乙酸(體積比90∶10∶1)混勻配制展開劑后，倒入展開缸中，密封備用。

將菜籽油、菜籽油乙酯、油酸乙酯標(biāo)品與正己烷以1∶20的比例混合均勻備用。用移液槍吸取樣品20 μL于離心管中，加入5 mL展開劑。

將硅膠G板放在105 ℃烤箱內(nèi)烤2 h進行活化，點樣時點樣線距底部2 cm，用移液槍吸取樣液5 μL于點樣線上。將硅膠板迅速放入展開缸中進行展開，待展開劑前沿走至距板上端1 cm時取出，自然晾干后將薄層板在紫外分析儀照射下顯示圖譜。

1.7 油脂結(jié)構(gòu)和脂肪酸組成

利用高效液相色譜儀(HPLC)進行了油脂結(jié)構(gòu)分析。HPLC條件為：色譜柱Zorbax SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫55 ℃；流動相流速為1 mL/min；進樣量為5 μL；流動相為乙腈(A)和二氯甲烷(B)梯度洗脫，洗脫程序為0 min時A流動相為70%，5 min時A流動相為50%，25 min時A流動相保持50%，35 min時A流動相為30%，40 min時A流動相為70%[13]。

利用氣相色譜儀(GC)分析了脂肪酸組成。稱取30 mg樣品，加入1.5 mL 0.5 mol/L甲醇鈉，充分混勻后在90 ℃反應(yīng)3 min，冷卻，再加入2 mL 體積分數(shù)14% 的BF3甲醇溶液繼續(xù)在90 ℃條件下反應(yīng)2 min，冷卻后加入1 mL飽和氯化鈉和2 mL異辛烷，提取脂肪酸甲酯，經(jīng)過無水硫酸鈉干燥后用于GC分析。配有自動進樣器和火焰離子化檢測器，色譜柱為石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.2 μm)。GC分析條件：柱溫先在100 ℃保溫5 min，采用程序升溫，以4 ℃/min升至220 ℃保持20 min。載氣為N2，總氣體流速為50 mL/min，進樣口和檢測器的溫度分別為250和260 ℃[14]。

1.8 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS.20.0進行數(shù)據(jù)分析，軟件中的Duncan檢驗法對差異顯著的數(shù)據(jù)進行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶添加量對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

由圖1通過顯著差異進行分析，脂肪酶添加量為5%與6%之間無顯著性差異，其余各組均與脂肪酶添加量5%有顯著性差異。

圖1 酶添加量對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

隨著脂肪酶添加量的增加，結(jié)構(gòu)脂得率呈先上升后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)。當(dāng)添加量為5%時得率最高。這是因為在脂肪酶添加量低于5%時，促進?；霓D(zhuǎn)移，使反應(yīng)向結(jié)構(gòu)脂生成方向進行；脂肪酶添加量大于5%時結(jié)構(gòu)脂得率趨于平穩(wěn)，可能是脂肪酶與底物的結(jié)合率已經(jīng)達到飽和。

2.2 反應(yīng)時間對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

由圖2可以看出，當(dāng)反應(yīng)時間為4 h時，結(jié)構(gòu)脂的得率最高，反應(yīng)時間在2～4 h時，反應(yīng)物濃度大于生成物濃度，反應(yīng)整體趨向正反應(yīng)方向，使得結(jié)構(gòu)脂的得率持續(xù)增加，而從4 h過后脂肪酸甲酯的產(chǎn)率趨于平緩無顯著性差異，但得率略有下降，可能是因為隨著反應(yīng)時間的延長，酯化反應(yīng)已經(jīng)開始向逆反應(yīng)方向進行，使得結(jié)構(gòu)脂的得率降低，因此，優(yōu)選的反應(yīng)時間是4 h。

圖2 反應(yīng)時間對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

2.3 底物摩爾比對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

由圖3可以看出，摩爾比為1∶3、1∶4和1∶5之間不存在顯著性差異，其余各組均具有顯著差異。當(dāng)?shù)孜锬柋葹?∶4時，結(jié)構(gòu)脂得率最高。由于該試驗用脂肪酶切割甘油三酯1，3位脂肪酸，再由不飽和脂肪酸替代，理論上底物摩爾比為1∶2。底物摩爾比在低于1∶3時，底物濃度大于生成物濃度，反應(yīng)整體趨向正反應(yīng)方向，使得結(jié)構(gòu)脂得率持續(xù)增加，而大于1∶3時，結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)率開始趨于平穩(wěn)。從經(jīng)濟合理的角度考慮，選取較優(yōu)的反應(yīng)底物摩爾比為1∶3。

圖3 底物摩爾比對結(jié)構(gòu)脂得率的影響

2.4 最佳反應(yīng)條件的確定

通過L9(34)正交試驗，由表2中R值可以看出脂肪酶添加量、反應(yīng)時間、底物摩爾比對USU型結(jié)構(gòu)脂得率的影響主次順序為A>C>B，即最主要的影響因素為酶用量，其次是摩爾比，最后為反應(yīng)時間，由K值可以確定各因素和水平間最佳組合為A1B1C3，而試驗最佳結(jié)果組合為A1B3C3。通過驗證試驗確定最佳試驗方案為A1B3C3，即酶添加量4%，反應(yīng)時間5 h，底物摩爾比1∶4(mol/mol)。

表2 結(jié)構(gòu)脂酯交換反應(yīng)研究L9(34)試驗結(jié)果

2.5 薄層層析法定性分析

對芥菜籽油，芥菜籽油乙酯以及油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品進行薄層層析分析結(jié)果表明(圖4)，制備的芥菜籽油乙酯產(chǎn)物中除脂肪酸乙酯以外無其它副產(chǎn)物。

圖4 薄層層析顯色照片

2.6 脂肪酸組成分析及甘油三酯結(jié)構(gòu)分析

從氣相色譜圖峰面積百分比可以看出(表3)，棕櫚硬脂油Sn-2位主要飽和脂肪酸為C16∶0(棕櫚酸)、C18∶0(硬脂酸)，飽和脂肪酸占比為81.3%，芥菜菜籽油主要脂肪酸包括C18∶1(油酸)、C18∶2(亞油酸)、C18∶3(亞麻酸)和不飽和脂肪酸總含量為90.8%(表3)。表明適合制備USU型結(jié)構(gòu)酯。

表3 脂肪酸組成

選用棕櫚硬脂油與薺菜籽油乙酯(1∶4，mol/mol), 添加4%TLIM(w%)脂肪酶，反應(yīng)5 h得到了Sn-2位棕櫚酸(C16∶0)含量為54.5%，Sn-1,3位油酸含量51.9%(表3)，1,3-二油酸-2-棕櫚酸結(jié)構(gòu)脂(OPO)含量為25.3%的USU型結(jié)構(gòu)酯(表4)。該試驗結(jié)果與Jeung等[15]利用棕櫚硬脂丙酮物理分提物與油酸乙酯反應(yīng)得到OPO(31.4%)的結(jié)果相似。

表4 ELSD-HPLC分析和Sn-2位棕櫚酸總和

3 討論

酶促酯交換反應(yīng)是制備結(jié)構(gòu)脂的常用方法，具有高度專一性和高效率等特點，但對于反應(yīng)條件有一定要求。酶法制備OPO的方法可以分為酯化法、酸解法和轉(zhuǎn)酯法。Pfeffre等[16]先將棕櫚酸甘油三酯轉(zhuǎn)化成為2-棕櫚酸甘油一酯，然后通過脂肪酶CALB催化2-棕櫚酸甘油一酯與油酸酯化反應(yīng)合成OPO，制得OPO的純度為95%，得率為90%。該法雖然能合成較高純度的OPO，但增加了甘一酯的制備與純化工序，增加了生產(chǎn)成本。Nagao等[17]將棕櫚酸甘油三酯與油酸按質(zhì)量比1∶2混合均勻，加入8%熱穩(wěn)定性脂肪酶R275A，在50 ℃下反應(yīng)24 h，得到36%的OPO。Silva等[18]通過脂肪酶Lipozyme TL IM催化豬油和大豆油的混合物發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，制備的產(chǎn)品物理特性與人乳脂相似，但脂肪酸組成和脂肪酸結(jié)構(gòu)與人乳脂存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂肪酸甲酯或乙酯作為?；w時，相對于脂肪酸作為?；w有更高的插入率，同時具有較低的?；D(zhuǎn)移[19-21]。但由于反應(yīng)產(chǎn)物中含有未反應(yīng)的芥菜籽油脂肪酸乙酯、棕櫚硬脂以及產(chǎn)生的甘一酯、甘二酯，因此需要進一步純化。該研究以棕櫚硬脂油和芥菜籽油為原料，利用酶促酯交換反應(yīng)制備USU型結(jié)構(gòu)脂。研究了底物摩爾比、脂肪酶添加量和反應(yīng)時間3個因素對結(jié)構(gòu)脂得率的影響，通過正交試驗對結(jié)構(gòu)脂最佳制備條件進行了優(yōu)化。酶促酯交換反應(yīng)是制備結(jié)構(gòu)脂的常用方法，這種方法雖然具有高度專一性和高效率等特點，但其對于反應(yīng)條件有一定要求，因此適宜反應(yīng)條件的篩選就成為提高產(chǎn)物產(chǎn)率的重要措施。

4 結(jié)論

該試驗結(jié)果表明，芥菜籽油含有多種脂肪酸，其中，不飽和脂肪酸含量90.8%，棕櫚硬脂油Sn-2位棕櫚酸含量72.0%，滿足USU型結(jié)構(gòu)脂對反應(yīng)底物的要求。通過正交試驗確定棕櫚油和芥菜籽油脂肪酸制備USU型結(jié)構(gòu)脂的最佳工藝條件為：酶添加量4%、反應(yīng)時間5 h、底物摩爾比1∶4(mol∶mol)，此條件下結(jié)構(gòu)酯得率最高，得到Sn-2位的棕櫚酸含量在61.9%的各種結(jié)構(gòu)USU型結(jié)構(gòu)酯。