溫 琪 羅嘉琰 邵浩東 鄧張雙 滕 鵬

(1.浙江大學(xué) 藥學(xué)院 藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)研究所,杭州 310058;2.中國藥科大學(xué) 藥學(xué)院,南京 210009;3.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院,上海 200237;4.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

0 引言

生物正交反應(yīng)(Bioorthogonal reaction)是一類能夠在生物體環(huán)境系中尤其是在活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行、且不與周圍其它生物化學(xué)過程相互干擾的化學(xué)反應(yīng)[1-2].由于生物體系的復(fù)雜性,具有高度專一性和快速反應(yīng)能力的生物正交反應(yīng)是化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的重要前沿,為科學(xué)家們研究生命進(jìn)程帶來了革命性的技術(shù)方法,對生物體系的標(biāo)記和功能調(diào)控有著重要應(yīng)用.生物正交反應(yīng)通過化學(xué)和生物反應(yīng)來選擇性地高效修飾報(bào)告基團(tuán)在靶標(biāo)上,其主要反應(yīng)類型包括初期K.B.Sharpless和M.Meldal教授發(fā)現(xiàn)的銅催化的疊氮和末端炔基之間的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition,Cu AAC),以及Bertozzi教授等改進(jìn)的環(huán)張力型炔烴參與的無金屬催化劑使用的環(huán)加成反應(yīng)(strain-promoted azidealkyne cycloaddition,SPAAC).研究者們后來發(fā)現(xiàn)帶有環(huán)張力的烯烴也可以發(fā)生類似的環(huán)加成反應(yīng),尤其當(dāng)采用四嗪和反式環(huán)辛烯時(shí),由于受環(huán)辛烯環(huán)內(nèi)張力釋放和生成氣態(tài)副產(chǎn)物的雙重驅(qū)動(dòng)作用,該逆電子需求的狄爾斯-阿爾德(inverse-electron-demand Diels-Alder,IEDDA)反應(yīng)的反應(yīng)速率遠(yuǎn)大于之前的反應(yīng),并能夠用于活體成像等體內(nèi)生物標(biāo)記反應(yīng).除反式環(huán)辛烯外,環(huán)丙烯、降冰片烯、氮雜環(huán)丁烯等具有張力的小環(huán)烯烴也可與四嗪快速反應(yīng).這些革命性的化學(xué)技術(shù)極大地促進(jìn)了化學(xué)生物學(xué)這個(gè)新興交叉領(lǐng)域的發(fā)展.

2000年,Bertozzi課題組開發(fā)出能夠用于化學(xué)修飾細(xì)胞表面的Staudinger偶聯(lián)反應(yīng),逐漸開啟了生物標(biāo)記領(lǐng)域的研究熱潮.經(jīng)過20年的發(fā)展,由于具有特異性位點(diǎn)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)[2],生物正交反應(yīng)已被研究人員廣泛使用在復(fù)雜生物體系中標(biāo)記、分離和研究蛋白[2]、糖類[3]、脂類[4-5]等不易或者不能通過基因方式修飾的生物活性分子,在活細(xì)胞成像、疾病診斷和生物組學(xué)分析中發(fā)揮了重要的作用.我國的研究者也在該領(lǐng)域做出了杰出的貢獻(xiàn)[6-7],也綜述介紹了生物正交反應(yīng)的原理和研究現(xiàn)狀.陳鵬等課題組在生物正交反應(yīng)[8-9]、位點(diǎn)特異性標(biāo)記蛋白[10]及其生物正交剪切反應(yīng)(bioorthogonal cleavage reactions,BCRs)[11]等方面分別總結(jié)了該領(lǐng)域的進(jìn)展,該課題組也綜述報(bào)道了生物正交反應(yīng)在我國的研究進(jìn)展[12].圍繞IEDDA剪切反應(yīng)在生物正交化學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展與生物學(xué)研究中的應(yīng)用尤其是生物成像也有很好的綜述報(bào)道[13].

近年來,生物正交反應(yīng)在生物醫(yī)藥研究中也有廣泛的應(yīng)用前景.本文首先簡要介紹生物正交反應(yīng)的主要類型;然后總結(jié)其在藥物化學(xué)中的研究進(jìn)展,包括該反應(yīng)在藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證和藥物活性分子骨架發(fā)現(xiàn)等方向的研究進(jìn)展;最后在此基礎(chǔ)上對該領(lǐng)域在藥物化學(xué)發(fā)展中的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望.

1 金屬催化的生物正交反應(yīng)

1.1 銅(Cu)催化的生物正交反應(yīng)

生物正交反應(yīng)的最顯著要求之一是反應(yīng)具有較高的反應(yīng)速率,而之前發(fā)現(xiàn)的大部分反應(yīng)都難以滿足這個(gè)條件.一價(jià)銅離子催化的疊氮化合物與含有末端炔烴的環(huán)加成反應(yīng)Cu AAC 即“點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)”是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的生物正交反應(yīng)之一.疊氮化合物與炔基之間的環(huán)加成反應(yīng)最早是由Huisgen于1963年發(fā)現(xiàn)的,但是該環(huán)加成反應(yīng)條件苛刻,且反應(yīng)速率較慢,而K.B.Sharpless 和M.Meldal兩位教授于2002 年發(fā)現(xiàn)一價(jià)銅離子能夠顯著加快疊氮化合物和炔基之間的環(huán)加成反應(yīng),該反應(yīng)條件溫和,只要在室溫條件下即可進(jìn)行,且反應(yīng)速率大大加快,約為之前的一百萬倍[14-15].

將化學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到生物體中首先必須要考其慮毒性問題,而前文提到的在生物正交反應(yīng)中起催化作用的一價(jià)銅離子能夠參與產(chǎn)生對生物體系有毒的活性自由基,嚴(yán)重影響一價(jià)銅離子催化的反應(yīng)應(yīng)用.為了解決這一問題,研究者們發(fā)現(xiàn),加入配體與銅離子形成配合物能夠有效地降低毒性,也可增加該一價(jià)銅的穩(wěn)定性并加快反應(yīng)速率,這種優(yōu)化方式被稱作由配體輔助的Cu AAC.目前已知的配體有寡聚三氮唑類化合物TBTA[16]和水溶性較好的THPTA[17],以及其它TBTA 的水溶性類似物(如BTTAA、BTTES、BTTP和BTTPS)(如圖1所示)[11,18],天然氨基酸組氨酸也可有效輔助Cu AAC反應(yīng)且?guī)缀鯚o細(xì)胞毒性.

圖1 Cu AAC中常用到的配體

除了通過配體螯合銅離子來降低生物毒性、提升反應(yīng)速率之外,對Cu AAC的反應(yīng)底物進(jìn)行特定的修飾也能夠使反應(yīng)速率進(jìn)一步加快.一種常用的方法是在疊氮基的鄰位用吡啶來修飾(如疊氮基甲基吡啶),疊氮化合物中的吡啶能夠與銅離子螯合,從而使銅離子更快地參與反應(yīng)[19].Wu等發(fā)現(xiàn),當(dāng)吡啶上含有供電子基團(tuán)時(shí),能進(jìn)一步加快反應(yīng)的速率[20].

除了Cu AAC偶聯(lián)反應(yīng)之外,銅催化的生物正交剪切反應(yīng)也被報(bào)道(如圖2所示)[21].陳鵬等發(fā)展了“雙取代炔丙基/銅試劑”,通過炔丙基的剪切調(diào)控,實(shí)現(xiàn)了非天然氨基酸定點(diǎn)插入的細(xì)胞膜表面受體-配體相互作用的原位調(diào)控[22].這種策略也可拓展至基于氨基或者酚羥基的ADCs,這種分子內(nèi)剪切反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)選擇性殺傷癌細(xì)胞.

圖2 銅催化的生物正交剪切反應(yīng)

1.2 鈀(Pb)催化的生物正交反應(yīng)

鈀作為有機(jī)合成中常用的高效催化劑,在生物正交反應(yīng)中也擁有巨大的應(yīng)用潛力.鈀催化的蛋白質(zhì)和小分子的偶聯(lián)反應(yīng)在初期并不理想,直到2009 年,Davis課題組開發(fā)了一種水溶性配體—ADHP(2-氨基-4,6-二羥基嘧啶)[23].ADHP 與醋酸鈀共存時(shí)能夠高效地催化帶有碘苯基的蛋白質(zhì)與多種苯硼酸類化合物的Suzuki-Miyaura反應(yīng).兩年后,Lin課題組對ADHP進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)N,N’-二甲基化的DADHP能夠和醋酸鈀在細(xì)菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)以標(biāo)記蛋白質(zhì)[24].

隨著對鈀催化生物正交反應(yīng)研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)即使不使用配體也能用鈀高效地催化生物正交反應(yīng).陳鵬課題組設(shè)計(jì)了一種無需鈀催化的Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng),能夠?qū)罴?xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記.該課題組發(fā)現(xiàn)用PEG 鏈來連接染料和反應(yīng)基團(tuán)時(shí),只需要硝酸鈀即可實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌內(nèi)蛋白質(zhì)的Sonogashira偶聯(lián)標(biāo)記細(xì)菌,不但效率高,而且沒有細(xì)胞毒性[25].曲曉剛課題組開發(fā)出了一種能夠被光調(diào)控的納米鈀催化劑(如圖3所示),這種催化劑中的鈀被負(fù)載在由偶氮苯和β-環(huán)糊精的超分子復(fù)合物修飾的大孔二氧化硅中,在光照條件下偶氮苯的構(gòu)型發(fā)生變化從而誘導(dǎo)β-環(huán)糊精分子的解離從而恢復(fù)鈀的催化活性,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的Suzuki-Miyaura偶聯(lián)反應(yīng)[26].

圖3 光調(diào)控的納米鈀催化劑介導(dǎo)的生物正交偶聯(lián)反應(yīng)

生物正交反應(yīng)除了常見的偶聯(lián)反應(yīng)外,還有生物正交剪切反應(yīng),而鈀催化的生物正交剪切反應(yīng)也有著廣闊的應(yīng)用前景.鈀介導(dǎo)的炔丙基/烯丙氧羰基的脫除反應(yīng)是生物正交剪切反應(yīng)中應(yīng)用最多的反應(yīng)之一(如圖4所示).陳鵬課題組在2014年首次報(bào)道了該類鈀催化的剪切反應(yīng),在活細(xì)胞內(nèi)利用鈀催化脫除了炔丙基,完成了賴氨酸的“化學(xué)脫籠”,以此實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的原位激活[27].該課題組還將這類方法應(yīng)用于酪氨酸依賴的蛋白質(zhì)功能原位調(diào)控方法[28].

圖4 鈀介導(dǎo)的生物正交剪切反應(yīng)

1.3 釕(Ru)催化的生物正交反應(yīng)

釕催化的生物正交反應(yīng)以烯烴復(fù)分解反應(yīng)為主,2008年,Davis 課題組曾報(bào)道在水相中使用釕的Hoveyda-Grubbs二代催化劑來催化含烯丙基硫取代蛋白SBL-156Sac的修飾[29].進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),用硒取代硫得到的烯丙基硒取代的半胱氨酸(Se-allylselenocysteine,SeaC)具有更高的反應(yīng)活性(如圖5所示)[30].同時(shí),他們還發(fā)現(xiàn)了SeaC 在發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)之后得到的產(chǎn)物經(jīng)過氧化處理和修飾之后能夠重新得到SeaC的循環(huán).這種特殊的循環(huán)過程可被用于表觀遺傳學(xué)標(biāo)記,被成功地應(yīng)用于組蛋白乙?；哪M.

圖5 釕催化的烯烴復(fù)分解生物正交反應(yīng)

和金屬鈀類似,金屬釕也能在生物體內(nèi)介導(dǎo)烯丙氧羰基的脫除反應(yīng)[31],原位釋放出熒光探針等(如圖6所示)[32].同時(shí)金屬釕也能與配體相螯合,提升反應(yīng)效率,提升生物相容性.

圖6 釕介導(dǎo)的生物正交剪切反應(yīng)

1.4 其它金屬催化的生物正交反應(yīng)

金屬銥(Ir)也能催化疊氮化合物與炔基之間的環(huán)加成反應(yīng).宋汪澤研究組研究了銥配合物催化的疊氮化合物與末端炔基反應(yīng),由于銥與炔胺有著更強(qiáng)的配位能力,所以這種Ir AAC反應(yīng)具有與傳統(tǒng)Cu AAC不同的區(qū)域選擇性(如圖7(a)所示),由于銥在空氣和水相中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,且細(xì)胞毒性小,Ir AAC反應(yīng)具有良好的生物相容性和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[33].Kozhevnikov研究組發(fā)現(xiàn),銥的2-吡啶-1,2,4-三氮唑絡(luò)合物可以提高Ir AAC反應(yīng)的反應(yīng)速率[34].

金屬銀(Ag)也能夠催化二苯并氮雜環(huán)辛炔(DBCO)為底物的張力驅(qū)動(dòng)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)(SPAAC).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在三氟乙酸或醋酸銀催化下,DBCO 會(huì)發(fā)生重排反應(yīng)生成吲哚類化合物(如圖7(b)所示),如果反應(yīng)體系中存在游離的氨基,則會(huì)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng).將不同功能基團(tuán)先修飾到DBCO上,然后再利用這一反應(yīng)即可在多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子上實(shí)現(xiàn)功能基團(tuán)與游離氨基的偶聯(lián).這一與Cu AAC不同的發(fā)現(xiàn)為生物正交偶聯(lián)反應(yīng)提供了新的設(shè)計(jì)方法[35].

金屬銠(Rh)催化生物正交反應(yīng)最早在2004 年被報(bào)道,Francis課題組發(fā)現(xiàn)在含有鹽酸羥胺的水相溶液中醋酸銠可以催化重氮化合物生成銠卡賓中間體,這種高活性的卡賓能夠在酸性和室溫條件下對蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的的色氨酸殘基實(shí)現(xiàn)特異性的偶聯(lián)標(biāo)記反應(yīng),但是這種強(qiáng)酸性(p H＜3.5)條件限制了該反應(yīng)的應(yīng)用[36].該同一課題組優(yōu)化了反應(yīng)條件,發(fā)現(xiàn)在四丁基羥胺的存在下Rh AAC 能在pH 6～7的溫和條件下進(jìn)行(如圖7(c)所示)[37].Rh 金屬肽催化的Rh AAC也可在細(xì)胞裂解液中對蛋白質(zhì)底物定點(diǎn)修飾[38],為其在生物體中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

圖7 其它金屬介導(dǎo)的生物正交剪切反應(yīng)

2 無需金屬催化的生物正交反應(yīng)

2.1 環(huán)張力誘導(dǎo)的環(huán)加成反應(yīng)(strain promoted cycloaddition reaction)

金屬催化的疊氮和末端炔基之間的環(huán)加成反應(yīng)是使用最為廣泛的生物正交反應(yīng),由于金屬離子會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,研究者們通過對炔基底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改變開發(fā)出了不需要銅離子催化的疊氮-炔基[3+2]環(huán)加成反應(yīng)(strain promoted azide-alkyne cycloaddition,SPAAC).早在2004年,Bertozzi課題組使用八元環(huán)炔基作為底物與修飾在細(xì)胞表面的疊氮基團(tuán)進(jìn)行SPAAC反應(yīng),沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性,但是其與疊氮化合物反應(yīng)的速率較低[39].為了提高該反應(yīng)效率,Bertozzi,Boons等研究者們在八元環(huán)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化(如圖8所示)[40-42],發(fā)現(xiàn)了更多反應(yīng)速率快的環(huán)辛炔的衍生物[43-44],其中最快的二級反應(yīng)速率達(dá)到了4.0 M-1·s-1.最近,Franzini課題組系統(tǒng)綜述了包括SPAAC在內(nèi)的無需金屬催化的生物正交反應(yīng)的機(jī)理和取代基的反應(yīng),預(yù)期對該領(lǐng)域?qū)⑵鸬胶芎玫目偨Y(jié)和啟發(fā)作用[45].

圖8 已報(bào)道的主要八元環(huán)炔衍射物

硝酮也可以替換疊氮作為一種活性基團(tuán)參與疊氮-硝酮環(huán)加成反應(yīng)(strain-promoted alkyne-nitrone cycloaddition,SPANC),其反應(yīng)速率比相同條件下的SPAAC反應(yīng)要快30多倍[46].Pezacki課題組發(fā)現(xiàn)環(huán)狀硝酮與八元環(huán)炔的SPAAC的反應(yīng)更快,并成功地實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的特異性染料標(biāo)記[47].

2.2 逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(IEDDA)

傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)中,狄爾斯-阿爾德(DA)反應(yīng)是指發(fā)生在富電子雙烯體和缺電子親雙烯體之間的[4+2]環(huán)加成反應(yīng).與之相反,發(fā)生在缺電子雙烯體和富電子親雙烯體之間的[4+2]環(huán)加成反應(yīng)被稱為逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(inverse electron demand Diels-Alder reaction,IEDDA).反應(yīng)生成的中間體具有高度環(huán)張力,會(huì)迅速脫去一分子氮?dú)?最終生成六元環(huán)噠嗪分子(如圖9所示)[48].這種反應(yīng)不需催化劑和外源能量驅(qū)動(dòng)就能直接發(fā)生特異性偶聯(lián)反應(yīng),且具有生物兼容性好、反應(yīng)專一性高和反應(yīng)速率快的優(yōu)點(diǎn),這使得該反應(yīng)成為最受關(guān)注的生物正交化學(xué)反應(yīng).

圖9 逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)機(jī)理

2008年,Fox研究組和Hilderbrand課題組分別獨(dú)立報(bào)道了這類IEDDA 反應(yīng)在生物體系中的應(yīng)用[49-50].此后,研究者們發(fā)展了不同的環(huán)式烯烴和四嗪分子衍生物(如圖10所示)[51-52],將IEDDA 反應(yīng)成功應(yīng)用與熒光物質(zhì)的“增強(qiáng)(turnon)”和蛋白的定點(diǎn)修飾中.傳統(tǒng)方法集中在高度對稱的四嗪衍生物,該領(lǐng)域的研究者發(fā)現(xiàn)四嗪的3,6位鏈接吸電子基團(tuán)時(shí)反應(yīng)效率較高,但是隨著深入研究,發(fā)現(xiàn)3位和6位的連接基團(tuán)的選擇極為復(fù)雜.陳鵬課題組設(shè)計(jì)了不對稱四嗪衍生物,結(jié)果表明在3位連接吸電子基團(tuán),在6位連接非吸電子基團(tuán)能夠使反應(yīng)活性與分子穩(wěn)定性達(dá)到最佳平衡,成功地實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)的快速生物正交反應(yīng)[53].此外,Weissleder研究者發(fā)現(xiàn)四嗪所連接的酸性基團(tuán)也會(huì)影響反應(yīng)速率,并提出了“局部酸催化理論”[54].結(jié)果表明,在形成雙環(huán)中間體之后,3位或6位的酸性基團(tuán)會(huì)參與到下一步的異構(gòu)化反應(yīng)之中,動(dòng)力學(xué)上利于發(fā)生后續(xù)消除反應(yīng),且基團(tuán)的酸性越強(qiáng),反應(yīng)速率越快.

圖10 已報(bào)道的參與IEDDA 的主要四嗪分子衍生物

在IEDDA 反應(yīng)中,最為廣泛應(yīng)用的親雙烯體為反式環(huán)辛烯(transcycloctene,TCO).初期研究主要停留在引入給電子基團(tuán)來提升IEDDA 的反應(yīng)速率.隨著研究的深入,有機(jī)化學(xué)家發(fā)現(xiàn)取代基構(gòu)象、環(huán)張力等因素也對IEDDA 的反應(yīng)速率有重要影響.Fox研究組利用額外的三元環(huán)所產(chǎn)生的張力使TCO 八元環(huán)構(gòu)象改變[48],以更高能量狀態(tài)的“半椅式”構(gòu)象存在,顯著提升了反應(yīng)速率.Vrabel課題組研究表明TCO 上取代基構(gòu)像的不同也會(huì)對親雙烯體的反應(yīng)活性有重要影響,直立構(gòu)象的羥基作為質(zhì)子受體協(xié)助氫原子異構(gòu),從而提高反應(yīng)效率[52].除了TCO 之外,Chin等研究者發(fā)展了基于降冰片烯(norborene)官能團(tuán)的IEDDA 定點(diǎn)修飾蛋白方法[55],Prescher和葉新山等研究者也利用基于環(huán)丙烯與四嗪的IEDDA 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了活體表面糖蛋白的定點(diǎn)修飾與標(biāo)記[56-57].

在IEDDA 剪切反應(yīng)中,取代基位于TCO 直立構(gòu)象時(shí)的反應(yīng)速率也遠(yuǎn)大于平伏構(gòu)象時(shí)的速率(如圖11所示)[58].該剪切反正中,最常用的剪切鏈接方式為氨基甲酸酯[21].Weissleder課題組提出“氨甲基化”策略,對TCO 分子的剪切鏈接臂進(jìn)行氨基烷基化,能夠阻斷分子內(nèi)成環(huán)對反應(yīng)速率的影響,從而避免分子內(nèi)消除成環(huán)的副產(chǎn)物,對IEDDA 剪切反應(yīng)的剪切鏈接臂的設(shè)計(jì)提供了新的思路,但是氨基甲基化對剪切釋放的活性分子的性能和活性可能有一定的影響,還有待進(jìn)一步研究.

圖11 IEDDA 偶聯(lián)、剪切反應(yīng)及具高度環(huán)張力的親雙烯體

2.3 Staudinger偶聯(lián)反應(yīng)(Staudinger ligation)

2000年,Bertozzi課題組報(bào)道了改進(jìn)型的疊氮和三苯基膦之間的Staudinger偶聯(lián)反應(yīng)[59],該反應(yīng)在水相介質(zhì)中進(jìn)行,重排后得到分子內(nèi)酰胺基氧化膦(如圖12所示),被用于細(xì)胞表面糖的標(biāo)記等.此外,該偶聯(lián)反應(yīng)生成的氧化膦會(huì)調(diào)節(jié)熒光染料的強(qiáng)度,有著熒光增強(qiáng)或開關(guān)(turn on)的特色應(yīng)用[60],在膦硫酯修飾的多肽的化學(xué)偶聯(lián)、?；被?、核酸及蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾中也有較廣應(yīng)用[61-62].

圖12 傳統(tǒng)和改進(jìn)型Staudinger偶聯(lián)反應(yīng)

最近,Brase等系統(tǒng)綜述介紹了Staudinger偶聯(lián)反應(yīng)在生物正交反應(yīng)中的原理和應(yīng)用[63].盡管Staudinger偶聯(lián)反應(yīng)由于其幾乎無生物毒性的反應(yīng)條件而備受青睞,但需要注意的是由于體內(nèi)或體外系統(tǒng)中未結(jié)合的膦烷-生物素實(shí)體的不完全去除,疊氮和膦可能與細(xì)胞體內(nèi)的氧化還原物質(zhì)(比如自由巰基或者活性氧物質(zhì)等)發(fā)生副反應(yīng),這會(huì)增強(qiáng)背景熒光,干擾標(biāo)記的準(zhǔn)確性,限制了細(xì)胞標(biāo)記的使用.Prescher等學(xué)者系統(tǒng)總結(jié)了近20年三苯基膦衍生物在生物正交反應(yīng)中的發(fā)展了應(yīng)用,彰顯了三苯基膦介導(dǎo)的Staudinger反應(yīng)的多樣性和在生物化學(xué)尤其是蛋白等標(biāo)記中的作用[64].

2.4 其它無需金屬催化的生物正交反應(yīng)

除了以上3 類反應(yīng)之外,醛/酮-羥胺縮合反應(yīng)(aldehyde/ketone-hydroxylamine condensation reaction)也是一類無需金屬催化的生物正交反應(yīng),亦被用于蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記外和藥物的靶向運(yùn)輸[65].目前已經(jīng)有將藥物分子偶聯(lián)在羥胺分子上,通過醛/酮-羥胺縮合反應(yīng)識別特異性抗原的抗體之上的羰基來達(dá)到疾病治療的目的[66].此外,發(fā)生在2-氰基-苯并噻唑(CBT)和半胱氨酸-1,2-氨基硫醇基團(tuán)之間的半胱氨酸-CBT 縮合反應(yīng)(1,2-aminothiol CBT condensation)也是一類不需要金屬催化的生物正交反應(yīng),且能夠通過生理?xiàng)l件中的p H、還原劑或者酶進(jìn)行調(diào)控[67],可實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾或標(biāo)記[68-69],在分子影像學(xué)和藥物靶向輸送中也有一定的應(yīng)用.

3 光催化的生物正交反應(yīng)

相較于金屬催化的生物正交反應(yīng),光介導(dǎo)的反應(yīng)由于其利用外源光的便捷性和可控性,在時(shí)間分辨等方面具有天然的優(yōu)勢,近年來得到了廣泛的關(guān)注.

3.1 紫外光催化的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)

1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)在無金屬催化下也得以成功實(shí)現(xiàn).由于二芳基取代的悉尼酮在紫外光的照射下會(huì)快速生成高活性的1,3-偶極中間體,與烯烴發(fā)生[3+2]環(huán)加成反應(yīng),余志鵬課題組通篩選出了高活性二芳基取代悉尼酮,與不同烯烴、炔烴進(jìn)行組合,構(gòu)建了多種生物正交偶聯(lián)反應(yīng)類型,從而實(shí)現(xiàn)對生物體系中不同多肽和蛋白質(zhì)的選擇性標(biāo)記(如圖13所示)[70].

圖13 紫外光催化的悉尼酮參與的1,3-偶極環(huán)加成

四氮唑在被紫外光照射之后生成的活潑1,3-偶極子,與烯烴快速發(fā)生環(huán)加成反應(yīng),是光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的代表性反應(yīng)之一.熒光化合物被四氮唑修飾之后通常會(huì)處于淬滅狀態(tài),而當(dāng)四氮唑與烯烴發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)之后會(huì)恢復(fù)熒光.利用這一原理可對特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記.在大腸桿菌與哺乳細(xì)胞HEK293 的蛋白中定點(diǎn)插入了含有雙鍵的人工合成非天然氨基酸,然后加入四氮唑修飾的無熒光染料進(jìn)入細(xì)胞(如圖14(a)所示).Lin等發(fā)現(xiàn)在365 nm 的紫外光照射下,染料在大腸桿菌與HEK293細(xì)胞中均恢復(fù)相應(yīng)的熒光,這得益于四氮唑與非天然氨基酸的雙鍵在細(xì)胞中的快速環(huán)加成反應(yīng)[71].該課題組還開發(fā)了帶有含有雙環(huán)烯烴的效率更高的反應(yīng)(如圖14(b)所示),其二級速率常數(shù)高達(dá)(1 850±218)L·mol-1·s-1,可以更有效定點(diǎn)標(biāo)記綠色熒光蛋白[72].

圖14 紫外光催化的烯烴參與的1,3-偶極環(huán)加成

由于365nm 的紫外光會(huì)對細(xì)胞造成較大的損傷,Lin研究組成功開發(fā)出能用405 nm 波長激光來激活的四氮唑底物,這種四氮唑能與延胡索酸類似物發(fā)生快速反應(yīng).基于這一反應(yīng),該課題組利用延胡索酸修飾的紫杉醇和帶染料的四氮唑化合物激光激活,實(shí)現(xiàn)了對微管蛋白的實(shí)時(shí)觀察[73].

3.2 可見光催化的生物正交偶聯(lián)反應(yīng)

除紫外光外,可見光催化的化學(xué)反應(yīng)在生物大分子的偶聯(lián)修飾中越來越廣.陳以昀課題組報(bào)道了一種光催化的自由基偶聯(lián)反應(yīng),N-酰氧基鄰苯二甲酰亞胺修飾的底物在可見光的誘導(dǎo)下產(chǎn)生活性自由基,與磺酰苯基修飾的芳香炔發(fā)生偶聯(lián)(如圖15(a)所示)[74],且具有較好的生物相容性與特異性(如圖15(b)所示)[75].

圖15 可見光催化的生物正交偶聯(lián)反應(yīng)

張艷課題組報(bào)道了可見光催化的菲醌與富電子烯烴的[4+2]環(huán)加成光化學(xué)反應(yīng),這種反應(yīng)有著較好的專一性和兼容性,可以在生命體系中快速發(fā)生.并且可用于小牛血清蛋白的特異性標(biāo)記,具有一定的時(shí)間分辨率,在生物體系中與銅催化的Cu AAC 反應(yīng)有著良好的兼容性,為在活以內(nèi)特異性標(biāo)記蛋白提供了新的策略(如圖16所示)[76].

圖16 可見光催化的菲醌與富電子烯烴的[4+2]環(huán)加成反應(yīng)

3.3 光催化的生物正交剪切反應(yīng)

與偶聯(lián)反應(yīng)不同,光催化的生物正交剪切反應(yīng)能實(shí)現(xiàn)生物體系內(nèi)的蛋白質(zhì)的“化學(xué)脫籠”,完成蛋白質(zhì)的原位激活,極大地方便了生物體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.目前常用的光控的生物正交剪切反應(yīng)是以紫外光催化的鄰硝基苯的脫除反應(yīng).同時(shí)也不斷有新的光催化的生物正交剪切反應(yīng)被開發(fā).例如陳以昀課題組開發(fā)了一種以熒光素為介質(zhì),紫外光催化為條件的硼酸頻哪醇酯脫籠反應(yīng),該反應(yīng)已被用于多種活細(xì)胞中[77].除紫外光、可見光等光催化條件外,劉志博等開發(fā)了輻射驅(qū)動(dòng)的生物正交剪切反應(yīng).用二羥基芐基碳酸酯保護(hù)的活性分子能夠與輻射產(chǎn)生的羥基自由基發(fā)生反應(yīng),進(jìn)而脫除二羥基芐基碳酸酯,釋放活性分子[78].利用這一原理,可以將抗癌藥物進(jìn)行修飾,與外源性輻射相結(jié)合,可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)精確地釋放藥物,減輕抗癌藥物的毒性.同時(shí)也可以將熒光分子進(jìn)行修飾,控制其在生物體系中的定點(diǎn)釋放(如圖17所示).

圖17 輻射介導(dǎo)的生物正交剪切反應(yīng)

4 生物正交反應(yīng)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用

4.1 生物正交反應(yīng)在活性藥物分子發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

在生物體內(nèi),小分子在特定作用器官或病灶位點(diǎn)的原位自組裝是一種發(fā)現(xiàn)藥物活性分子的極具優(yōu)勢的潛在方法[79].利用生物正交反應(yīng)尤其是疊氮和末端炔基之間的環(huán)加成反應(yīng)把兩個(gè)藥物片段原位連接,可用于設(shè)計(jì)靶點(diǎn)蛋白的抑制劑(如圖18所示)[80].利用這種方法,研究者們通過庫篩選的方法獲得了活性較好的乙酰膽堿酯酶、碳酸酐酶等酶抑制劑[81].

圖18 原位疊氮和末端炔基環(huán)加成反應(yīng)用于靶點(diǎn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)

作為生物正交反應(yīng)中反應(yīng)速率最快的反應(yīng),逆電子需求的狄爾斯-阿爾德(IEDDA)反應(yīng)可在細(xì)胞中用于發(fā)現(xiàn)活性藥物分子[82],Astex Pharmaceutical公司的研究表明,四嗪和反式環(huán)辛烯介導(dǎo)的反應(yīng)可以在活細(xì)胞中將BRD4 或ERK1/2 抑制劑與E3 連接酶CRBN 的配體thalidomide連接起來(如圖19所示),能夠快速優(yōu)化連接方式得到活性很好的PROTACs分子[83].

圖19 IEDDA 反應(yīng)用于靶點(diǎn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)

4.2 生物正交反應(yīng)在靶向藥物遞送和前藥設(shè)計(jì)與激活中的應(yīng)用

除了在細(xì)胞中篩選活性分子之外,生物正交反應(yīng)在疾病的靶向藥物遞送尤其是在活體中前藥的遞送和激活中有著廣泛的應(yīng)用,這主要得益于生物正交剪切反應(yīng)或者click-to-release 反應(yīng)的發(fā)展.2014 年Bradley和Uniciti-Broceta等首次利用具有生物相容性的零價(jià)鈀樹脂在斑馬魚的胚胎卵黃囊中催化剪切釋放出熒光探針[84],這個(gè)研究直接促進(jìn)了4 年后Weissleder等在小鼠體內(nèi)利用Pd納米材料催化釋放阿霉素的研究[85],由于該P(yáng)d納米材料能有效地在腫瘤部位累積,這種策略可以極大降低阿霉素的毒副作用.Pd催化的生物正交剪切反應(yīng)也可用于微針?biāo)幬镞f送等領(lǐng)域.最近,Gu研究組開發(fā)了一款能夠?qū)崿F(xiàn)化療藥增效減毒的生物正交催化貼劑(Bioorthogonal Catalytic Patch)(如圖20所示),將其貼在小鼠黑色素瘤周皮膚上,明顯減慢了腫瘤增殖速度[86].

圖20 IEDDA 剪切反應(yīng)在阿霉素藥物的激活和釋放應(yīng)用

除了Pd催化的生物正交剪切反應(yīng),基于IEDDA的生物正交反應(yīng)也被用于癌癥等疾病的靶向藥物遞送和治療中[87].與IEDDA 偶聯(lián)反應(yīng)不同,IEDDA 剪切反應(yīng)可以使被臨時(shí)修飾而失去活性的分子恢復(fù)活性,因此可被用于前藥的激活研究中.Robillard等早在2013年便報(bào)道了利用IEDDA 剪切反應(yīng)來激活阿霉素前藥的研究[88].他們以氨基甲酸酯為連接方式將TCO 連接在阿霉素上制成毒性較小的前藥,與四嗪分子反應(yīng)之后生成阿霉素和CO2分子,從而實(shí)現(xiàn)前藥的激活.Xie等將阿霉素前藥裝載入腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的納米載體,在腫瘤部位精準(zhǔn)釋放后,與包裹在納米載體中的四嗪快速反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)化學(xué)脫籠釋放前藥(如圖21所示),因此可用于腫瘤的治療[89].

圖21 IEDDA 剪切反應(yīng)在阿霉素藥物的激活和釋放應(yīng)用

除了靶向遞送小分子前藥之外,生物正交剪切反應(yīng)也可用于蛋白藥物的靶向遞送.Haag等通過IEDDA 偶聯(lián)制備了一種pH 響應(yīng)型納米凝膠,把具有顯著抗腫瘤作用的天冬酰胺酶高效包裹,該納米藥物到達(dá)腫瘤部位后,由于微環(huán)境的差異在腫瘤部位靶向釋放藥物[90],這是一種先進(jìn)的智能抗腫瘤藥物(如圖22所示),也可解決蛋白藥物穩(wěn)定性差的問題[91].

圖22 IEDDA 應(yīng)用于靶向藥物輸送和治療

4.3 生物正交反應(yīng)在藥物靶點(diǎn)研究中的應(yīng)用

活性分子的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和選擇性研究在藥物化學(xué)中尤為重要,傳統(tǒng)方法都是在體外進(jìn)行的.得益于生物正交反應(yīng)獨(dú)特的反應(yīng)選擇性和反應(yīng)速率,研究者可以在細(xì)胞中原位進(jìn)行藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和藥物動(dòng)力學(xué)研究.Weissleder課題組將連有TCO 的PARP1 抑制劑奧拉帕尼與細(xì)胞共孵育之后,可用連有四嗪的樹脂將其它與奧拉帕尼可能結(jié)合的蛋白捕獲(如圖23所示),進(jìn)而通過質(zhì)譜等手段確定所結(jié)合的蛋白[92].

圖23 IEDDA 應(yīng)用于藥物靶點(diǎn)捕獲和驗(yàn)證

Yao研究組發(fā)展了一種同時(shí)含有能原位參與光親和標(biāo)記基團(tuán)-活性導(dǎo)向的蛋白譜學(xué)分析技術(shù)(photoaffinity labeling group-activity-based protein profiling,PLG-ABPP)和IEDDA 反應(yīng)的雙功能化學(xué)探針,在肝細(xì)胞Hep G2中成功實(shí)施了蛋白質(zhì)組分析(如圖24所示),極大提高了(+)-JQ1的脫靶性研究可靠性[93].

圖24 基于IEDDA 的雙功能化學(xué)探針應(yīng)用于藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

4.4 生物正交反應(yīng)在抗體-藥物偶聯(lián)物中的應(yīng)用

單克隆抗體在抗體-藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugates,ADC)和腫瘤治療中越來越重要,已有多個(gè)ADC被FDA 批準(zhǔn)或正在臨床實(shí)驗(yàn)中[94].但是其本身清除速率非常慢,對ADC 藥物尤其是放射藥物的臨床應(yīng)用極為不利,此外,傳統(tǒng)ADC對于腫瘤細(xì)胞表面低表達(dá)相關(guān)受體的腫瘤治療效果不好.Robillard等首先將四嗪與TCO 之間的IEDDA 剪切反應(yīng)用于設(shè)計(jì)在腫瘤位點(diǎn)遞送阿霉素的ADC88,該課題組也設(shè)計(jì)了能夠選擇性釋放微管蛋白抑制劑(monomethyl auristatin E,MMAE)的ADC,這類非內(nèi)吞型的ADC在釋放MMAE前選擇性富集在腫瘤細(xì)胞表面,而在正常健康組織里的保留時(shí)間非常短.加入TCO后,MMAE快速釋放并可被動(dòng)浸入附近的癌細(xì)胞(如圖25所示),這對于殺死不表達(dá)或低表達(dá)表面受體的癌細(xì)胞尤為重要[95].Liu和Shao等發(fā)現(xiàn)三氟化硼基團(tuán)硼氨酸(Phe-BF3)可以使酚羥基上的硅烷選擇性脫除(如圖26所示).采用這種新型的生物正交剪切反應(yīng),他們制備了新的ADC即trastuzumab-MMAE,向體系中加入具有腫瘤靶向功能的Phe-BF3 探針后,在腫瘤組織中高濃度原位釋放MMAE[96].利用同樣的生物正交策略,他們將攜帶Gasdermin蛋白的納米顆粒遞送在腫瘤組織并對細(xì)胞凋亡過程進(jìn)行了原位調(diào)控,進(jìn)一步激活了T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng),這個(gè)原理驗(yàn)證(proof of principle)研究為腫瘤免疫治療藥物的開發(fā)提供了新的技術(shù)手段.

圖25 IEDDA剪切反應(yīng)在選擇性釋放MMAE的ADC中的應(yīng)用

圖26 IEDDA 剪切反應(yīng)在ADC中的應(yīng)用

生物正交反應(yīng)尤其是IEDDA 和SPAAC反應(yīng)在預(yù)靶向放射免疫治療(pretargeting radioimmunotherapy,PRIT)和放射性物質(zhì)預(yù)靶向成像(pretargeting imaging)中也有越來越多的應(yīng)用.Zeglis等首次利用IEDDA 反應(yīng)將5B1-TCO 單抗靜脈注射在胰腺癌腫瘤組織,72 h 后注射177Lu-DOTA-PEG7的四嗪衍生物,結(jié)果表明腫瘤體積明顯減小(如圖27 所示)[97].該研究組在后期的工作中利用hu A33-TCO單抗和177Lu-DOTA-PEG7-Tz的IEDDA 反應(yīng)甚至發(fā)現(xiàn)這種策略在小鼠結(jié)腸模型中可獲得100%的存活率[98].

圖27 IEDDA 剪切反應(yīng)在預(yù)靶向放射免疫治療中的應(yīng)用

傳統(tǒng)放射性物質(zhì)成像中,帶有放射基團(tuán)的ADC本身清除速率非常慢.如果先給小鼠注射帶有生物正交反應(yīng)官能團(tuán)的非放射性抗體,在其到達(dá)作用部位和合適的時(shí)間點(diǎn)時(shí),再加入帶有四嗪的放射性小分子,二者可快速反應(yīng)并在指定位點(diǎn)成像(如圖28所示)[99],該策略能解決放射性藥物清除速率慢的問題.

圖28 IEDDA 剪切反應(yīng)在放射性ADC中的應(yīng)用

5 總結(jié)與展望

生物正交反應(yīng)為化學(xué)生物學(xué)發(fā)展和研究生命進(jìn)程帶來了革命性的技術(shù)方法,為該領(lǐng)域的核心研究策略之一.過去的20年見證了眾多研究團(tuán)隊(duì)對Cu AAC,SPAAC,IEDDA 等反應(yīng)的機(jī)理、反應(yīng)速率、反應(yīng)前驅(qū)體的設(shè)計(jì)等進(jìn)行的深入研究.由于其高度的專一性、較高的反應(yīng)速率和良好的生物兼容性,生物正交反應(yīng)在細(xì)胞和動(dòng)物中有著越來越多的應(yīng)用.研究者們可以對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖等生物大分子定點(diǎn)修飾進(jìn)而成像,也可以對細(xì)胞、組織和活體動(dòng)物等不同層面的生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測.

近年來由于藥物耐藥性問題的不斷出現(xiàn),快速發(fā)現(xiàn)新的活性藥物骨架和新型疾病相關(guān)靶點(diǎn)抑制劑等方法備受關(guān)注.生物正交反應(yīng)已經(jīng)在激酶如乙酰膽堿酯酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)中逐漸嶄露頭角,也加速了PROTACs連接方式的優(yōu)化.在疾病尤其是腫瘤的靶向治療中,生物正交剪切反應(yīng)也受到了藥學(xué)研究者的青睞,既可以用于蛋白藥物的靶向遞送,也對小分子藥物在腫瘤部位的富集和滲透起到了極大的促進(jìn)作用,從而提高了其治療效果并能降低藥物毒性.不僅如此,生物正交反應(yīng)對于在細(xì)胞中原位進(jìn)行藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和藥物動(dòng)力學(xué)研究也有重要意義,也可以與蛋白譜學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合,提高藥物脫靶性研究的可靠性.

在當(dāng)今生物正交反應(yīng)面臨反應(yīng)新拓展和應(yīng)用新升級的關(guān)鍵時(shí)期,研究效率更高、原料更加易得、相互正交性和生物兼容性更好的反應(yīng)類型仍然是個(gè)長期挑戰(zhàn),尤其是用于活體動(dòng)物的生物正交反應(yīng)升級更加迫切和艱巨.技術(shù)為應(yīng)用而生,如何將這些革命性的技術(shù)應(yīng)用在解決生命科學(xué)和原創(chuàng)新藥發(fā)現(xiàn)中,是生物正交反應(yīng)的下一個(gè)重要發(fā)展方向.期待生物正交反應(yīng)在臨床診斷、小分子藥物、蛋白質(zhì)前藥和ADC等藥學(xué)領(lǐng)域中有更加廣闊和有效的應(yīng)用前景.