王 森 森， 平 清 偉， 盛 雪 茹， 李 娜， 張 健

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

高效液相色譜法(HPLC)可用于試樣中混合物質(zhì)的分析[1-2]，常用于生物質(zhì)組分的分離和檢測(cè)[3]，比如單糖檢測(cè)、原料成分和聚糖的降解分析等[4-6]。市場(chǎng)上HPLC法檢測(cè)糖類的色譜柱多以進(jìn)口為主，價(jià)格昂貴。國產(chǎn)氨基柱pH耐受范圍更廣，使用和再生條件相對(duì)簡單，可做正相也可做反相使用，價(jià)格也比較低廉[7]。C-18柱價(jià)格相對(duì)便宜，應(yīng)用廣泛[8]。進(jìn)口C-18色譜柱經(jīng)常被用于脂肪酸的檢測(cè)[9]，國產(chǎn)C-18色譜柱檢測(cè)乙醇水溶液中的乙酸時(shí)會(huì)受到乙醇的嚴(yán)重干擾[10]。

生物質(zhì)乙醇法精煉具有溶劑可回收、綠色無污染、效益高等優(yōu)點(diǎn)，一直備受矚目[11-12]。我國盛產(chǎn)竹子，撐篙竹在我國廣東、河北、江西都有廣泛分布[13]。撐篙竹乙醇法精煉液中富含甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸和各種降解糖，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其中也含有乙醇，會(huì)對(duì)HPLC法測(cè)量小分子脂肪酸含量帶來干擾。本研究使用國產(chǎn)氨色譜柱和C-18色譜柱分別檢測(cè)撐篙竹乙醇法精煉水解液中降解單糖與小分子脂肪酸含量，以期為用HPLC法測(cè)試含乙醇的小分子脂肪酸樣品提供借鑒。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要原料與試劑

竹片(韶關(guān)市)，平衡水分密封；磷酸、乙腈、甲醇、乙醇，均為色譜純?cè)噭?/p>

1.2 撐篙竹乙醇法精煉

將竹片和50%(體積比)乙醇水溶液按液比1∶10(g/mL)放入高溫反應(yīng)釜中，在185 ℃保溫240 min后冷卻至40 ℃，放出漿料，用40 ℃左右50%乙醇水溶液洗滌干凈，收集精煉液。所得漿料風(fēng)干后密封。

1.3 水解單糖的制備

參照文獻(xiàn)[8]方法水解原料和漿料，用HPLC法測(cè)水解單糖量(mg/L)并按公式(1)計(jì)算糖降解率。

(1)

1.4 小分子脂肪酸的提取

精煉液成分十分復(fù)雜[14]，不能直接測(cè)量小分子脂肪酸含量。取50 mL精煉液，減壓旋蒸得到餾分，定容至50 mL。該餾分中含乙醇、水和甲酸、乙酸等小分子脂肪酸。

1.5 HPLC法測(cè)定單糖和小分子脂肪酸

1.5.1 流動(dòng)相配制

參照文獻(xiàn)[15]方法和進(jìn)口色譜柱測(cè)試經(jīng)驗(yàn)，配制不同種類、不同體積比的流動(dòng)相。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)糖液、標(biāo)準(zhǔn)酸液配制

分別配制1、2、4、6和8 g/L葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖的標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液各50 mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別配制5、10、20、40和80 mL/L甲酸、乙酸和丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 單糖和小分子脂肪的測(cè)定

使用高效液相色譜儀(Waters公司)測(cè)定單糖和小分子脂肪酸。單糖用國產(chǎn)氨基柱(填料：Hypersil NH2-S 5 μm；柱長：250 mm；管徑：4.6 mm)測(cè)量，小分子脂肪酸用國產(chǎn)C-18柱(填料：Supersil ODS-B 5 μm；柱長：250 mm；管徑：4.6 mm)測(cè)量。與進(jìn)口某品牌糖柱和C-18柱的測(cè)試結(jié)果對(duì)比，分別計(jì)算單糖和酸的相對(duì)偏差率。

單糖的相對(duì)偏差率=[(a-b)/a]×100%

(2)

酸的相對(duì)偏差率=[(c-d)/c]×100%

(3)

式中：a、b為國產(chǎn)氨基柱和進(jìn)口糖柱的糖降解率，按式(1)計(jì)算；c、d分別為國產(chǎn)和進(jìn)口C-18柱測(cè)得的酸濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 國產(chǎn)氨基柱糖分離條件的優(yōu)化

表1為國產(chǎn)氨基柱檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)單糖的條件和出峰時(shí)間。出峰時(shí)間差越大，分離效果越好。

2.1.1 流動(dòng)相種類的影響

表1中編號(hào)A、B、C的流動(dòng)相為甲醇-水和乙醇-水時(shí)標(biāo)準(zhǔn)糖出峰效果都不理想。流動(dòng)相為乙腈-水可以使葡萄糖和木糖分開，但阿拉伯糖和半乳糖沒有分開。乙腈-水的效果相對(duì)較好，用乙腈-水為流動(dòng)相。

2.1.2 流動(dòng)相比例的影響

表1中編號(hào)D、E流動(dòng)相乙腈和水體積比為80∶20時(shí)標(biāo)準(zhǔn)糖出峰不好，體積比為77∶23時(shí)，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖可以分開，與75∶25(編號(hào)C)相比，雖然Δt1(t2-t1)、Δt2(t3-t2)更大一些，但此時(shí)木糖與阿拉伯糖峰有拖尾現(xiàn)象，因此流動(dòng)相體積比固定為75∶25。

2.1.3 測(cè)試溫度的影響

表1中編號(hào)F、C、G、H的測(cè)試溫度分別為20、25、30和35 ℃?？梢钥闯?，溫度對(duì)出峰時(shí)間影響較大，溫度越高出峰時(shí)間越早，且溫度高分離效果會(huì)變好一些。35與30 ℃相比，雖然出峰略好，但溫度越高柱壓越高，不利于色譜柱的使用與再生，因此選擇30 ℃測(cè)試溫度進(jìn)行研究。

2.1.4 體積流量的影響

表1中編號(hào)I、J、H、K的體積流量由0.8 mL/min 升至1.2 mL/min。體積流量越大，出峰越早，但阿拉伯糖與半乳糖峰都有重疊，考慮到體積流量越低測(cè)試時(shí)間越長，測(cè)試效率越低，因此固定體積流量為1.0 mL/min。

表1 國產(chǎn)氨基柱單糖檢測(cè)條件Tab.1 Detection conditions of monosaccharides by domestic amino column

2.1.5 進(jìn)樣體積的影響

表1中編號(hào)G、L1、L2研究了進(jìn)樣體積對(duì)糖分離效果的影響(流動(dòng)相為乙腈-水，體積比75∶25，體積流量1.0 mL/min，時(shí)間15 min，溫度30 ℃)。從表1中可以看出，進(jìn)樣體積從20 μL 減少至10和1 μL后，4種糖分離效果變好，進(jìn)樣體積10和1 μL出峰時(shí)間相同。從圖1中也可以看出，進(jìn)樣10 μL的基線不如進(jìn)樣1 μL平穩(wěn)，進(jìn)樣1 μL效果最佳。

G，進(jìn)樣20 μL；L2，進(jìn)樣1 μL圖1 進(jìn)樣體積對(duì)單糖的分離效果Fig.1 The effect of injection volume on the separationof monosaccharides

國產(chǎn)氨基柱HPLC法測(cè)量單糖的較優(yōu)條件為：乙腈-水為流動(dòng)相，體積比75∶25，進(jìn)樣體積1 μL，體積流量1.01 mL/min，時(shí)間15 min，溫度30 ℃。用加標(biāo)法得到定量計(jì)算單糖的線性回歸方程。由表2可知，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖對(duì)應(yīng)的線性方程都有較好相關(guān)系數(shù)，R2≥0.998。

表2 4種標(biāo)準(zhǔn)單糖定量計(jì)算的線性回歸方程Tab.2 Linear regression equation for quantitative calculationof four standard monosaccharides

2.2 國產(chǎn)C-18柱測(cè)定小分子脂肪酸

國產(chǎn)C-18柱檢測(cè)小分子脂肪酸的條件見表3。表3中，編號(hào)M～Q檢測(cè)條件參照進(jìn)口C-18柱色譜柱測(cè)定小分子脂肪酸常用條件制定[9]。

國產(chǎn)C-18柱在編號(hào)M～Q條件下，甲酸出峰效果都很差，基線不穩(wěn)且有拖尾現(xiàn)象。降低流動(dòng)相中乙腈的比例至70%(編號(hào)R)，出峰效果未見好轉(zhuǎn)(圖2)。

表3中編號(hào)S～W為國內(nèi)釀酒行業(yè)檢測(cè)乙醇中甲酸、乙酸含量所用條件[10]。編號(hào)S、U的甲酸出峰效果雖然有所好轉(zhuǎn)，但基線仍然不穩(wěn)定，且有拖尾現(xiàn)象(圖3)。

繼續(xù)降低乙腈比例，減至60%(編號(hào)X)時(shí)，甲酸出峰效果明顯變好(圖4)。

表3 國產(chǎn)C-18柱小分子脂肪酸檢測(cè)條件Tab.3 Detection conditions and preliminary results ofsmall fatty acidby domestic C-18 column

圖2 編號(hào)R的甲酸出峰效果Fig.2 The peak of No.R formic acid

圖3 編號(hào)S、U的甲酸出峰效果Fig.3 The peaks of No.S and No.U formic acids

將配制的甲酸、乙酸、丙酸和乙醇混合溶液繼續(xù)降低流動(dòng)相乙腈的比例至50%，進(jìn)樣量也減小到1 μL(編號(hào)Z)，甲酸、乙酸和丙酸的分離效果好且無乙醇干擾峰(圖5)。

圖4 編號(hào)X的甲酸出峰效果Fig.4 The peak of No.X formic acid

圖5 編號(hào)Z 3種酸的分離效果Fig.5 The peaks of three types of No.Z acids

國產(chǎn)C-18柱LPLC法測(cè)量含乙醇的小分子脂肪酸混合液較優(yōu)測(cè)量條件：流動(dòng)相乙腈與水體積比50∶50，進(jìn)樣體積1 μL，時(shí)間15 min，體積流量0.6 mL/min，溫度25 ℃。用加標(biāo)法得到脂肪酸定量計(jì)算線性回歸方程見表4。

表4 甲酸、乙酸和丙酸的定量計(jì)算Tab.4 Quantitative calculations of formic， aceticand propionic acids

2.3 與進(jìn)口色譜柱實(shí)際測(cè)試對(duì)比分析

2.3.1 精煉液中糖降解情況

國產(chǎn)氨基柱按優(yōu)化好的條件測(cè)量原料、漿料水解液中的單糖，進(jìn)口糖柱按表2中編號(hào)A條件測(cè)量。糖的降解率和相對(duì)偏差如表5所示。兩種色譜柱都只檢測(cè)到了葡萄糖和木糖。國產(chǎn)色譜柱與進(jìn)口色譜柱相比，兩者木糖的相對(duì)偏差率較小，葡萄糖的相對(duì)偏差率略大，但偏差率絕對(duì)值都在5%以內(nèi)。國產(chǎn)氨基柱用于HLPC法檢測(cè)生物質(zhì)水解液中混合單糖含量比較可靠。

表5 降解糖的檢測(cè)結(jié)果Tab.5 The detecting results of degraded sugars

2.3.2 精煉液中小分子脂肪酸含量

按優(yōu)化好的小分子脂肪酸檢測(cè)方案，用國產(chǎn)C-18柱檢測(cè)撐篙竹乙醇法精煉液中小分子脂肪酸含量。與用進(jìn)口C-18柱(表4中編號(hào)M方案)的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，兩種色譜柱都檢測(cè)到了乙酸、甲酸和丙酸，酸的相對(duì)偏差如表6所示。國產(chǎn)C-18柱與進(jìn)口C-18柱相比，兩者乙酸和甲酸的相對(duì)偏差率較小，絕對(duì)值都在5%以內(nèi)。丙酸的相對(duì)偏差率較大，絕對(duì)值在5%以上，原因是樣品中丙酸濃度很低，極小的絕對(duì)誤差就可能造成相對(duì)偏差率增大。初步研究結(jié)果表明，國產(chǎn)C-18柱可用于HLPC法檢測(cè)生物質(zhì)水解液中甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸的含量。

表6 甲酸、乙酸和丙酸的檢測(cè)結(jié)果Tab.6 The detecting results of formic， acetic andpropionic acids

3 結(jié) 論

國產(chǎn)氨基色譜柱、國產(chǎn)C-18色譜柱可用于檢測(cè)撐篙竹乙醇法蒸煮過程中糖的降解情況、小分子脂肪酸的生成情況，與進(jìn)口色譜柱相比，檢測(cè)結(jié)果可靠，相對(duì)偏差率較小。

國產(chǎn)氨基色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，在體積比75∶25、進(jìn)樣體積1 μL、體積流量1.01 mL/min、時(shí)間15 min和檢測(cè)溫度30 ℃的條件下，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物質(zhì)水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的定性、定量檢測(cè)。

國產(chǎn)C-18色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，在體積比50∶50、進(jìn)樣體積1 μL、體積流量0.6 mL/min、時(shí)間15 min和檢測(cè)溫度25 ℃的條件下，可以在含乙醇生物質(zhì)水解液中實(shí)現(xiàn)對(duì)甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸的定性、定量檢測(cè)。