郝 磊，金 戈，楊涌濤，王軍偉，孫 洋，秦翠玲，展群嶺

重慶市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400062

腦卒中，尤其是缺血性腦卒中（ischemic stroke，ⅠS），是患者致殘、致死的重要病因之一［1］。炎癥伴隨著ⅠS的發(fā)生即刻開始。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）快速活化，作為其急先鋒（第一感受器）對(duì)炎癥的發(fā)生迅速作出免疫應(yīng)答，分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α， TNF- α）、 白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，ⅠL-6）、CD206 及ⅠL-10 等炎癥因子，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起到既損傷又保護(hù)的雙向作用［2］。MG 分為M1與M2型，不同類型的MG在ⅠS病程中發(fā)揮不同的作用。M1型分泌TNF-α、ⅠL-6等促炎癥因子，加重ⅠS 的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)、組織進(jìn)一步受損；M2 型分泌CD206、ⅠL-10等抗炎癥因子，參與受損神經(jīng)、組織的修復(fù)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用［3］?？梢?，調(diào)控MG向M2型轉(zhuǎn)化對(duì)ⅠS的治療具有重要意義［4］。但MG的M2型極化，目前尚缺乏有效的調(diào)控手段。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）已廣泛用于受損組織的治療，包括ⅠS 的救治［5］，其作用主要由MSCs 旁分泌的外泌體（exosomes，Exo）予以實(shí)現(xiàn)［6-7］。Exo 是細(xì)胞質(zhì)膜萌芽到胞外基質(zhì)中的一種膜囊泡，是介導(dǎo)細(xì)胞間對(duì)話的重要因子［8］。MSCs 旁分泌的 Exo 可致 M1 型巨噬細(xì)胞（macrophage，MP）與M1型MG轉(zhuǎn)化為M2型，促使ⅠS受損神經(jīng)的修復(fù)［9］。

微RNA （microRNA，miRNA） 具有高度保守性、高度組織特異性和相對(duì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及氧化應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］，被認(rèn)為是組織損傷的潛在生物標(biāo)志物［11-12］。受損神經(jīng)的重塑有多種miRNA 參與，其中，miR-124-1 可調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowmesenchymal stem cells，BMMSCs）的分化［13］，還可調(diào)控MG、MP 向M2 型轉(zhuǎn)化［14-15］，在包括ⅠS 修復(fù)過(guò)程的神經(jīng)發(fā)育及其功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步提升MG 的M2 型極化調(diào)控效能，以利于ⅠS 患者的神經(jīng)修復(fù)，本實(shí)驗(yàn)先分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠BMMSCs 及其Exo（BMMSCs-Exo），然后構(gòu)建miR-124-1 基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體，將過(guò)表達(dá)miR-124-1 基因的BMMSCs-Exo（Exo/124-1）與經(jīng)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）活化的HAPⅠ小膠質(zhì)細(xì)胞株（HAPⅠ細(xì)胞，一種MG）共培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （quantitative real-time PCR， qPCR） 和Western blotting分別檢測(cè)HAPⅠ細(xì)胞的M1型分子（ⅠL-6、TNF-α）與M2型分子（CD206、ⅠL-10）的mRNA及其蛋白的表達(dá)變化。本實(shí)驗(yàn)旨在為研究BMMSCs通過(guò)其Exo攜帶miR-124-1基因調(diào)控MG的M2型極化在介導(dǎo)ⅠS神經(jīng)重塑中的可能的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 分離BMMSCs 用SD 大鼠28 只［購(gòu)自中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心］，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）20170002，使用許可證號(hào)為SYXK（渝）20170002。大鼠體質(zhì)量200 g 左右，雌雄均有，于常規(guī)恒濕、恒溫的SPF 級(jí)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料與無(wú)菌水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶市第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2020CQSDWRMYYEC-dw001）。

HAPⅠ細(xì)胞購(gòu)自深圳華拓生物科技有限公司。293T 細(xì)胞由中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)復(fù)合傷研究所儲(chǔ)存與惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；TNF-α、ⅠL-6、CD206、ⅠL-10 及CD9 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；CD90、CD44 及CD45 抗體購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司；CD63 抗體購(gòu)自美國(guó)Scbt 公司；qPCR 檢測(cè)引物由中國(guó)上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)與合成，其檢測(cè)試劑盒購(gòu)自該公司，Bio-Rad CFX Manager 3.0為其定量分析軟件；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；FT106 慢病毒載體、miR-124-1 基因合成及測(cè)序由中國(guó)廣州輝騰生物科技有限公司提供與完成；膠回收及質(zhì)粒抽提試劑購(gòu)自美國(guó)Roche 公司；Lipofectamine?2000 基因轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Ⅰnvitrogen 公司。CFX96熒光定量PCR 儀、Mini 蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；JEM-1400 Plus 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）購(gòu)自日本HⅠTACHⅠ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 BMMSCs 的分離、培養(yǎng)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定參照我們前期的實(shí)驗(yàn)［1］進(jìn)行。HAPⅠ細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)：待其生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，消化傳代培養(yǎng)，以備后用。293T 細(xì)胞采用常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 BMMSCs-Exo的提取與鑒定 使用去掉Exo的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BMMSCs，傳至第二代，至80%～90%融合時(shí)，收集、過(guò)濾其培養(yǎng)液。先在4 ℃時(shí)以300×g離心10 min，吸取其上清液；再在同樣溫度下，分別以2 000×g、10 000×g及100 000×g離心10 min、30 min及70 min，前2次為上清液離心，末次棄去上清液，收集沉淀（Exo）重懸于100 μL，4 ℃預(yù)冷的PBS液內(nèi)，立即送樣鏡檢。

取約10 μL Exo 懸液，按常規(guī)TEM 觀察要求制樣，3%磷鎢酸水溶液染色，以100 kV 運(yùn)行TEM 觀察、拍照。

提取、定量Exo總蛋白，Western blotting法［1］檢測(cè)其CD63 及CD9 蛋白的表達(dá)變化，內(nèi)參照為GAPDH，至少重復(fù)3次。

1.2.3 FT106/miR-124-1 慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定參照miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)的鼠源miR-124-1 基因序列（NR_031866.1），合成miR-124-1 基因，并克隆其入慢病毒載體FT106 的XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建慢病毒重組載體FT106/miR-124-1，并行測(cè)序鑒定。

1.2.4 FT106/miR-124-1 重組載體的包裝和滴度測(cè)定 參照重組慢病毒的包裝與滴度測(cè)定實(shí)驗(yàn)［1］行FT106/miR-124-1重組載體的包裝和滴度測(cè)定。

1.2.5 BMMSCs 的FT106/miR-124-1 病毒感染及其miR-124-1 基因的表達(dá)檢測(cè) BMMSCs 的FT106/miR-124-1 病毒感染參照干細(xì)胞的重組慢病毒感染實(shí)驗(yàn)［1］進(jìn)行。設(shè)計(jì)miR-124-1（NR_031866.1）的qPCR 檢測(cè)頸環(huán)引物（正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGCGT GTTCACAGCGGA-3'；反向引物：5'-CTCAACTGG TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAAGG TC-3'）。qPCR 檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-124-1 的BMMSCs（BMMSCs+miR-124-1，BMMSCs/124-1組）及其Exo的miR-124-1（BMMSCs-Exo+miR-124-1，Exo/124-1組）表達(dá)情況，以正常BMMSCs（BMMSCs 組）及其Exo（BMMSCs-Exo 組）的相同檢測(cè)作對(duì)照。U6基因作內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

感染效率的評(píng)估采用表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的BMMSCs 的百分比及其qPCR 檢測(cè)結(jié)果，表達(dá)GFP 90%以上者，說(shuō)明其有效表達(dá)miR-124-1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 過(guò)表達(dá)miR-124-1的BMMSCs-Exo對(duì)MG極化調(diào)控的影響 常規(guī)培養(yǎng)HAPⅠ細(xì)胞，待其長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，更換含500 ng/mL 的LPS 培養(yǎng)基，24 h后，分別更換含10 μg/mL 的BMMSCs-Exo（Exo 組）及BMMSCs-Exo/124-1（Exo/124-1 組）培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，分別收集Exo 組與Exo/124-1 組細(xì)胞。用僅含LPS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的HAPⅠ細(xì)胞（LPS 組）與未處理的HAPⅠ細(xì)胞（正常組）作對(duì)照。

設(shè)計(jì)、合成TNF-α（L00981.1）、IL-6（M26744.1）、IL-10（L02926.1）及CD206（NM_001106123.2）基因qPCR 檢測(cè)引物（表1）。以各組細(xì)胞總RNA 為模板，qPCR分別檢測(cè)各組細(xì)胞各基因的表達(dá)情況，以Gapdh（AF106860.2）為內(nèi)參。

表1 qPCR檢測(cè)的引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

Western blotting 法［1］檢測(cè)上述各組細(xì)胞TNF-α、ⅠL-6、CD206及ⅠL-10蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)與方差分析，數(shù)據(jù)以±s呈現(xiàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

倒置顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，原代BMMSCs 由圓形向不規(guī)則形轉(zhuǎn)變，隨后大部分轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、紡錘樣，以散在集落狀態(tài)分布。繼續(xù)培養(yǎng)8～11 d，取單克隆BMMSCs 擴(kuò)增培養(yǎng)。經(jīng)擴(kuò)增的BMMSCs 良好生長(zhǎng)，待至85%～95% 匯片時(shí)再次傳代擴(kuò)增。此時(shí)的BMMSCs，大部分呈梭形，分布較均勻（圖1），增殖旺盛，增殖速度明顯快于原代，6～8 d 可再次傳代培養(yǎng)，以備后用。

圖1 鏡下傳代擴(kuò)增的BMMSCsFig 1 BMMSCs subcultured and expanded under microscope

流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)，源于中胚層的細(xì)胞表型標(biāo)志CD44 與CD90，在BMMSCs 中明顯高表達(dá)，其陽(yáng)性率分別為99.700%與99.200%；而造血細(xì)胞表型標(biāo)志CD45，在BMMSCs中不表達(dá)或表達(dá)低下，其陽(yáng)性率是0.999%（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs的CD44(A)、CD90(B)與CD45(C)的陽(yáng)性率Fig 2 Detection of the positive rates of CD44(A),CD90(B)and CD45(C)in BMMSCs by flow cytometry

2.2 BMMSCs-Exo的提取與鑒定

TEM 觀察可見，BMMSCs-Exo 呈橢圓形、圓形囊泡狀，直徑50～150 nm（圖3A）。Western blotting結(jié)果表明，其表面標(biāo)志蛋白CD63、CD9 的表達(dá)分別較BMMSCs 增高68.00%與61.94%（圖3B、3C），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

圖3 BMMSCs-Exo外泌體的鑒定Fig 3 Ⅰdentification of BMMSCs-Exo

2.3 FT106/miR-124-1病毒的測(cè)序鑒定

測(cè)序結(jié)果（圖4）表明，攜帶miR-124-1 的重組病毒FT106/miR-124-1構(gòu)建成功。

圖4 重組慢病毒載體FT106/miR-124-1的測(cè)序鑒定Fig 4 Sequencing and identification of recombinant lentiviral vector FT106/miR-124-1

2.4 FT106/miR-124-1重組載體的包裝和滴度測(cè)定

將重組病毒FT106/miR-124-1 感染常規(guī)培養(yǎng)的293T 細(xì)胞（圖5A）。倒置熒光顯微鏡下可見，經(jīng)感染48 h 的293T 細(xì)胞明顯表達(dá)GFP（圖5B）。倍比稀釋法實(shí)驗(yàn)表明，該重組病毒的滴度約為1.4×108轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（transducing unit，TU）/mL。

圖5 重組病毒FT106/miR-124的包裝Fig 5 Recombinant lentiviral vector FT106/miR-124-1 packaged with 293T cells

2.5 BMMSCs的FT106/miR-124-1病毒感染

未感染的BMMSCs 無(wú)GFP 表達(dá)（圖6A），被重組病毒FT106/miR-124-1 感染的BMMSCs，明顯表達(dá)GFP（圖6B），其感染效率達(dá)95%以上。qPCR 檢測(cè)表明，被感染的BMMSCs 及其Exo 與感染前比較，其miR-124-1 的表達(dá)分別上調(diào)69.74%與70.59%，差異均具有統(tǒng)計(jì)意義（P=0.000，圖6C）。

圖6 BMMSCs及其Exo的重組病毒感染Fig 6 Recombinant lentivirus infection rate in BMMSCs and BMMSCs-Exo

2.6 攜帶miR-124-1 的BMMSCs-Exo 對(duì)MG 的M2型極化調(diào)控的影響

qPCR 和Western blotting 檢測(cè)（圖7、圖8） 表明，Exo/124-1 能有效上調(diào)HAPⅠ細(xì)胞M2 型分子CD206（與正常組和LPS組比較，在基因水平分別上調(diào)了46.90%、76.99%，在蛋白水平分別為65.13%、85.11%）、ⅠL-10（與正常組和LPS 組比較，在基因水平分別上調(diào)了43.09%、72.36%，在蛋白水平分別為55.19%、78.18%），下調(diào)其M1 型分子ⅠL-6（與正常組和LPS 組比較，在基因水平分別下調(diào)了55.71%、73.04%，在蛋白水平分別為52.32%、76.95%）、TNF-α（與正常組和LPS 組比較，在基因水平分別下調(diào)了51.95%、 68.91%， 在蛋白水平分別為52.14%、77.47%） 的表達(dá)，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miR-124-1 基因的BMMSCs-Exo（Exo/124-1）可誘導(dǎo)M1 型HAPⅠ細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化。

圖7 qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-124-1的BMMSCs-Exo對(duì)HAPI細(xì)胞CD206（A）、IL-10（B）、IL-6（C）和TNF-α（D）mRNA表達(dá)的影響Fig 7 Effects of overexpressing miR-124-1 gene in BMMSCs-Exo on the expressions of CD206, IL-10, IL-6 and TNF-α mRNA of HAPⅠcells detected by qPCR

圖8 Western blotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-124-1的BMMSCs-Exo對(duì)HAPI細(xì)胞CD206、IL-10、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)的影響Fig 8 Effects of overexpressing miR-124-1 gene in BMMSCs-Exo on the expressions of CD206, ⅠL-10, ⅠL-6 and TNF-α protein in HAPⅠcells detected by Western blotting

3 討論

ⅠS 占腦卒中的70%～87%［1］。炎癥反應(yīng)在ⅠS 的發(fā)生發(fā)展中倍受關(guān)注。MG 被視為腦組織中的MP，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中首要和最主要的一道防線。靜息狀態(tài)的MG 對(duì)CNS 進(jìn)行免疫監(jiān)視，并通過(guò)移除細(xì)胞碎片、控制神經(jīng)元及突觸沖動(dòng)等維持CNS的穩(wěn)定。ⅠS炎癥早期，MG被迅速活化成M1 型細(xì)胞，釋放大量的炎癥介質(zhì)（ⅠL-6、TNF-α等），導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死［16］。本研究結(jié)果表明，經(jīng)LPS 刺激活化的HAPⅠ細(xì)胞，其ⅠL-6、TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；同時(shí)被活化成的M2 型細(xì)胞釋放抗炎介質(zhì)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［17］。MG 既致毒又保護(hù)的雙向作用成為ⅠS 救治的重要靶點(diǎn)，探討MG 的M2 型極化調(diào)控成為ⅠS 治療的新策略［4］，但目前仍缺乏有效的措施。因此，本研究選用HAPⅠ細(xì)胞為研究靶細(xì)胞，以尋求其M2 型極化調(diào)控的新手段，為更有效地治療ⅠS奠定基礎(chǔ)。

MSCs 是源于中胚層的成體干細(xì)胞，易于獲取與擴(kuò)增，具有高度自我更新與多向分化潛能，在各種疾病包括ⅠS的研究中得以廣泛應(yīng)用。Exo是細(xì)胞以出芽方式形成的一種直徑30～150 nm 的雙層脂質(zhì)膜納米囊泡。BMMSCs-Exo 可表達(dá)CD63、CD9 蛋白［18］。經(jīng)TME 和Western blotting 鑒定表明，實(shí)驗(yàn)分離到的BMMSCs-Exo，其形態(tài)、大小及標(biāo)志蛋白CD63、CD9 的表達(dá)等與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Exo 可向靶細(xì)胞傳遞其內(nèi)容物（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及miRNA 等生物活性物），調(diào)控靶細(xì)胞基因的表達(dá)，影響其生物功能，介導(dǎo)細(xì)胞間的通信［19］。MSCs-Exo 不僅有MSCs 的特有活性物，且可作為新型免疫調(diào)節(jié)劑，免受治療時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的免疫排斥，其應(yīng)用前景廣闊［20-22］。MSCs-Exo 在MG的M2型極化調(diào)控方面亦具一定作用。

miRNA 是小于22 個(gè)核苷酸的一類非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝及組織、器官發(fā)育等病理生理過(guò)程，其表達(dá)穩(wěn)定、易于干預(yù)，作用迅速、廣泛；在多種疾病，包括ⅠS 的研究中倍受關(guān)注［23］。因受雙層膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)，Exo 中的miRNA 非常穩(wěn)定。miR-124-1 是CNS 中最豐富的miRNA 之一，為總量的25%～48%［24］，可促進(jìn)MSCs 行使炎癥免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用［25］。ⅠS發(fā)生后，miR-124-1能使MG 向M2 型極化，以防神經(jīng)元受損；但單純地應(yīng)用miR-124-1，其促進(jìn)MG 的M2 型極化效能并不顯著［15，26］。因此，我們?cè)谘芯恐胁捎肂MMSCs-Exo 攜帶miR-124-1 來(lái)干預(yù)HAPⅠ細(xì)胞。本研究證實(shí)，BMMSCs-Exo 能攜帶miR-124-1，顯著上調(diào)HAPⅠ細(xì)胞的CD206、ⅠL-10表達(dá)，提示其可有效誘導(dǎo)HAPⅠ細(xì)胞向M2型極化。

綜上所述，BMMSCs 可經(jīng)其Exo 攜帶miR-124-1基因，促使HAPⅠ細(xì)胞向M2 型細(xì)胞極化，從而可能介導(dǎo)ⅠS 神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)只在細(xì)胞水平進(jìn)行了初步探討，其動(dòng)物及臨床結(jié)果是否符合預(yù)期，需進(jìn)一步研究證實(shí)。