瓜表皮有刺毛和無刺毛佛手瓜轉(zhuǎn)錄因子SeTTG1的分離及表達(dá)分析

譚國(guó)飛,吳小玉,羅 慶,王孝敬,李裕榮,鐘秀來,孟平紅*

(1貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,貴陽 550006;2安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院,安順 561000;3貴州大學(xué)茶學(xué)院,貴陽 550025)

佛手瓜(Sechium edule)別名捧瓜、安南瓜、豐收瓜、壽瓜、洋瓜等,是一種多年生具蔓性的葫蘆科佛手瓜屬草本植物。佛手瓜原產(chǎn)于中美洲、墨西哥及印度群島,19世紀(jì)初傳入中國(guó)[1]。佛手瓜在中國(guó)多地均有種植,在山東省,佛手瓜產(chǎn)量在67 500 kg/hm2以上,產(chǎn)品銷往全國(guó)各大城市[2]。伴隨山區(qū)佛手瓜栽培技術(shù)的提高,佛手瓜逐漸在貴州省部分地區(qū)大規(guī)模種植,種植面積達(dá)1.07萬hm2,主要分布在貴州省惠水縣、紫云縣和織金縣[3]。

佛手瓜營(yíng)養(yǎng)豐富,富含鋅、鐵、鈣、鎂、維生素E、維生素C等多種有益于人體的維生素和礦物質(zhì)[1]。另外,佛手瓜性涼味甘,歸肺、胃、脾經(jīng),具有祛風(fēng)解熱,健脾開胃的功效,對(duì)風(fēng)熱犯肺、頭痛、咽干、咳嗽、胃濕熱諸癥有一定的功效,適宜于消化不良、胸悶氣脹、嘔吐、肝胃氣痛以及氣管炎咳嗽多痰者食用[4]。佛手瓜清脆無怪味可作水果生吃,炒菜涼拌亦可煮湯、作餡等;其嫩梢、卷須、嫩葉可作為葉用菜食用,其地下塊根肥大,也可食用。此外佛手瓜瓜形獨(dú)特,分枝性強(qiáng),具有蔓性,適于在庭院內(nèi)作為觀賞性棚架種植[5]。

佛手瓜瓜表皮有肉刺(皮刺)能夠保護(hù)瓜不被外來生物侵害。但表皮有刺的佛手瓜不便于采摘、食用,尤其在運(yùn)輸途中瓜與瓜之間容易相互摩擦,不利于儲(chǔ)存和銷售,逐漸被表皮光滑無刺的佛手瓜種淘汰。研究表明,表皮毛的起始和發(fā)生由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互作用完成,特定轉(zhuǎn)錄因子,如GL2(GLABRA2)、GL3(GLABRA3)和TTG1(TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)是細(xì)胞產(chǎn)生表皮毛的主要調(diào)節(jié)物[6-7]。其中,轉(zhuǎn)錄因子TTG1是影響植物莖、葉片、種子、果實(shí)等表皮毛發(fā)育的重要調(diào)控因子之一[7-8]。在絕大多數(shù)植物組織中,TTG1缺失的突變體無表皮毛,但當(dāng)TTG1在植株中過表達(dá)時(shí)會(huì)使得原本沒有根毛的表皮細(xì)胞上產(chǎn)生多余的根毛。劉凱歌等[9]研究表明,TTG1-1廣泛存在于油菜營(yíng)養(yǎng)組織和發(fā)育的種子中,在ttg1-13突變體背景下,異源表達(dá)TTG1-1能夠恢復(fù)該突變體的多個(gè)表型。甘藍(lán)型油菜TTG1-1與擬南芥TTG1在植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過程中具有類似的功能[9-10]。譚國(guó)飛等[8]研究表明,轉(zhuǎn)錄因子TTG1與胡蘿卜種子刺毛的發(fā)育相關(guān)。在佛手瓜中,TTG1因子與瓜表皮的研究未見報(bào)道。本研究通過對(duì)分離的SeTTG1進(jìn)行生物學(xué)分析,以期初步確定其與佛手瓜表皮刺毛發(fā)育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植

有刺佛手瓜來源于貴州省荔波縣洞長(zhǎng)村,無刺光滑的佛手瓜來源于貴州省都勻市茶農(nóng)村。將2種佛手瓜材料種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,于2020年9月20日分別采集表皮有和無刺毛的佛手瓜根、莖、葉、瓜,快速切成小片段,裝入50 mL冷凍管中,液氮速凍后-80℃超低溫冰箱中保存。重復(fù)3次。

1.2 佛手瓜RNA提取與cDNA合成

使用RNA Simple Total RNA Kit(Tiangen,北京)試劑盒提取各材料的總RNA。用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA完整性,用微量分光光度計(jì)Nanodrop 1000(Nanodrop Technologies Inc.,DE,USA)測(cè)定樣品的總RNA濃度。使用PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit(Perfect Real-Time)(TaKaRa,日本)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將產(chǎn)物保存于-20℃冰箱。

1.3 佛手瓜SeTTG1的克隆

以瓜皮有和無刺毛佛手瓜反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板,根據(jù)貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所建立佛手瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(未公布),以佛手瓜SeTTG1(序列編號(hào):TRINITY_DN36982_c0_g1)為參考序列,設(shè)計(jì)引物(SeTTG1-F和SeTTG1-R,表1)克隆目的轉(zhuǎn)錄因子SeTTG1。反應(yīng)體系為:15μLExTaq、1μL cDNA、正反引物各1.0μL、12μL滅菌的ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸3 min,34個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

利用1.2%的瓊脂糖凝膠分離目的條帶,并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-180801,Tiangen)回收目的產(chǎn)物,將其連接到pMD18-T克隆載體上,熱激法(42℃,60 s)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a上。利用含AMP(氨芐青霉素,100 mg/L)的平板篩選,倒置于37℃黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h后,挑取單菌落搖菌,進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確的菌液送到南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 佛手瓜SeTTG1的進(jìn)化及其保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)佛手瓜SeTTG1轉(zhuǎn)錄因子可翻譯的閱讀框,推導(dǎo)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列并翻譯得到對(duì)應(yīng)蛋白序列。下載NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中刊載的30個(gè)其他物種(26個(gè)植物,3種真菌和1種原生生物,其中小麥TTG1為不完全序列)的TTG1序列(表2),用MEGA5.2軟件鄰接法(Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。Bootstrap檢驗(yàn)值設(shè)為1 000[11]。利用SMART在線數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析各物種保守基序。

表2 各物種TTG1蛋白Table 2 TTG1 proteins from different species

1.5 佛手瓜不同部位SeTTG1的表達(dá)分析

設(shè)計(jì)引物(SeTTG1-qF和SeTTG1-qR,表1),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)2種佛手瓜不同部位SeTTG1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平,所用儀器為CFX Connect PCR儀(Bio-Rad,Hercules,CA)。熒光PCR試劑盒為AceQ qRCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。檢測(cè)體系:10μL熒光酶,正反引物各0.5μL,7μL滅菌的ddH2O,2μL的cDNA。反應(yīng)程序?yàn)?95℃30 min;95℃5 s,55℃10 s,40個(gè)循環(huán);72℃2 min;8℃保存。以佛手瓜ACTIN為內(nèi)參基因(引物為:ACTIN-qF和ACTIN-qR,表1)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

SeTTG1表達(dá)數(shù)據(jù)分析參照基因相對(duì)定量ΔCT法,表達(dá)差異量為2-ΔCT,ΔCT=CT-Cactin。相對(duì)定量是基于處理和對(duì)照之間,目標(biāo)基因?qū)⒖蓟虻谋磉_(dá)量的比較[12]。用Microsoft Excel 2007軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,用IBM Statistics 20.0軟件作顯著性分析,顯著水平設(shè)置為P＜0.05和P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手瓜SeTTG1轉(zhuǎn)錄因子的分離

2種類型佛手瓜表皮形態(tài)上存在明顯的差異(圖1)。以2種類型佛手瓜獲得的cDNA為模板,均克隆得到了1條ORF長(zhǎng)度為1 026 bp的SeTTG1轉(zhuǎn)錄因子,但在421、466、594、683和780位點(diǎn)存在差異(圖2)。

圖1 表皮無刺(左)與表皮有刺(右)佛手瓜Fig.1 S.edule fruit with peel hairless(left)and peel hairy(right)geotypes

圖2 表皮有和無刺毛佛手瓜SeTTG1轉(zhuǎn)錄因子序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of SeTTG1 in S.edule fruit with peel hairless and peel hairy

2.2 佛手瓜SeTTG1氨基酸分析

對(duì)2種類型佛手瓜克隆得到的SeTTG1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的蛋白序列分析,結(jié)果顯示有3處存在差異,分別為141、156和228處(圖3)。前人對(duì)植物TTG1氨基酸保守區(qū)域預(yù)測(cè)表明,植物中TTG1存在4個(gè)保守的WD40區(qū)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)[8,13]。SMART在線分析表明瓜皮有刺和無刺毛佛手瓜SeTTG1均含有4個(gè)WD40區(qū)域(圖3)。

圖3 表皮毛有和無佛手瓜SeTTG1蛋白序列比對(duì)Fig.3 Alignment of amino acid sequences of SeTTG1 in S.edule fruit with peel hairless and peel hairy

2.3 佛手瓜SeTTG1進(jìn)化分析

佛手瓜為葫蘆科植物,由圖4可知,SeTTG1蛋白與葫蘆科植物南瓜、黃瓜、西葫蘆和苦瓜TTG1蛋白同源性較高;禾本科、豆科、蓮科、薔薇科植物關(guān)系較近;真菌中的3種生物與植物關(guān)系較遠(yuǎn),單細(xì)胞原核生物位于進(jìn)化樹底端,與植物、真菌關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 不同物種TTG1蛋白進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of TTG1 proteins from different species

TTG1蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明,小麥(不完整序列)和胎三毛滴蟲只有Ⅰ和ⅡWD40基序結(jié)構(gòu)。根內(nèi)球囊霉、新型隱球酵母和嗜山梨條藻等3個(gè)真菌中無WD40基序,表明植物與真菌及單細(xì)胞動(dòng)物之間TTG1進(jìn)化差異大。25種植物的第Ⅰ個(gè)WD40基序存在差異,豆科第Ⅱ個(gè)基序上為40個(gè)堿基,其余為46個(gè),第Ⅲ和第Ⅳ個(gè)基序長(zhǎng)度一致(表3)。說明TTG1在物種之間相對(duì)保守,在植物、真菌和單細(xì)胞生物中存在特異性。

表3 不同物種TTG1蛋白序列WD40基序及長(zhǎng)度預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of WD40 motifs and length of TTG1 proteins from different species

(續(xù)表3)

2.4 佛手瓜轉(zhuǎn)錄因子SeTTG1在不同部位表達(dá)分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示,2種佛手瓜根和葉中,SeTTG1表達(dá)水平無顯著差異;在莖中SeTTG1在有刺毛佛手瓜中表達(dá)水平顯著(P＜0.05)高于無刺毛佛手瓜,為1.36倍;而在瓜中SeTTG1表達(dá)量在有刺毛中表達(dá)量極顯著(P＜0.01)高于無刺毛佛手瓜,為35.64倍(圖5)。

圖5 瓜表皮有刺毛和無刺毛佛手瓜不同組織SeTTG1表達(dá)分析Fig.5 Different tissue expression analysis of SeTTG1 in S.edule fruit with peel hairless and peel hairy

3 討論

表皮毛對(duì)植物抵抗不利的外界環(huán)境,如高溫、低溫、輻射、干旱、病蟲害具有重要作用[7,14-16]。同時(shí),植物表皮毛能夠?yàn)槿祟愄峁┨厥獾漠a(chǎn)品,如棉纖維是人類重要的纖維來源[17];茶葉中葉片表皮毛(茶毫)能夠分泌多酚、多糖物質(zhì),增加茶葉風(fēng)味[18-19]。同時(shí),植物表皮毛的存在也影響人類的健康生活,如懸鈴木葉片表皮毛和種子毛、楊樹及楊柳的柳絮等,已成為很多城市的主要污染物之一,可引起人類的呼吸道感染、肺部感染、發(fā)熱和流感等[20]。而一些園藝產(chǎn)品,如白菜、芥菜、茄子、菠菜、胡蘿卜、西紅柿、花椒等,葉片、種子中刺毛的存在影響播種、采收及食用。為此,無刺毛品種的培育具有一定的現(xiàn)實(shí)意義[8,21-22]。

對(duì)貴州省主要種植區(qū)域進(jìn)行調(diào)研發(fā)現(xiàn),絕大部分種植的佛手瓜表皮光滑無刺。本研究中,有刺佛手瓜商品性狀差,采摘易傷手,采摘后瓜與瓜之間易碰傷,且有刺的佛手瓜瓜表皮易木質(zhì)化和纖維化,影響食用品質(zhì)。植物TTG1作為調(diào)節(jié)表皮毛發(fā)育的主要轉(zhuǎn)錄因子之一,對(duì)植物葉、莖、種子、瓜等表皮刺毛的發(fā)育具有重要作用[7,23-25]。本研究中,在有刺毛和無刺毛瓜中,SeTTG1核苷酸序列有5個(gè)位點(diǎn)不同,推導(dǎo)氨基酸存在3處差異,有刺毛的瓜SeTTG1表達(dá)量極顯著高于無刺毛的瓜。觀察發(fā)現(xiàn),在2種類型佛手瓜的葉、莖表皮中均含有表皮毛,但有刺毛的佛手瓜莖中表達(dá)量顯著高于無刺毛佛手瓜,葉片中無差別。根毛作為植物表皮刺毛中的一部分,在2種類型瓜中均有表達(dá),但無顯著差異,本研究結(jié)果與胡蘿卜種子DcTTG1表達(dá)分析結(jié)果相似[8]。說明佛手瓜中SeTTG1因子影響瓜皮刺毛的發(fā)生。

植物表皮毛的發(fā)育受到各種因素影響[7,14-16],在貴州栽培表皮無刺的佛手瓜過程中,特殊的天氣下,如高溫、低溫、干旱等天氣,瓜表皮刺毛易產(chǎn)生。將表皮無刺的佛手瓜品種種植在高海拔或者低海拔高溫地區(qū),其瓜皮上可能也會(huì)產(chǎn)生刺毛。佛手瓜在成熟過程中,特別是瓜表皮在老化過程中,往往也會(huì)形成一些明顯的瓜表皮刺毛。為此,篩選性狀穩(wěn)定的無刺毛佛手瓜品種,將是新品種培育的方向之一。