應用蛋白質組學研究茶葉的品種適制性

張 晴 晴， 張 艷 榮， 孫 珍

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

茶葉具有抗炎、降血脂、抗氧化、調節(jié)免疫、延緩衰老等功能[1-2]。茶葉的化學成分非常復雜，包含2 000多種成分[3]。其中，蛋白質、氨基酸是茶葉中的重要成分。氨基酸是人體必需的有效化學成分，也是茶葉香氣的前體物質，能影響茶湯的鮮爽度。茶葉中的某些氨基酸，如茶氨酸，是茶葉中特有的一種游離氨基酸，具有非常強大的生理保健功能，包括緩解人的疲勞感、降低血壓、提高人的記憶能力等[4]。蛋白質約占茶葉干重的20%～30%[5]，蛋白質在茶鮮葉中含量越高，代謝越旺盛，代謝過程中的中間產物和產物含量也越高，能給茶葉帶來良好的滋味和香氣。

茶樹品種的適制性，是指某一特定茶種適合加工成某種茶類的特性和程度，是形成茶葉優(yōu)良品質的前提[6-7]。不同茶樹中成分組成不同，決定了制成不同類別成品茶品質的差異[8]。初級代謝產物中的蛋白質、糖類、脂肪以及次級代謝產物中的多酚類、色素、茶氨酸、生物堿、芳香物質等，都對茶葉的品質特性或多或少起著不可替代的作用[9-10]。蛋白質參與了這些次級代謝產物的生成過程，推測蛋白質與茶葉品種的適制性存在一定的關聯。

本實驗采用TCA丙酮法提取了19種茶葉中的蛋白質進行組學分析，對所得的蛋白質數據進行GO注釋對19種茶葉得到的蛋白信息進行KEGG代謝通路分析，并對部分代謝通路進行了OPLS-DA分析。以期將研究結果用于茶葉新品種的適制性的輔助判斷。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

茶葉：悅茗香、黃觀音、毛蟹、鐵觀音、茂綠、安吉白茶、中茶102、鄂茶1號、鳧早2號、龍井43、中茶108、錫茶5號、福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白、皖農95、尖波黃13號、櫧葉齊12號，中國農科院茶葉研究所資源圃。

尿素、鹽酸胍、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，生工生物工程有限公司；硫脲，通用技術集團醫(yī)療健康有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、兩性表面活性劑(CHAPS)、β-巰基乙醇、胰蛋白酶(來源于牛胰腺，不小于10 000 U/mg)、糜蛋白酶(來源于牛胰腺，不小于40 U/mg)，美國西格瑪奧德里奇公司；丙酮、三氯乙酸(TCA)，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

Q ExactiveTM組合型四級桿Orbitrap質譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Ultimate 3000 RSLC nano System，美國戴安公司；酶標儀，美谷分子儀器有限公司；化學發(fā)光凝膠成像系統，通用技術集團醫(yī)療健康有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 茶葉蛋白的提取

取1 g茶葉于研缽中，加液氮研磨成粉狀，轉到預冷的6 mL提取液Ⅰ(TCA 5 g，β-巰基乙醇35 μL，丙酮定容至50 mL)中，-20 ℃過夜處理。4 ℃、10 000 r/min離心20 min棄上清，加入6 mL 預冷的提取液Ⅱ(β-巰基乙醇35 μL，丙酮定容至50 mL)后混勻，將溶液于-20 ℃冰箱中靜置2 h，4 ℃、10 000 r/min離心20 min棄上清后加預冷的丙酮重復洗2～3次，將蛋白沉淀風干。

1.2.2 蛋白濃度的測定

配制蛋白工作液。儲液：100 mL 95%乙醇，350 mg考馬斯亮藍G-250，200 mL 85% H3PO4；工作液：425 mL ddH2O，15 mL 95%乙醇，30 mL 85% H3PO4，30 mL儲液。

所有樣品均采用Bradford法測蛋白濃度，以牛血清蛋白(BSA)作為標準蛋白，配制不同質量濃度BSA：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL，以質量濃度為橫坐標，595 nm 處測得的吸光度為縱坐標，作標準曲線。

1.2.3 質譜樣品的制備

取蛋白樣品20 mg，按質量體積比1∶30加入緩沖液(6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L Tris)，反應10 min，14 000 r/min離心20 min，取上清測蛋白濃度。取1 mg蛋白液于超濾管中，加入100 mmol/L DTT (終濃度20 mmol/L)，于37 ℃ 恒溫箱反應2 h，14 000 r/min離心20 min，加入100 mmol/L IAA (終濃度20 mmol/L)避光反應40 min，離心后加入胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合酶液溫育12 h。

1.2.4 實驗條件1.2.4.1 色譜條件

預柱，C18 PepMap100(5 μm，10-8m)；分析柱，Acclaim PepMapTMRSLC(75 μm×15 cm，3 μm)；流動相A，0.1%甲酸溶液；流動相B，80%乙腈和0.1%甲酸溶液；預柱溫度，45 ℃；進樣量，2 μL；體積流量，0.2 μL/min。

流動相線性洗脫程序：0～10 min，4% B；10～13 min，4%～10% B；13～35 min ，10%～35% B；35～41 min，35%～55% B；41～42 min，55%～95% B；42～ 52 min，95% B；52～53 min，95%～4% B；53～70 min，4% B。

1.2.4.2 質譜條件

離子源模式，納升級電噴霧(Nano ESI)；噴霧電壓，2.5 kV；質譜掃描方式：正離子模式，Full MS/dd-MS2模式；一級質譜掃描范圍，350～1 800m/z；Orbitrap檢測完整肽段的分辨率為70 000，檢測離子碎片的分辨率17 500。使用Proteome Discoverer 2.2.0.388處理得到MS/MS數據，肽段的假陽性鑒定率設為小于1%。根據實際使用的酶設定切割位點，允許2個漏切位點。前體離子的質量誤差設定為10-5，碎片離子的質量誤差設定為0.02 u。動態(tài)修飾設為甲硫氨酸上+15.995 u的氧化修飾，靜態(tài)修飾設為半胱氨酸上+57.021 u的酰胺甲基化修飾。使用Proteome Discoverer 2.2.038軟件進行數據比對，已測物種包含的蛋白數據庫在Uniprot官網(http：//www.uniprot.org/)下載。

2 結果與討論

2.1 蛋白質鑒定結果

本實驗共檢測了19種茶葉樣品中的蛋白數量，如表1所示。每個樣品檢測3次，將所得的3次RAW文件合在一起對比Viridiplantae庫得到相應的蛋白總數。

表1 各茶葉中的蛋白總數Tab.1 Total proteins in each kind of tea

2.2 四大類茶的GO注釋

圖1為福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白(均適制白茶)4個品種所檢測到的蛋白個數，福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白分別檢測到8 371、8 335、8 126、8 217種蛋白質，因后續(xù)比較的是四大類茶之間的差別，故選擇了一大類茶里至少有兩種茶葉里共有的蛋白數據進行GO注釋分析(以白茶為例6 326)。同理得到烏龍茶(悅茗香、黃觀音、毛蟹、鐵觀音)、紅茶(皖農95、櫧葉齊12、尖波黃13)、綠茶(鄂茶1號、鳧早2號、龍井43、中茶108)的蛋白個數為5 947、3 919、5 578。

圖1 4種白茶品種的蛋白韋恩圖Fig.1 Protein Venndiagrams of four kinds of whitetea varieties

白茶中6 326個蛋白有2 492個蛋白被注釋到生物過程條目；2 639個蛋白被注釋到細胞組分條目；2 115個蛋白被注釋到分子功能條目。烏龍茶中5 947個蛋白有2 373個蛋白被注釋到生物過程條目；2 509個蛋白被注釋到細胞組分條目；2 036個蛋白被注釋到分子功能條目。紅茶中3 919個蛋白有1 601個蛋白被注釋到生物過程條目；1 699個蛋白被注釋到細胞組分條目；1 897個蛋白被注釋到分子功能條目。綠茶中5 578 個蛋白有2 152個蛋白被注釋到生物過程條目；2 311個蛋白被注釋到細胞組分條目；1 842個蛋白被注釋到分子功能條目。

四類茶中蛋白的GO功能注釋如圖2所示。生物過程中的前15個條目(圖2(a))中，四類茶蛋白涉及的生物過程之間差異不大，核酸代謝過程占比較大，其他過程依次遞減。細胞組分的前15個條目(圖2(b))中，四類茶蛋白涉及的細胞組分差異并不大，其中核和質體的占比較大，其他組分略低。分子功能的前10個條目(圖2(c))中，四類茶中紅茶蛋白涉及的分子功能略低于其他三類。

2.3 KEGG通路分析

對19種茶葉進行KEGG代謝通路分析，對部分代謝通路進行OPLS-DA分析，如圖3(a)所示。19種茶葉被劃分成四大類，這些通路中起主要貢獻值的前十條通路包括00941類黃酮生物合成，00620丙酮酸代謝，04626植物與病原體的相互作用，00260甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，00410 β-丙氨酸代謝，00270半胱氨酸和蛋氨酸代謝，00071脂肪酸降解，00280纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，00195光合作用，00900萜類骨架的生物合成。對10條通路中檢測到的蛋白進行統計，通過無標記定量方法得到每種蛋白在19種茶葉里的含量，對蛋白含量進行OPLS-DA分析，結果如圖3(b)所示。根據通路里涉及的蛋白含量，可將19種茶葉區(qū)分開，這些蛋白中起主要貢獻作用的前15個蛋白如表2所示。

1，核酸代謝過程；2，細胞蛋白質代謝過程；3，細胞大分子生物合成過程；4，含核堿基的化合物的生物合成過程；5，基因表達調控；6，細胞生物合成過程的調控；7，蛋白質修飾過程；8，高分子生物合成過程的調控；9，含核堿基的化合物代謝過程的調控；10，對其他生物的防御反應；11，羧酸代謝過程；12，磷酸化；13，對鎘離子的反應；14，對脫落酸的反應；15，大分子代謝過程的負調控(a) 生物過程

1，核；2，質體；3，核腔；4，液泡；5，胞間連絲；6，線粒體；7，葉綠體包膜；8，液泡膜；9，核仁；10，內質網；11，核糖體；12，質體類囊體膜；13，高爾基體；14，染色體；15，細胞骨架

1，焦磷酸酶活性；2，蛋白激酶活性；3，mRNA結合；4，過渡金屬離子結合；5，核酸內切酶活性；6，序列特異性DNA結合；7，核糖核苷酸結合；8，無機陽離子跨膜轉運蛋白活性、嘌呤核苷酸結合、ATP酶偶聯的跨膜轉運蛋白活性

(a) 茶葉分類

(b) 茶葉蛋白

3 結 論

提取了19種不同茶葉樣品中的蛋白進行組學分析，研究表明，19種茶葉中有4種(福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白)適制白茶，4種(悅茗香、黃觀音、毛蟹、鐵觀音)適制烏龍茶，3種(皖農95、櫧葉齊12、尖波黃13)適制紅茶，4種(鄂茶1號、鳧早2號、龍井43、中茶108)適制綠茶。提取蛋白經質譜檢測表明，19種茶葉中蛋白總數相差不大。白茶、烏龍茶、紅茶、綠茶這4類得到的數據進行GO注釋結果表明，生物過程中主要包括核酸代謝過程、細胞蛋白質代謝過程、細胞大分子生物合成過程、含核堿基的化合物的生物合成過程、基因表達調控等；細胞組分中主要包括核、質體、核腔、液泡、胞間連絲等；分子功能主要包括焦磷酸酶活性、蛋白激酶活性、mRNA結合、過渡金屬離子活性和核酸內切酶活性等。對19種茶葉得到的蛋白信息進行KEGG代謝通路分析，對感興趣的部分代謝通路進行了OPLS-DA分析，將19種茶葉劃分為四大類，與之前的研究相符，其中起主要貢獻作用的通路有類黃酮生物合成、丙酮酸代謝、植物與病原體相互作用、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸降解、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解、光合作用和萜類骨架的生物合成。

表2 19種茶葉中貢獻值較大的前15個蛋白Tab.2 The top 15 proteins with larger contributions in 19 kinds of teas