黃 麗，周天堯，彭 竹，趙淑果，趙慧婷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

目前市面上針對(duì)致病菌引起的疾病主要是通過抗生素治療，雖然抗生素治療某些細(xì)菌疾病具有顯著成效，但其機(jī)制主要是通過阻斷細(xì)菌的大分子生物合成發(fā)揮抑菌作用[1]，所以，目前很多細(xì)菌如鏈球菌、假單胞菌、沙門氏菌等已經(jīng)對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，且抗生素還具有藥殘性，給人類健康造成了嚴(yán)重隱患[2]，因此，尋找一種能夠作為輔助抗生素的新型抑菌藥物顯得尤為重要?，F(xiàn)已報(bào)道的抗生素輔助品種類繁多，但歸納后大致可以分為4類：酶制劑、活菌制劑、植物提取物和中藥[3]。中藥作為抗生素的輔助品具有天然性和實(shí)踐性、來源廣泛、多功能性、不產(chǎn)生藥殘和抗藥性等優(yōu)勢(shì)，所以，中藥極有可能成為輔助傳統(tǒng)抗生素的最佳候選對(duì)象。蜂毒作為中藥中的一類動(dòng)物藥，其生化特性、抗菌和藥理作用已在多項(xiàng)研究中進(jìn)行了報(bào)道[4-7]。

蜂毒是工蜂在遇到威脅時(shí)通過螫針從毒腺中排出來的具有芳香氣味的物質(zhì)，它是一種具有生物學(xué)活性和藥理學(xué)活性的復(fù)雜混合物，其中以多肽類為主，包括蜂毒肽、蜂毒明肽以及肥大細(xì)胞脫粒肽等10余種活性肽。此外，蜂毒中還含有透明質(zhì)酸酶、磷脂酶A 2等50多種酶類物質(zhì)[8]。已有研究表明，蜂毒具有抗炎[9]、抗衰老[10]、鎮(zhèn)痛[11]、抗病毒[12]、抗輻射[13]、抗腫瘤[14]等功效。還有大量研究表明，蜂毒具有抑菌作用。

近年來，有大量研究表明，蜂毒在抑菌方面具有顯著效果。KONG等[15]采用最小抑菌濃度法檢測(cè)蜂毒對(duì)造成小鼠MRSA肺炎模型中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)蜂毒可抑制該致病菌的毒力和肺組織中存在的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量，從而減輕小鼠的肺炎癥狀。該研究表明，蜂毒可能是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染引起的肺炎的候選物質(zhì)。HEGAZI等[16]采用最小抑菌濃度法評(píng)估了3種不同蜂毒作為抗菌劑的潛在用途，包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸桿菌（Escherichia coli）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。結(jié)果表明，蜂毒可抑制細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)和存活，并且蜂毒可用作對(duì)抗病原菌的補(bǔ)充抗菌劑。PARK等[17]選用3種不同蜂毒對(duì)從患有乳腺炎的奶牛乳房中分離出來的44種細(xì)菌進(jìn)行瓊脂平板法和最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定，對(duì)3種蜂毒的抗菌活性和效力進(jìn)行了確認(rèn)和比較。結(jié)果表明，3種蜂毒均能有效抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase-negative Staphylococcus），抑制部分大腸桿菌（Escherichia coli）的生長(zhǎng)，而對(duì)其他細(xì)菌（在超過500μg/mL的濃度下）沒有抑制功效。ZOLFAGHARIAN等[18]采用抑菌圈和最小抑菌濃度法對(duì)蜂毒和慶大霉素的抑菌功效進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)蜂毒可作為慶大霉素的有效替代品。SURENDRA等[19]獲取東方蜜蜂（Apis cerana）、大蜜蜂（Apis dorsata）和小蜜蜂（Apis florea）3種蜜蜂蜂毒后通過體外試驗(yàn)檢測(cè)它們對(duì)5種病原細(xì)菌和真菌的抑制作用。結(jié)果顯示，5種病原菌對(duì)東方蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂的蜂毒都具有一定的敏感性。HAN等[20]也研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂毒液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。蜂毒對(duì)部分細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)都有抑制作用，但對(duì)同一細(xì)菌的最小抑菌濃度和抑菌圈有所不同，可能由于蜂毒種類或純度不同。中華蜜蜂（A.cerana cerana）和意大利蜜蜂（A.mellifera ligustica）是我國(guó)目前飼養(yǎng)的兩大主要蜂種，但是由于意蜂管理難度較低、飼養(yǎng)面積大、獲取的蜂產(chǎn)品產(chǎn)量高等特點(diǎn)，因此，對(duì)意蜂開展的基礎(chǔ)性研究遠(yuǎn)多于中蜂。本研究探討中蜂蜂毒、意蜂蜂毒抑菌特性的差異，旨在為開發(fā)一款無耐藥性藥物作為傳統(tǒng)抗生素藥物的補(bǔ)充抗菌劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試劑 蜂毒由安徽金蜂蜂毒生物科技開發(fā)有限公司提供，為凍干粉；NaCl、葡萄糖購(gòu)自鞍山智奧化學(xué)試劑研究所；酵母浸膏、蛋白胨購(gòu)自O(shè)xiod公司；血瓊脂平板購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司；腦心浸液肉湯購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；青霉素、PDA和PDB購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 供試菌株 革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（STAU）、枯草芽孢桿菌（BASU）、白色葡萄球菌（STAL）、蘇云金芽孢桿菌（BATH）、無乳鏈球菌（STAG）；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（ESCO）、傷寒桿菌（SATY）、沙門氏菌（SALM）；真菌：尖孢鐮孢菌（FUOX）。以上菌株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器 搖床、恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀、正置顯微鏡、移液器、培養(yǎng)皿、三角涂棒、濾紙、游標(biāo)卡尺和實(shí)驗(yàn)室其他常規(guī)設(shè)備等。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019年6—8月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 菌種的活化培養(yǎng) 細(xì)菌：將各菌株接種于適宜的液體培養(yǎng)基中，搖床擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；真菌：將菌株培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上，再用接種針將菌絲接種到PDB中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 抑菌圈的測(cè)定 將中蜂蜂毒和意蜂蜂毒凍干粉分別用滅菌蒸餾水配制成10、20、40 mg/mL 3種不同質(zhì)量濃度的蜂毒溶液。取濃度為106~107cfu/mL的各菌懸液200μL分別加入到20 mL溫度適宜的瓊脂培養(yǎng)基中混勻，凝固后將滅菌的濾紙片置于培養(yǎng)基上。再將中、意蜂不同質(zhì)量濃度的蜂毒各5μL置于濾紙片上，陽性對(duì)照為5 mg/mL的青霉素，陰性對(duì)照為無菌水。將平皿置于適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，12 h后取出，觀察記錄抑菌情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 最小抑菌濃度的測(cè)定 將中蜂蜂毒、意蜂蜂毒凍干粉配制成1、5、10、15、20、25、30 mg/mL的蜂毒溶液。取濃度為106~107cfu/mL的各菌懸液60μL和不同質(zhì)量濃度的中蜂蜂毒、意蜂蜂毒溶液60μL混勻，混勻后分別用三角棒均勻涂抹在瓊脂培養(yǎng)基上。將平皿置于適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，12 h后取出，觀察抑菌情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 意蜂蜂毒對(duì)無乳鏈球菌抑制作用的驗(yàn)證

1.2.4.1 蜂毒對(duì)菌液光密度的影響 空白對(duì)照組為腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI液體培養(yǎng)基），陰性對(duì)照組為106~107cfu/mL的無乳鏈球菌懸液50μL接入5 mL BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組分別采用濃度為106~107cfu/mL的無乳鏈球菌懸液50μL接入含有0.5、2.5、5.0 mg/mL意蜂蜂毒和1、5 mg/mL青霉素的5 mL BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，每隔2 h測(cè)一次OD值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 細(xì)菌熒光顯微鏡觀察 對(duì)照組是將活化后的菌液50μL接入5 mL BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，試驗(yàn)組是將菌液接入含有1、5 mg/mL意蜂蜂毒的5 mL BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。陽性對(duì)照組選用含有1、5 mg/mL青霉素的5 mL BHI液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)12 h后，采用正置熒光顯微鏡觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄及整理、利用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，利用Graph Pad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中蜂蜂毒和意蜂蜂毒抑菌圈對(duì)比分析

中蜂蜂毒和意蜂蜂毒對(duì)抑菌圈的影響如表1、2所示。

表1 中蜂蜂毒對(duì)供試菌抑菌圈的影響Tab.1 Effect of BV of A.cerana cerana on bacteriostatic zones of tested strains mm

表2 意蜂蜂毒對(duì)供試菌抑菌圈的影響Tab.2 Effect of BV of A.mellifera ligustica on bacteriostatic zones of tested strains mm

從表1、2可以看出，中蜂蜂毒、意蜂蜂毒對(duì)白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、無乳鏈球菌、尖孢鐮刀菌和沙門氏菌都有一定的抑制作用。并且隨著蜂毒質(zhì)量濃度的升高，抑菌圈直徑增大，抑菌效果愈加明顯，說明蜂毒質(zhì)量濃度與抑菌效果成正相關(guān)。根據(jù)最大質(zhì)量濃度下抑菌圈大小判定意蜂蜂毒抑菌作用從大到小依次為：白色葡萄球菌＞蘇云金芽孢桿菌＞尖孢鐮刀菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞無乳鏈球菌＞沙門氏菌；中蜂蜂毒抑菌作用從大到小依次為：尖孢鐮刀菌＞蘇云金芽孢桿菌＞白色葡萄球菌＞金黃色葡萄球菌＞無乳鏈球菌＞枯草芽孢桿菌＞沙門氏菌；但在本試驗(yàn)中，中蜂蜂毒和意蜂蜂毒對(duì)大腸桿菌和傷寒桿菌無明顯抑制作用。

由此可見，中蜂蜂毒和意蜂蜂毒二者都對(duì)革蘭氏陽性菌中白色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑菌功效，但對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌功效較弱；尖孢鐮刀菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和無乳鏈球菌隨蜂毒質(zhì)量濃度增加，抑菌效果顯著增強(qiáng)。

從中蜂蜂毒40 mg/mL和意蜂蜂毒40 mg/mL的抑菌試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果（圖1）可以看出，中蜂蜂毒、意蜂蜂毒對(duì)供試菌的抑制作用之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）分析

由表3可知，在本試驗(yàn)設(shè)置的濃度中，中蜂蜂毒、意蜂蜂毒對(duì)革蘭氏陽性菌和真菌的最小抑菌濃度均為5 mg/mL。但對(duì)革蘭氏陰性菌，在濃度高達(dá)30 mg/mL時(shí)仍未有明顯抑菌效果。說明蜂毒對(duì)革蘭氏陽性菌和真菌有較強(qiáng)的抑菌作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌作用欠佳。

2.3 蜂毒對(duì)菌液光密度的影響

由表4可知，在試驗(yàn)組中，加入不同質(zhì)量濃度的意蜂蜂毒和青霉素后采用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菌液的OD值在不同處理組間隨時(shí)間變化的趨勢(shì)均有顯著差異（P＜0.05）。其中，青霉素1、5 mg/mL菌液的OD值無顯著差異，但蜂毒對(duì)菌液OD值的影響卻表現(xiàn)為：5.0 mg/mL＞2.5 mg/mL＞0.5 mg/mL；陰性對(duì)照組菌液的OD值明顯上升，說明蜂毒可抑制無乳鏈球菌的生長(zhǎng)。

表3 蜂毒對(duì)供試菌的MICTab.3 MIC of tested strains treated with BV

表4 蜂毒作用下無乳鏈球菌生長(zhǎng)的酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果Tab.4 The effect of BV on results determined by microplate reader detecting the growth of Streptococcus agalactiae

2.4 正置熒光顯微鏡觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況

蜂毒作用下無乳鏈球菌正置顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，對(duì)照組在培養(yǎng)12 h后從正置顯微鏡下觀察到有大量無乳鏈球菌，呈鏈狀排列，而試驗(yàn)組經(jīng)過12 h的培養(yǎng)后在正置顯微鏡下只能觀察到很少量的細(xì)菌，說明蜂毒對(duì)無乳鏈球菌的繁殖具有較強(qiáng)的抑制作用。在陽性對(duì)照組中將青霉素接入活化后的無乳鏈球菌菌液中培養(yǎng)12 h后，觀察不到細(xì)菌的存在，表明青霉素在菌液濃度較低時(shí)可能對(duì)其有殺菌作用。

3 結(jié)論與討論

蜂毒的抗菌作用可能是由于其存在肽、酶、生物活性胺和非肽成分，這些化合物可能與某些細(xì)菌的特定分子發(fā)生相互作用，而不會(huì)影響其他細(xì)菌。陳素霞等[21]研究表明，蜂毒肽作為蜂毒中的主要活性成分，是典型的陽離子抗菌肽。這類抗菌肽含有較多的堿性氨基酸和較多的疏水性氨基酸，其抑菌機(jī)理為肽的陽離子部分與細(xì)菌細(xì)胞膜的陰離子發(fā)生靜電作用，由疏水氨基酸形成的疏水部位與細(xì)菌細(xì)胞膜的脂鏈產(chǎn)生疏水作用，從而起到抑菌作用，與抗生素抑菌機(jī)理相比，這種獨(dú)特的抗菌機(jī)理使細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性。CUJOVA等[22]采用最小抑菌濃度法研究表明，蜜蜂蜂毒中的蜂毒肽及其類似物對(duì)革蘭氏陽性菌的活性均高于革蘭氏陰性菌。同樣，ORTEL等[23]定量測(cè)定抑菌圈時(shí)，發(fā)現(xiàn)在低濃度的蜂毒下，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更敏感。HEGAZI等[24]研究結(jié)果表明，蜂產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌的效果較差。本研究獲得的抑菌數(shù)據(jù)表明，中蜂蜂毒、意蜂蜂毒可以顯著抑制某些細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，相比于革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌對(duì)蜂毒更敏感，這與前人的研究結(jié)果相似。青霉素只能特異性地針對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁，而對(duì)其他微生物的細(xì)胞壁無效，所以，青霉素不能抑制真菌，而本試驗(yàn)結(jié)果表明，蜂毒對(duì)真菌具有一定抑制作用，體現(xiàn)了中藥對(duì)真菌具有獨(dú)特的治療作用[25-27]。另外，中、意蜂2種蜂毒在抑菌效果方面，包括對(duì)各種菌的抑菌圈及最小抑菌濃度間均無顯著差異，說明兩類蜂毒的抑菌作用是相當(dāng)?shù)?。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)后期選擇了革蘭氏陽性菌無乳鏈球菌來進(jìn)一步探討蜂毒的抑菌特性；采用正置熒光顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，加入蜂毒后，可以有效抑制無乳鏈球菌的生長(zhǎng)；酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示，蜂毒可以顯著降低無乳鏈球菌菌液的OD值，該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了蜂毒對(duì)革蘭氏陽性菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，也許蜂毒可以作為一種有效的輔助抗菌劑用于對(duì)抗特定的致病菌。本試驗(yàn)中僅使用粗蜂毒對(duì)比分析了中、意蜂蜂毒的抑菌作用。由于蜂毒成分較復(fù)雜，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中可提取其單一成分，探討不同成分抑菌作用并對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行深入研究。

本試驗(yàn)研究了中蜂蜂毒、意蜂蜂毒對(duì)5種革蘭氏陽性菌、3種革蘭氏陰性菌和1種真菌的抑菌效果，證實(shí)了中蜂蜂毒和意蜂蜂毒對(duì)供試的革蘭氏陽性菌、真菌和部分革蘭氏陰性菌都有一定的抑制作用，對(duì)革蘭氏陽性菌和真菌的抑制效果較好，但中蜂蜂毒和意蜂蜂毒在抑菌效果方面無顯著性差異。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)和正置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)意蜂蜂毒對(duì)無乳鏈球菌有顯著的抑制作用，且蜂毒不同濃度間也存在顯著的抑菌差異。本研究可為蜂毒作為輔助抗生素藥物治療疾病提供理論依據(jù)，同時(shí)為豐富其藥理學(xué)及臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。