安石榴苷與焦磷酸鈉對(duì)肌原纖維蛋白氧化穩(wěn)定性及凝膠性能的影響

韓馨蕊，李 穎，劉苗苗，范 鑫，馮 莉，曹云剛*

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

肉及肉制品中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，是人體攝入能量和營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源，深受大眾喜愛(ài)[1]。肉蛋白，尤其是肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP），能夠形成熱誘導(dǎo)凝膠，從而賦予肉類(lèi)制品良好的質(zhì)地和口感[2]。然而由于宰后肌肉體系中抗氧化系統(tǒng)的崩潰以及鐵離子等過(guò)渡金屬離子的存在等，肉蛋白在加工及貯藏過(guò)程中極易受到自由基或非自由基攻擊而發(fā)生氧化，主要表現(xiàn)為蛋白溶解性和凝膠性等劣變，最終影響肉制品的品質(zhì)[3-5]。因此有效抑制肉蛋白氧化或提高氧化損傷肉蛋白的凝膠性能具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)，天然植物源抗氧化劑由于具有來(lái)源廣泛、種類(lèi)多、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，在肉制品中的應(yīng)用逐漸引起肉品企業(yè)和科研工作者的關(guān)注。諸如迷迭香提取物[6]、花椒葉提取物[7]和茶多酚等多種天然抗氧化劑已被證明可以在一定程度上抑制蛋白氧化、提高肉品品質(zhì)。此外，多酚類(lèi)物質(zhì)在富含蛋白的體系中還可以通過(guò)共價(jià)和非共價(jià)反應(yīng)與蛋白的官能團(tuán)相互作用，從而影響蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集和凝膠性能[8]。安石榴苷是石榴皮中的重要活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等多種生理功效，在醫(yī)療、保健和功能性食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[9]，但安石榴苷作為天然抗氧化劑對(duì)肉蛋白氧化穩(wěn)定性及凝膠性能的影響尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

多聚磷酸鹽是肉制品加工中應(yīng)用最廣泛的一種食品改良劑，可以引起活性氨基酸殘基及蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)加工過(guò)程中MP的凝膠化作用[10]。肉制品加工過(guò)程中允許使用的多聚磷酸鹽主要有焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）和六偏磷酸鈉等[11]。SPP是ATP的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，當(dāng)適宜濃度（生理水平）Mg2+存在時(shí)，PP可以與肌球蛋白頭部S1結(jié)合，引起肌動(dòng)球蛋白解離[10]，在肉制品加工中應(yīng)用最為廣泛。SPP提高肉制品保水性的作用機(jī)制主要包括提高pH值、提高離子強(qiáng)度、螯合金屬離子、解離肌動(dòng)球蛋白[10]?？梢?jiàn)，SPP除具有提高肉制品保水性的功能外，還具有優(yōu)良的金屬離子螯合能力，因而也具有一定的抗氧化性能[12]。然而目前關(guān)于SPP作為抗氧化劑對(duì)肉蛋白氧化穩(wěn)定性的影響以及SPP作為品質(zhì)改良劑對(duì)氧化損傷肉蛋白凝膠性能的影響等鮮有研究，安石榴苷與SPP復(fù)配對(duì)肉蛋白氧化穩(wěn)定性和凝膠性能的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以MP為研究對(duì)象，在羥自由基氧化體系下探究安石榴苷（自由基清除劑）和SPP（金屬離子螯合劑和保水劑）對(duì)MP氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)、構(gòu)象、凝膠行為和凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為天然抗氧化劑在肉制品中的科學(xué)合理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長(zhǎng)肌購(gòu)于當(dāng)?shù)卮笮统?，置于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除可見(jiàn)脂肪及結(jié)締組織，分裝，每袋約100 g，于-18 ℃冷凍貯藏備用。

安石榴苷（純度＞95%，CAS：65995-63-3）成都普思生物科技股份有限公司；水溶性VE（Trolox）、2,4,6-三硝基苯磺酸 美國(guó)Ark Pharm公司；哌嗪-1,4-二乙磺酸（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）、2,4-二硝基苯肼 生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯乙酸、石油醚、抗壞血酸、鹽酸胍 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HR/T20M立式冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CM-5分光測(cè)色計(jì) 柯尼卡-美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；UV2900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TA.XT Plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro System公司；Haake mars 60型流變儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Chirascan-plus 101圓二色光譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀 英國(guó)馬爾文儀器公司；FEI Q45+EDAX Octane Prime型掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司；Spectrofluorometer FS5熒光光譜儀 英國(guó)愛(ài)丁堡公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參照Cao Yungang等[12]的方法：將冷凍貯藏的備用肉流水解凍，切成小塊置于組織搗碎機(jī)中，加入4 倍體積的僵直液（含0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L磷酸鈉、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，pH 7.0），低速檔攪拌1 min后離心（4 ℃、1 500hg，15 min）取上清液，重復(fù)提取3次，所得沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，攪拌均勻并經(jīng)紗布過(guò)濾去除結(jié)締組織，調(diào)節(jié)pH值至6.25，離心，所得沉淀即為MP。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.2 MP的氧化處理

將MP膏用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）稀釋至所需質(zhì)量濃度，分別加入新鮮配置的安石榴苷（記作P）、SPP及二者組合（P+SPP）溶液，攪拌均勻后在4 ℃下于Fenton氧化體系（10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗壞血酸、3 mmol/L H2O2）氧化12 h，添加Trolox終止氧化反應(yīng)。最終體系蛋白質(zhì)量濃度為30 mg/mL，安石榴苷添加量為50 mg/kg，SPP濃度為2 mmol/L（添加0.2 mmol/L MgCl2輔助SPP發(fā)揮作用）。同時(shí)制備未添加抗氧化劑的未氧化（Control）和氧化（Ox）對(duì)照組。

1.3.3 MP的化學(xué)和結(jié)構(gòu)變化分析

1.3.3.1 氨基酸側(cè)鏈修飾

羰基含量的測(cè)定：參照李保玲等[13]的方法，采用2,4-二硝基苯肼法測(cè)定蛋白羰基含量，結(jié)果以每毫克蛋白所含羰基含量表示，單位nmol/mg。

總巰基含量的測(cè)定：參照李穎等[14]的方法，將MP用PIPES緩沖液稀釋至2 mg/mL，用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）法測(cè)定蛋白總巰基含量，結(jié)果以每毫克蛋白所含巰基含量表示，單位nmol/mg。

自由氨基含量的測(cè)定：參照Benjakul等[15]的方法測(cè)定蛋白自由氨基含量，并以L-亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.230 7x+0.005 8），樣品中自由氨基含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算確定。

1.3.3.2 蛋白的構(gòu)象變化

二級(jí)結(jié)構(gòu)：參照曹云剛[16]的方法通過(guò)圓二色光譜儀分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。各組蛋白溶液用PIPES緩沖液稀釋至0.2 mg/mL，掃描范圍為200～260 nm，并扣除溶劑背景。

三級(jí)結(jié)構(gòu)：采用熒光光譜儀分析，各組蛋白溶液用PIPES緩沖液稀釋至0.4 mg/mL，激發(fā)波長(zhǎng)283 nm，發(fā)射光譜290～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3.50 nm，同樣扣除溶劑背景[17]。

粒徑測(cè)定：采用激光粒度分析儀測(cè)定，各組蛋白溶液（2 mg/mL）分散于蒸餾水中，添加樣品時(shí)遮光度需達(dá)到10%～13%，以避免多次散射。設(shè)置MP顆粒折射率為1.570，分散劑折射率為1.330，吸收指數(shù)為0.001。

1.3.4 溶解度測(cè)定

參照Cao Yungang等[8]的方法，將各組蛋白溶液（30 mg/mL）用PIPES緩沖液稀釋至2 mg/mL，于4 ℃、5 000hg條件下離心15 min，采用雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算蛋白溶解度：

1.3.5 MP的流變學(xué)行為表征

參照Li Chunqiang等[18]的方法，將各組蛋白溶液（30 mg/mL）于4 ℃、1 000hg條件下離心1 min去除氣泡。在振蕩模式下平衡3 min后，以1 ℃/min升溫速率由20 ℃加熱至80 ℃，振蕩頻率0.1 Hz，最大應(yīng)力0.02，結(jié)果以彈性模量（G’）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.3.6 MP的熱誘導(dǎo)凝膠性能測(cè)定

1.3.6.1 熱誘導(dǎo)凝膠制備

稱(chēng)取約5 g MP溶膠于制膠小瓶中，輕輕振蕩均勻，蓋好木塞，水浴加熱，以1 ℃/min的升溫速率由20 ℃加熱至75 ℃后并保溫10 min，將凝膠取出置于冰水浴冷卻30 min，4 ℃冰箱過(guò)夜保存。凝膠性能的測(cè)定前蛋白凝膠需從冰箱取出平衡2 h。

1.3.6.2 蒸煮損失和凝膠白度測(cè)定

蒸煮損失：將蛋白凝膠與制膠小瓶的瓶壁分離，在濾紙上倒置20 min，待蒸煮汁液完全流盡后稱(chēng)質(zhì)量。按式（2）計(jì)算蒸煮損失率：

凝膠白度：參照Xia Xiufang等[19]的方法，采用CM-5分光測(cè)色計(jì)經(jīng)自檢及零點(diǎn)、白板校正后，測(cè)定各組凝膠樣品亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），并根據(jù)式（3）計(jì)算凝膠白度：

1.3.6.3 熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定

參照王耀松等[20]的方法并稍作修改，采用物性測(cè)試儀測(cè)定各組蛋白凝膠的硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性、黏聚性。用不銹鋼小鏟輕輕將蛋白凝膠與制膠小瓶分離并取出，置于質(zhì)構(gòu)儀平板上進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。探頭型號(hào)P/75，下壓比30%，觸發(fā)力10 g，測(cè)前速率2 mm/min，測(cè)中速率2 mm/min，測(cè)后速率50 mm/s。

1.3.6.4 凝膠的微觀結(jié)構(gòu)表征

參照Z(yǔ)hao Yinyun等[21]的方法并稍作修改，用小刀片將蛋白凝膠切成適宜大小，將樣品用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定4 h后，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液清洗3次，然后依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、95%、100%的乙醇浸泡30 min脫水，樣品經(jīng)冷凍干燥后噴金，用掃描電子顯微鏡觀察凝膠樣品微觀結(jié)構(gòu)。設(shè)置加速電壓15 kV，放大倍數(shù)5 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2～3次，每次重復(fù)3個(gè)平行。采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Statistix 9軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）和方差分析，采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)MP氨基酸側(cè)鏈修飾程度的影響

2.1.1 蛋白羰基含量

蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈含有許多官能團(tuán)，容易被氧化產(chǎn)生羰基化衍生物，所以羰基含量可作為評(píng)價(jià)蛋白氧化程度的重要指標(biāo)[22]。如表1所示，Control組MP的羰基含量為1.54 nmol/mg，而氧化12 h后Ox組MP的羰基含量迅速升高至3.15 nmol/mg，安石榴苷和SPP的添加能有效抑制氧化導(dǎo)致的蛋白羰基含量上升，抑制效率均達(dá)35%，且二者復(fù)配效果更好。這可能是由于安石榴苷具有較強(qiáng)自由基清除能力[23]，SPP具有良好的金屬離子螯合能力[24]，二者復(fù)配使用時(shí)可以更有效地抑制氧化反應(yīng)。與本研究結(jié)果類(lèi)似，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SPP添加能有效抑制蛋白羰基的生成，SPP與兒茶素復(fù)合在抑制蛋白羰基生成方面具有協(xié)同作用[8]。但值得注意的是，植物多酚對(duì)蛋白羰基生成的影響與多酚種類(lèi)、濃度及實(shí)驗(yàn)條件等有關(guān)[12]。

表1 不同處理對(duì)MP氨基酸側(cè)鏈修飾的影響Table 1 Effects of different treatments on the modification of amino acid side chains of MP nmol/mg

2.1.2 總巰基含量

MP主要由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白組成，這兩種蛋白中均含有巰基且不含二硫鍵，其中肌球蛋白中巰基含量較高[19]，巰基易遭受羥自由基攻擊形成二硫鍵使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)。如表1所示，Control組MP的巰基含量為83.75 nmol/mg，而氧化12 h后Ox組MP的巰基含量降低至77.57 nmol/mg，添加安石榴苷和SPP在一定程度上抑制了巰基的損失，但效果并不顯著（P＞0.05）。這可能是由于一方面SPP可以螯合金屬離子降低氧化反應(yīng)的發(fā)生，但另一方面SPP可以促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白解離、提高M(jìn)P的溶解度，這提高了羥自由基攻擊MP的幾率[25]；同時(shí)安石榴苷作為自由基清除劑可以抑制氧化反應(yīng)，但是安石榴苷自身被氧化為半醌或醌類(lèi)物質(zhì)，后者又可以與蛋白巰基發(fā)生加成反應(yīng)，導(dǎo)致巰基含量降低[26]。因而，本實(shí)驗(yàn)中抗氧化劑對(duì)蛋白巰基含量的影響是多種因素綜合作用的結(jié)果。

2.1.3 自由氨基含量

蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸側(cè)鏈的ε-NH2基團(tuán)易遭受自由基攻擊，經(jīng)脫氨基過(guò)程生成羰基，后者又可以與NH2發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使自由氨基含量進(jìn)一步降低[2]。如表1所示，Control組MP的自由氨基含量為98.83 nmol/mg，氧化12 h后，Ox組MP自由氨基含量降低至92.69 nmol/mg，降低了6.2%，安石榴苷和SPP的存在減緩了自由氨基含量的降低幅度，這與抑制蛋白羰基含量變化趨勢(shì)相似。綜合蛋白羰基、總巰基和自由氨基含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，安石榴苷和SPP的添加對(duì)于抑制氧化誘導(dǎo)的蛋白氨基酸側(cè)鏈功能基團(tuán)修飾具有積極作用，且二者具有一定協(xié)同抑制效果。

2.2 不同處理對(duì)MP構(gòu)象的影響

2.2.1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

如圖1所示，Control組MP的圓二色光譜曲線在222 nm處出現(xiàn)負(fù)峰，這是由于MP中肌球蛋白尾部含有大量的α-螺旋結(jié)構(gòu)，Ox組MP在222 nm處峰值降低，說(shuō)明α-螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，與此同時(shí)形成更多的β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[27]。添加安石榴苷和SPP進(jìn)一步加劇了α-螺旋結(jié)構(gòu)的損失，這可能是由于安石榴苷結(jié)構(gòu)中含有大量羥基，會(huì)影響維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定氫鍵的穩(wěn)定性[28]，導(dǎo)致α-螺旋解旋；此外，Kang Juan等[28]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸與大豆蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)降低、無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加。因此安石榴苷氧化產(chǎn)物與MP中氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的共價(jià)結(jié)合也可能導(dǎo)致α-螺旋降低[29]。SPP的存在可以與肌球蛋白活性部位結(jié)合，使肌球蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)部分喪失[30]。

圖1 不同處理對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of different treatments on the secondary structures of MP

2.2.2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)變化

蛋白內(nèi)源性色氨酸熒光特性通常被用于反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[31]。如圖2所示，Control組MP在最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度可達(dá)436h104cps，Ox組氧化12 h的MP熒光強(qiáng)度為409h104cps，明顯低于Control組，說(shuō)明氧化導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)展開(kāi)。SPP和安石榴苷添加進(jìn)一步導(dǎo)致MP內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度降低，這說(shuō)明SPP和安石榴苷添加促進(jìn)了氧化條件下MP結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，且安石榴苷的效應(yīng)更加明顯，這可能與兩種抗氧化劑對(duì)MP空間構(gòu)象的影響有關(guān)。

圖2 不同處理對(duì)MP內(nèi)源性色氨酸熒光的影響Fig.2 Effects of different treatments on the intrinsic tryptophan fluorescence spectrum of MP

2.2.3 MP粒徑變化

如圖3所示，與Control組MP相比，氧化應(yīng)激使MP的平均粒徑增大10.2%（P＜0.05），這是由于氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，并促進(jìn)蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集，導(dǎo)致其分子粒徑增大。安石榴苷添加明顯抑制了氧化導(dǎo)致的MP平均粒徑增大，抑制率達(dá)10.50%，其粒徑與Control組相當(dāng)。添加SPP顯著降低了氧化MP的平均粒徑，較Ox組降低17.65%，這是由于SPP可以解離肌動(dòng)球蛋白為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，降低了MP溶膠體系的平均粒徑[32]。安石榴苷與SPP復(fù)配組的粒徑與SPP組基本一致，說(shuō)明SPP對(duì)MP粒徑的影響更大。

圖3 不同處理對(duì)MP平均粒徑的影響Fig.3 Effects of different treatments on the mean particle size of MP

2.3 不同處理對(duì)MP溶解度的影響

如圖4所示，Control組MP的溶解度為47.53%，Ox組氧化12 h的MP溶解度為39.18%，相比Control組蛋白溶解度顯著降低（P＜0.05）。這是由于氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)和巰基暴露，增強(qiáng)了蛋白分子間疏水作用和二硫鍵交聯(lián)，引起蛋白聚集，導(dǎo)致其溶解度降低[33]。安石榴苷的存在不能阻止氧化導(dǎo)致的蛋白溶解度降低；而SPP及P+SPP添加均顯著提高了氧化MP的溶解度，較Ox組分別提高了9.78%和20.42%，這主要是由于SPP具有解離肌動(dòng)球蛋白、提高離子強(qiáng)度等作用[27]。

圖4 不同處理對(duì)MP溶解度的影響Fig.4 Effects of different treatments on the solubility of MP

2.4 不同處理對(duì)MP流變學(xué)性能的影響

如圖5所示，Control組MP在約52 ℃出現(xiàn)峰值，主要是由于肌球蛋白頭部S1的變性和聚集引起[29]。Ox組MP峰值略有上升，且加熱至80 ℃G’明顯升高，說(shuō)明加熱前氧化誘導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)促使加熱過(guò)程中肌球蛋白頭部-頭部和尾部-尾部之間的相互作用增強(qiáng)[34]。安石榴苷添加對(duì)氧化MP的G’曲線基本沒(méi)有影響，而SPP添加顯著改變了加熱過(guò)程中MP的G’，表現(xiàn)為熱轉(zhuǎn)變峰徹底消失，整個(gè)加熱過(guò)程中G’明顯降低，這可能與SPP誘導(dǎo)的肌動(dòng)球蛋白解離及MP氧化穩(wěn)定性變化有關(guān)[8]。安石榴苷與SPP復(fù)配對(duì)氧化條件MPG’的影響與SPP單獨(dú)添加幾乎一致。Cao Yungang等[12]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸添加對(duì)氧化條件下MP流變特性的影響與其濃度密切相關(guān)，低濃度下綠原酸促進(jìn)了G’的上升，而高濃度則會(huì)嚴(yán)重破壞MP的凝膠性能。賈娜等[35]研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸引起MPG’降低，認(rèn)為這是由于多酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白形成巰-醌結(jié)合物，封鎖了巰基進(jìn)而抑制蛋白分子間二硫鍵的生成。Cao Yungang等[12]發(fā)現(xiàn)SPP添加會(huì)顯著改變MP的流變曲線（熱轉(zhuǎn)變峰消失）但會(huì)促進(jìn)75 ℃時(shí)G’的升高。綜上所述，植物多酚及多聚磷酸鹽對(duì)氧化條件下MP流變行為的影響可能與多重因素有關(guān)。

圖5 不同處理對(duì)MP G’的影響Fig.5 Effects of different treatments on the rheological properties (G’) of MP

2.5 不同處理對(duì)MP熱誘導(dǎo)凝膠性能的影響

如表2所示，Control組MP的蒸煮損失為12.35%，而氧化12 h后MP的蒸煮損失升高至19.90%?？寡趸瘎┨砑语@著抑制了氧化誘導(dǎo)的凝膠蒸煮損失增大，與Ox組相比，安石榴苷、SPP及其組合處理組的蒸煮損失率分別下降了28.99%、42.56%及54.37%。這可能是由于：一方面，安石榴苷在一定程度上抑制了蛋白氧化，且自身含有多羥基結(jié)構(gòu)，具有很好的親水能力[26]；另一方面，SPP不僅可以抑制氧化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈修飾，而且可以引起肌動(dòng)球蛋白解離、提高體系內(nèi)離子強(qiáng)度，并通過(guò)影響分子的靜電荷效應(yīng)，增強(qiáng)水合作用，使蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，提高M(jìn)P的持水性，從而降低蒸煮損失。類(lèi)似地，葉浪等[36]發(fā)現(xiàn)STPP能明顯降低豬MP熱誘導(dǎo)成膠時(shí)的蒸煮損失率；Cao Yungang等[12]研究發(fā)現(xiàn)在氧化條件下SPP添加降低了MP熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失、提高了其凝膠強(qiáng)度。相比Control組，氧化導(dǎo)致MP凝膠白度下降1.96%。SPP的添加對(duì)氧化后MP的凝膠白度無(wú)顯著改善。添加安石榴苷組使氧化后MP的凝膠白度顯著降低（P＜0.05），這可能是由安石榴苷本身具有的顏色（黃色）所致。

如表2所示，與Control組相比，氧化后蛋白的質(zhì)構(gòu)性能變差，表現(xiàn)為硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性、黏性均降低，其中硬度降低了18.06%。這可能是由于氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白表面疏水性增強(qiáng)、溶解度降低，使參與成膠的蛋白含量減少[37]，從而導(dǎo)致MP的凝膠強(qiáng)度降低。安石榴苷添加明顯改善了氧化誘導(dǎo)的蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)性能的劣變，其MP凝膠的內(nèi)聚性、彈性和咀嚼性恢復(fù)至Control組的水平，與Ox組相比，凝膠硬度和黏性分別提高了7.92%和13.92%。而SPP的添加顯著降低了凝膠的硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性和黏聚性。與本研究結(jié)果類(lèi)似，張典等[38]研究發(fā)現(xiàn)SPP和STPP處理降低了肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的強(qiáng)度。與之相反，其他研究發(fā)現(xiàn)焦磷酸鹽添加提高了肉蛋白的凝膠強(qiáng)度[8,10]?？梢?jiàn)多聚磷酸鹽對(duì)肉蛋白凝膠性能的影響復(fù)雜，受肌肉類(lèi)型、磷酸鹽種類(lèi)及濃度、體系離子強(qiáng)度及pH值等多種因素的影響。

表2 不同處理對(duì)MP凝膠性能的影響Table 2 Effects of different treatments on the heat-induced gel properties of MP

2.6 不同處理對(duì)MP熱誘導(dǎo)凝膠微觀結(jié)構(gòu)特征的影響

如圖5所示，Control組蛋白凝膠呈連續(xù)致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且形狀較規(guī)則、分布較均勻。氧化后的MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)粗糙疏松、不規(guī)則，這是由于氧化導(dǎo)致加熱前MP蛋白間交聯(lián)聚集、分子粒徑增大、溶解度降低，致使熱誘導(dǎo)成膠過(guò)程中蛋白展開(kāi)速率低于交聯(lián)速率，參與蛋白交聯(lián)的活性基團(tuán)不能有序結(jié)合。安石榴苷添加能夠在一定程度上改善氧化誘導(dǎo)造成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)。添加SPP可以使蛋白凝膠結(jié)構(gòu)較為均勻、光滑，可能是由于SPP降低了MP平均粒徑、提高了蛋白溶解度。安石榴苷與SPP復(fù)合組凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更加細(xì)膩，這可能與二者復(fù)配在抑制蛋白氧化方面具有協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。

圖6 不同處理對(duì)MP熱誘導(dǎo)凝膠微觀結(jié)構(gòu)特征的影響Fig.6 Effects of different treatments on the microstructure characteristics of heat-induced MP gels

3 結(jié) 論

安石榴苷、SPP及其組合P+SPP均可以有效抑制羥自由基誘導(dǎo)的蛋白羰基生成和自由氨基含量降低，且安石榴苷與SPP組合效果最好。但這些抗氧化劑添加均無(wú)法抑制氧化誘導(dǎo)的巰基含量降低及蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，相反在一定程度上促進(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)。添加安石榴苷在一定程度上改善了氧化誘導(dǎo)的凝膠質(zhì)構(gòu)劣變和蒸煮損失增大。SPP處理降低了蛋白粒徑、提高了其溶解度，顯著改善了凝膠的蒸煮損失，但降低了凝膠的硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性和黏聚性。因此，安石榴苷和SPP可以在一定程度上抑制蛋白氧化，且對(duì)于MP的凝膠性能和持水性能具有顯著調(diào)節(jié)作用。植物提取物與多聚磷酸鹽復(fù)配在肉制品品質(zhì)改善中具有很好的應(yīng)用前景，但其在實(shí)際肉制品體系中的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。