魯彥伽，孫 虹，吳振芳，雷 鳴

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，上海 200125

端粒是真核細胞線性染色體末端的保護性結(jié)構(gòu)，由特定的DNA重復(fù)序列和蛋白質(zhì)組分構(gòu)成，在維持基因組的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用［1］。Shelterin復(fù)合物是一種結(jié)合在端粒DNA上的復(fù)合物，由多種亞基構(gòu)成。它與不同的復(fù)合物相互作用，通過精細的調(diào)控，使得端粒長度始終維持在穩(wěn)定的狀態(tài)［2］。人源Shelterin復(fù)合物由TRF1（telomeric repeat binding factor 1）、TRF2、TⅠN2（TRF1-interacting nuclear factor 2）、RAP1（repression/activation protein 1）、 TPP1 （adrenocortical dysplasia protein homolog，又稱ACD）、POT1（protection of telomeric protein 1）6種組分構(gòu)成，這些組分通過廣泛的相互作用，抑制多種DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，調(diào)節(jié)端粒酶與端粒DNA的結(jié)合，維持端粒的穩(wěn)態(tài)［3］。除此之外，Shelterin復(fù)合物還會配合細胞周期的進程，保證端粒DNA復(fù)制的正常進行［4］。由于Shelterin復(fù)合物在維持端粒穩(wěn)態(tài)方面的重要性，其組分結(jié)構(gòu)和功能上的異常，都會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。例如在人類的乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)Shelterin復(fù)合物的各種組分表達異常增高［5］，在其他多種腫瘤細胞中檢測到Shelterin組分的突變［6］，這些變化大多會造成Shelterin復(fù)合物與DNA鏈之間或是Shelterin組分之間的相互作用遭到破壞，最終導(dǎo)致染色體脫帽，端粒DNA暴露在含有端粒酶以及多種損傷響應(yīng)因子的環(huán)境中，促使癌癥的發(fā)生［5，7］。

對Shelterin復(fù)合物結(jié)構(gòu)的清晰認(rèn)識能夠極大地推進對慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）［8］、先天性角化不良（dyskeratosis congenita，DKC）［9］等由Shelterin 組分功能異常導(dǎo)致的端粒相關(guān)疾病的認(rèn)識，以及相應(yīng)治療手段的研究進展。有研究表明，Shelterin 組分之間的相互作用是通過一種高度保守的“domain-peptide”（結(jié)構(gòu)域?qū)﹄亩危┑臋C制來達成的［10-11］，即一種Shelterin組分可以通過同一結(jié)構(gòu)域中的保守殘基與多種蛋白質(zhì)相互作用。這種相互作用機制不僅利于小分子藥物的設(shè)計和開發(fā)［12］，更是賦予了Shelterin 復(fù)合物較高的進化可塑性［11］。 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe，S. pombe） 在進化上相對緩慢，相較于芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）來說，還留有許多后生生物的特性。正因如此，裂殖酵母在染色體的保護機制上與高等哺乳動物具有較高的同源性［13-14］。裂殖酵母的Shelterin 復(fù)合物由Taz1（telomere length regulator taz1）、Rap1、Poz1 （Pot1-associated protein Poz1）、Ccq1 （coiled-coil quantitatively-enriched protein 1）、Tpz1（telomere-protecting protein）、Pot1 6 個組分組成，在結(jié)構(gòu)和功能上與人源Shelterin復(fù)合物都高度保守［15］。近年來也有不少以裂殖酵母的Shelterin復(fù)合物為研究對象，進行相關(guān)疾病起源的研究以及藥物研發(fā)的實例?；诹阎辰湍窽pz1-Pot1 之間和人源TPP1-POT1之間相互作用的保守性，通過Tpz1-Pot1生化和結(jié)構(gòu)特性的研究結(jié)果，推測人類黑色素瘤相關(guān)的POT1 突變（A532P）位于TPP1-POT1 界面，該突變引起的TPP1-POT1相互作用缺失可能是導(dǎo)致端粒異常延長的原因［16］；利用人源POT1以及裂殖酵母Pot1結(jié)構(gòu)的高度相似性，以裂殖酵母Pot1 與單鏈DNA 結(jié)合復(fù)合物為對象進行藥物篩選，成功篩選到了一種能打斷Pot1與單鏈DNA 相互作用的小分子抑制劑［17］。這些治療手段與抑制端粒酶活性的治療方式聯(lián)合，能夠在一定程度上克服癌細胞對藥物的耐受性，有望顯著提高藥物對多種癌癥的治療效果［18］。

近20 年來Shelterin 復(fù)合物中多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)已獲得解析［19-24］。然而，Shelterin復(fù)合物在體內(nèi)具有高度的異質(zhì)性——各亞基間可能形成不同組合的亞復(fù)合物，參與不同的調(diào)控反應(yīng)［25］；同時，Shelterin 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)具有較大的可變性，這些因素都極大地阻礙了完整Shelterin復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)的解析。本實驗室之前的工作已解析了裂殖酵母Shelterin三元復(fù)合物（Rap1-Poz1-Tpz1）的晶體結(jié)構(gòu)［19］，在此基礎(chǔ)上本研究采用在體外重組并表達裂殖酵母Shelterin復(fù)合物的方法，通過兩步親和層析、凝膠過濾層析等蛋白質(zhì)純化流程、負(fù)染技術(shù)、電子顯微鏡（電鏡）以及單顆粒重構(gòu)技術(shù)，最終獲得了裂殖酵母Shelterin五元復(fù)合物Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1 的低分辨率三維結(jié)構(gòu)模型，為解析高分辨率的Shelterin復(fù)合物結(jié)構(gòu)奠定了堅實的基礎(chǔ)，對理解整個復(fù)合物的組裝方式及其發(fā)揮功能的分子機制具有重要的意義，同時也將為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 表達質(zhì)粒與菌株 pGEX-6P1 以及pET-28ASm2 克隆載體均由本實驗室保管，其中pET-28AS-m2為本實驗室基于pET-28a（+）改造的質(zhì)?！镁幋a小分子泛素相關(guān)修飾物蛋白（small ubiquitin related modifier，SUMO） 序列替換原pET-28a（+） 中的ACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGC 序列。用于質(zhì)粒擴增的大腸埃希菌（E. coli）DH5α 以及用于蛋白質(zhì)表達的E.coliBL21（DE3）菌株由本實驗室保管。

1.1.2 主要試劑以及儀器 LB 培養(yǎng)基購于青島生工生物科技有限公司，鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）購于德國Qiagen 公司，谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（glutathione sepharose 4B）購于美國GE 公司，甲酸雙氧鈾購于美國TED PELLA 公司，氨芐青霉素、 卡納霉素、 氯化鈉（NaCl）、 甘油（glycerol）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，ⅠPTG）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、亮抑肽酶（leupeptin）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，考馬斯亮藍G250 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。本實驗使用的His-ULP1（帶組氨酸標(biāo)簽的SUMO 蛋白酶）以及谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶3C酶（GST-3C）均由實驗室表達、純化及保存。

高壓細胞破碎儀（FB-110X）購于上海勵途超高壓設(shè)備有限公司，高速離心機（Beckman Avanti JXN26）購于美國Beckman Coulter 公司，超聲波清洗器（SB-5200DTN）購于寧波新芝生物科技有限公司，垂直電泳儀（Mini-PROTEAN Tetra Cell）購于Bio-Rad（中國）公司，控溫振蕩培養(yǎng)箱（YR101）購于上海西雷生物有限公司，快速蛋白質(zhì)液相色譜（fast protein liquid chromatography， FPLC） 系統(tǒng)（?KTATMpure）和SuperoseTM6 10/300 GL 層析柱購于美國GE 公司，普通碳支持膜（BZ1102XX）購于北京中鏡科儀有限公司，透射電子顯微鏡（Talos L120C）購于美國FEⅠ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 從Shelterin復(fù)合物各亞基間的相對位置關(guān)系（圖1A），復(fù)合物各組分之間的相互作用情況（圖1B），以及本實驗室已發(fā)表的實驗數(shù)據(jù)來看，Poz1全長蛋白質(zhì)中的71～83位肽段不利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定純化［19］；我們在本次構(gòu)建中去除了這段序列（本文仍簡稱Poz1），并在Poz1的羧基端引入編碼融合蛋白質(zhì)柔性連接——（GGS）2肽段的序列，再利用該連接將Poz1的C端與Rap1PBM（Rap1上與Poz1相互作用的區(qū)域，氨基酸殘基：465～491）的氨基端相連，構(gòu)建出融合蛋白質(zhì)Poz1-Rap1PBM［相對分子質(zhì)量（Mr）30 000］。同樣地，通過從氨基端到羧基端依次排列Tpz1PⅠM（Tpz1 上與Pot1 相互作用的區(qū)域，氨基酸殘基：167～240）、Tpz1CBM-Tpz1PBM（Tpz1 上與Ccq1 相互作用的區(qū)域-Tpz1 上與Poz1 相互作用的區(qū)域，氨基酸殘基：425～509），構(gòu)建Tpz1ⅠNT（Mr17 000），2個片段用（GGS）2肽段連接。將Pot1FL（Pot1全長蛋白質(zhì)，Mr61 000）、Poz1-Rap1PBM和Ccq1TAD（Ccq1上與Tpz1相互作用的區(qū)域，氨基酸殘基：123～439，Mr34 000）3 段序列分別構(gòu)建于pET-28AS-m2 克隆載體，使它們各自氨基端帶上His-SUMO純化標(biāo)簽；Tpz1ⅠNT構(gòu)建于pGEX-6P1 克隆載體，使其氨基端帶上谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）純化標(biāo)簽（圖1C）。

圖1 裂殖酵母Shelterin復(fù)合物各組分重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig 1 Construction of recombinant plasmids of each component of S.pombe Shelterin complex

1.2.2 蛋白質(zhì)表達與純化 將Tpz1ⅠNT與Pot1FL共同轉(zhuǎn)化進E. coliBL21 （DE3），Poz1-Rap1PBM以及Ccq1TAD單獨轉(zhuǎn)化進BL21（DE3）。挑取單個菌落至對應(yīng)抗性的LB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃活化12 h。將活化好的菌體轉(zhuǎn)接至1 L 對應(yīng)抗性的LB 液體培養(yǎng)基。接種比例為菌種∶培養(yǎng)基=1∶100。每次搖菌6 L，包括3 L Tpz1ⅠNT和Pot1FL共表達菌、2 L Poz1-Rap1 融合蛋白質(zhì)表達菌和1 L Ccq1TAD表達菌。

在37 ℃下培養(yǎng)至吸光度值為0.8，降溫至18 ℃后，加入ⅠPTG（終濃度為0.2 mmol/L）誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達18 h。然后以3 990×g、25 ℃離心15 min，收集菌體。用lysis buffer吹懸菌體，直至無細菌團塊。向懸液中添加終濃度為1 mmol/L 的PMSF、1 μg/mL 的亮抑肽酶并混勻，于高壓均質(zhì)機中徹底裂解并取樣。裂解后的樣品立刻于39 190×g、4 ℃離心45 min，收集上清液并取樣。然后，將收集的上清液與Ni-NTA于4 ℃低轉(zhuǎn)速結(jié)合1 h。離心收集Ni-NTA 于層析柱，收集流穿液并取樣。之后用wash buffer Ⅰ清洗雜蛋白質(zhì)并取樣。洗雜期間，用考馬斯亮藍G250 實時監(jiān)測雜蛋白質(zhì)的洗脫情況，待考馬斯亮藍G250 幾乎不再變藍后，用elution buffer Ⅰ洗脫并收集目的蛋白質(zhì)，取樣。然后立刻用His-ULP1 于4 ℃酶切處理洗脫液，去除所有蛋白質(zhì)氨基端的His-SUMO標(biāo)簽。

在His-ULP1酶切進行6 h后，取樣。直接加入谷胱甘肽瓊脂糖凝膠進行第2 步的親和層析，于4 ℃低速旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h。4 h 后，將谷胱甘肽凝膠轉(zhuǎn)移至層析柱，收集流穿液，并取樣。然后用wash buffer Ⅱ徹底清洗雜蛋白質(zhì)，將谷胱甘肽凝膠轉(zhuǎn)移至干凈的50 mL管，于4 ℃下用GST-3C 酶低轉(zhuǎn)速過夜處理谷胱甘肽瓊脂糖凝膠，將Tpz1 蛋白質(zhì)氨基端GST 標(biāo)簽以及GST-3C 酶與目的蛋白質(zhì)完全分開。將目的蛋白質(zhì)留在流穿液里，而將GST 標(biāo)簽和酶留在谷胱甘肽凝膠上。10 h 后200×g離心收集上清液并取樣，將純化各步驟留取的樣品行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。檢查純化各步驟樣品蛋白質(zhì)組成的變化情況。

在目的蛋白質(zhì)樣品中加入DTT （終濃度為2 mmol/L），用截留Mr為100 000 的超濾濃縮管將蛋白質(zhì)體積濃縮至1 mL，并于21 130×g離心10 min 后，取上清液，使用SuperoseTM6 10/300 GL 與FPLC buffer，以0.4 mL/min 的流速分離純化蛋白質(zhì)。根據(jù)出峰情況，利用SDS-PAGE檢測出峰位置對應(yīng)收集管內(nèi)的蛋白質(zhì)組成狀況。上述緩沖液配方見表1。

表1 緩沖液配方Tab 1 Buffer recipes

1.2.3 電鏡樣品制作、觀察以及數(shù)據(jù)處理 將銅網(wǎng)碳膜覆蓋面向上，經(jīng)過真空放電親水化處理后使用。取5 μL 稀釋后的蛋白質(zhì)樣品滴于銅網(wǎng)中心（碳膜面朝上），等待樣品吸附1 min，用濾紙邊緣吸走多余的液體。將3 個5 μL 0.75%（質(zhì)量體積濃度）甲酸雙氧鈾染液滴置于疏水薄膜，銅網(wǎng)碳膜面朝下蘸取染液，并立刻吸走多余染液，重復(fù)2 次。最后，吸取5 μL 染液靜置染色1 min，用濾紙吸取多余的染液。然后將銅網(wǎng)碳膜朝上置于濾紙上，65 ℃照射5 min，至銅網(wǎng)完全干燥。將干燥的樣品用120 kV 透射電鏡觀察，放大倍數(shù)設(shè)置為92 000 倍，欠焦值為-2～-1 μm，選擇襯度好、顆粒分散性好、形態(tài)均一、濃度合適的區(qū)域收集數(shù)據(jù)。每張照片拍攝的位置的中心應(yīng)間隔至少2 μm，以確保每張照片的視野沒有重疊的區(qū)域，收集到的顆粒均不重復(fù)。將收集的原始圖片數(shù)據(jù)用EMAN2 軟件進行顆粒抽取，然后從EMAN2 軟件中將抽取顆粒的圖像和位置信息全部導(dǎo)入RELⅠON3.0 軟件，經(jīng)過對采集數(shù)據(jù)的處理最終產(chǎn)生一個目的復(fù)合物的三維重構(gòu)模型。

1.2.4 Shelterin復(fù)合物結(jié)構(gòu)初步分析 將獲得的三維重構(gòu)模型與已發(fā)表的裂殖酵母亞復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)進行擬合。亞復(fù)合物Rap1PBM-Poz1-Tpz1PBM（PDBⅠD：5XXF）、Ccq1TAD-Tpz1CBM（PDB ⅠD：7CUJ）、Pot1OB3-Tpz1PⅠM（PDB ⅠD：7CUⅠ）、Pot1OB1-OB2（PDBⅠD：7CUH）高分辨率結(jié)構(gòu)均由PDB 數(shù)據(jù)庫檢索獲得。將上述結(jié)構(gòu)導(dǎo)入USFC Chimera 軟件，與我們所獲得的重構(gòu)模型進行擬合，以推測各組分在整個Shelterin復(fù)合物中大致的分布以及取向情況。

2 結(jié)果

2.1 Shelterin復(fù)合物的表達與純化結(jié)果

E. coli體系經(jīng)18 ℃誘導(dǎo)，能大量表達目的蛋白質(zhì)。經(jīng)過Ni-NTA 親和層析，除去了大量雜蛋白質(zhì)，但可以看出，洗脫后的樣品純度依然不高。之后，經(jīng)過His-ULP1處理以及谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析，可以獲得純度較高的樣品（圖2A）。為獲得性質(zhì)均一的蛋白質(zhì)樣品，我們又將獲得的樣品濃縮至1 mL后，以0.4 mL/min 的流速進行SuperoseTM6 10/300 GL 凝膠過濾層析，最終得到了性質(zhì)均一，并且組分齊全、比例合適的樣品，目的蛋白質(zhì)在SuperoseTM6 10/300 GL分子篩上大量被洗脫的體積為15.16 mL（圖2B），經(jīng)SDS-PAGE 檢測對應(yīng)出峰位置的蛋白質(zhì)樣品組成情況，可以證明蛋白質(zhì)樣品純度較高、組分齊全且比例合適（圖2C）。

圖2 裂殖酵母Shelterin復(fù)合物的體外表達與純化Fig 2 Expression and purification of S.pombe Shelterin complex in vitro

2.2 電鏡數(shù)據(jù)收集與處理

從120 kV 電鏡的視野下觀察被甲酸雙氧鈾覆蓋的樣品，可以看見，蛋白質(zhì)顆粒的形態(tài)被染鹽襯托得較為清晰，顆粒與顆粒之間的距離合適。顆粒直徑約為15 nm，結(jié)合凝膠過濾層析結(jié)果，推測所純化出的復(fù)合物為二聚體。在視野中能看見存在不同角度投影的形態(tài)信息，這說明蛋白質(zhì)顆粒的多角度數(shù)據(jù)都能被收集（圖3A）?？梢酝ㄟ^后期的數(shù)據(jù)計算，獲得較為立體的顆粒結(jié)構(gòu)信息。在92 000倍的放大倍數(shù)下，每張照片采集間隔2 μm 的距離，收集到負(fù)染圖片83 張，用EMAN2 軟件［26］挑選了18 659 個顆粒，然后使用Relion3.0 軟件［27］對所有的顆粒進行2D 分類（圖3B）、初始模型構(gòu)建、以及3D 分類和3D 優(yōu)化處理獲得Shelterin五元復(fù)合物的負(fù)染三維結(jié)構(gòu)模型。使用USCF Chimera 軟件對計算出的模型進行評測，可以看出目的蛋白質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)特征明顯，三維重構(gòu)效果良好（圖3C），挑選出的顆粒角度分布均勻（圖3D）。

2.3 Shelterin復(fù)合物結(jié)構(gòu)初步分析

3D 分類后的每個分組的顆粒個數(shù)基本均勻，選擇其中結(jié)構(gòu)形態(tài)各部分過渡最均勻的為模版進行優(yōu)化處理，最終獲得一個分辨率為17 ?（1 ?=0.1 nm）的三維模型（圖4A），整個蛋白質(zhì)復(fù)合物大小為145 ?×120 ?×110 ?（圖4B）。然后我們利用UCSF Chimera軟件［28］將PDB 數(shù)據(jù)庫［29］中已有的裂殖酵母相關(guān)高分辨率Shelterin亞復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與我們獲得的模型進行擬合和匹配。

根據(jù)近年來發(fā)表的多種裂殖酵母Shelterin 亞復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息可以得知：①Rap1PBM-Poz1-Tpz1PBM可以通過Poz1 的N 端前2 個α 螺旋形成反向平行的二聚體［19］。②在Ccq12-439-Tpz1406-508-Poz1FL復(fù)合物中通過基于雙琥珀酰亞胺亞砜（disuccinimidyl sulfoxide，DSSO）的交聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定出Ccq1 的N端（氨基酸殘基：2～439）與Poz1 之間有廣泛的相互作用［30］，并且在Tpz1 組分中與Ccq1 以及Poz1 產(chǎn)生相互作用的2 個結(jié)構(gòu)域Tpz1CBM、Tpz1PBM緊密相鄰。這說明，Ccq1 與Poz1 組分在空間位置上相近。③有相關(guān)的負(fù)染電鏡結(jié)果表明，在Ccq12-439-Tpz1406-508-Poz1FL二聚體中，2 個Ccq1 組分由于缺失C 端結(jié)構(gòu)域，會采取相對自由的取向［30］。所以，在我們進行匹配的模型中，將2 個Poz1-Tpz1PBM組分放在空間結(jié)構(gòu)上接近的位置，2 個Ccq1TAD分別放在與2 個Poz1 相近的位置。然后，由于Tpz1PⅠM和Tpz1CBM通過（GGS）2肽段連接，所以在匹配過程中我們將與Tpz1PⅠM有相互作用的Pot1OB3-Tpz1PⅠM，以及與Tpz1CBM有相互作用的Ccq1TAD-Tpz1CBM放置在相近的位置。最后，將Pot1OB1-OB2組分放置在整個結(jié)構(gòu)中相對獨立、占比大、且有對稱傾向的“三角形”的兩邊。從分子對接結(jié)果可以說明所有高分辨率結(jié)構(gòu)與重構(gòu)模型匹配情況良好，進而大致確定了各亞基在重構(gòu)模型中的相對位置（圖4C）。

圖4 Shelterin復(fù)合物三維重構(gòu)模型和各亞基的分子對接情況Fig 4 3D reconstruction of the Shelterin complex and docking of solved structures into the overall envelope

3 討論

Shelterin 復(fù)合物是結(jié)合在真核生物端粒區(qū)域，維持基因組穩(wěn)定的重要復(fù)合物［2］。它保護端粒，防止其被識別為雙鏈DNA 而發(fā)生斷裂，并能夠調(diào)控端粒酶的結(jié)合［3］，保證端粒DNA 復(fù)制正常進行［4］。正由于Shelterin復(fù)合物在端粒末端保護方面的重要性，其組分缺失、突變［31］或是復(fù)合物組分間相互作用的破壞［16］都會造成端粒功能紊亂，導(dǎo)致基因組穩(wěn)定性被嚴(yán)重破壞，進而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

最近幾十年以來，研究人員已經(jīng)從進化上、功能上、結(jié)構(gòu)上對多種生物的Shelterin復(fù)合物開展了廣泛的研究［3，11，32］。這些研究的成果對幫助我們理解端粒末端穩(wěn)態(tài)調(diào)控的具體機制提供了寶貴的理論依據(jù)。但是到目前為止，由于Shelterin復(fù)合物分子量巨大，并且在結(jié)構(gòu)上具有高度的可變性，所以尚未有完整的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)被解析出來。而Shelterin復(fù)合物行使調(diào)控端粒異染色質(zhì)形成［33］以及端粒酶結(jié)合等功能［34］，都要依賴于復(fù)合物的正確組裝。所以，對Shelterin復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)的解析，將會更全面地闡明其與端粒DNA 結(jié)合的情況，解釋Shelterin 整體復(fù)合物的組裝機制，從而便于從整體上來認(rèn)識Shelterin 復(fù)合物的功能。

我們之前的工作解析了裂殖酵母Shelterin三元復(fù)合物（Rap1-Poz1-Tpz1）的晶體結(jié)構(gòu)［19］，本研究在此基礎(chǔ)上采用在體外表達并重組裂殖酵母Shelterin復(fù)合物的方法，首次獲得了一個裂殖酵母Shelterin五元復(fù)合物（Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1）的低分辨率結(jié)構(gòu)。我們對已有的高分辨率復(fù)合物組裝方式進行分析，并將這些高分辨率結(jié)構(gòu)與我們獲得的重構(gòu)模型進行分子對接，大致確定了各組分在整個復(fù)合物中的分布情況。另外，我們的凝膠過濾層析結(jié)果與結(jié)構(gòu)模型直接說明了該復(fù)合物是一個二聚體，這對復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)的解析和組裝機制的揭示有重要的意義，也對理解Shelterin 復(fù)合物發(fā)揮功能的分子機制提供了重要線索。但為了解析復(fù)合物組分間具體的相互作用情況，我們還需要獲得更高分辨率的結(jié)構(gòu)信息。接下來，我們還需要著手篩選適合冷凍觀察Shelterin 復(fù)合物的條件，用冷凍電鏡來分析裂殖酵母Shelterin 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，獲得復(fù)合物的高分辨率信息，以更加精細地揭示Shelterin 復(fù)合物發(fā)揮各項調(diào)節(jié)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。