秦雅莉，趙笑潁，沈圓圓，于福田，劉小玲,2,*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西水牛乳工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004）

酸筍是廣西及周邊地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，歷史悠久，因其特殊氣味和風(fēng)味深受本地人喜愛。酸筍是經(jīng)過浸泡于山泉水或低鹽水，通過自然發(fā)酵后具有酸味的特色發(fā)酵食品。竹筍富含大量營養(yǎng)物質(zhì)如游離氨基酸、蛋白質(zhì)、糖[1]，是微生物生長的理想培養(yǎng)基。在以自然發(fā)酵為主的生產(chǎn)方式中，發(fā)酵酸筍品質(zhì)變化的主要因素是微生物作用。乳酸菌作為自然發(fā)酵過程中主要的發(fā)酵微生物，其在發(fā)酵過程中的生長代謝不僅豐富了營養(yǎng)物質(zhì)[2]，還參與特殊風(fēng)味的形成[3]、抑制雜菌生長[4]，且改善人體腸道不適及增強(qiáng)結(jié)腸功能與穩(wěn)定性，是篩選益生菌的來源之一[5]。

目前，針對酸筍的研究主要集中在營養(yǎng)成分與風(fēng)味及加工工藝方面[1-3]，對其乳酸菌資源研究較少。有研究報(bào)道，酸筍發(fā)酵液中具有豐富的乳酸菌資源，優(yōu)勢菌群主要集中于乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬[6]，但國內(nèi)外研究功能性乳酸菌主要來源于發(fā)酵乳制品、蔬菜制品、肉制品[7-9]，而酸筍作為一種以乳酸菌發(fā)酵為主的發(fā)酵蔬菜制品鮮有報(bào)道，特別是有關(guān)酸筍中具有良好抗炎活性的乳酸菌。乳酸菌是健康人群腸道微生物中的重要菌群，具有維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定[10]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[11]、修復(fù)受損屏障[12]、抑制致病菌過度繁殖以及預(yù)防治療炎癥等功效[12]；李少慧[7]從新疆奶酒與青海發(fā)酵酸奶中分離篩選得到乳酸桿菌M5-L與Q8-L，Zhou Xianrong等[14]從泡菜中篩選得到發(fā)酵乳桿菌CQPC04，Jin Junhua等[9]從發(fā)酵肉制品中得到植物乳桿菌Zhang-LL；以上研究均證實(shí)乳酸菌對腸道炎癥具有調(diào)節(jié)作用。

柳州螺螄粉風(fēng)靡全國，酸筍作為其必不可少的配料之一，加速對酸筍資源深入研究和開發(fā)利用具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并有助于開發(fā)乳酸菌資源應(yīng)用于本地特色功能性食品。因此本研究以廣西柳州酸筍發(fā)酵液為原料，采用傳統(tǒng)方法對乳酸菌進(jìn)行分離純化，對乳酸菌的基本益生特性進(jìn)行篩選和鑒定，最后初步評價(jià)該菌株的抗炎活性，以期進(jìn)一步開發(fā)柳州本地酸筍中乳酸菌資源，為酸筍源乳酸菌應(yīng)用于功能性食品的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸筍發(fā)酵液采集于柳州阿亮酸筍、之味螺食品科技公司以及柳州石山腳農(nóng)業(yè)科技有限公司；對照菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG由皇氏乳業(yè)集團(tuán)提供；人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞株 生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份公司；牛膽鹽 青島海洋化工廠；一氧化氮（NO）測試盒（硝酸還原酶法） 南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6檢測試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；胎牛血清 上海逍鵬生物科技公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基美國Gibco公司；氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鎂、碳酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng) 法國Vilber公司；GI80TW立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器 致微（廈門）儀器有限公司；DZKW-D-1電熱恒溫水浴鍋北京光明醫(yī)療儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀 奧地利TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

將酸筍發(fā)酵液以2%接種量接種于無菌MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置富集培養(yǎng)24 h，取1.0 mL菌液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后選擇合適的2～3個(gè)梯度，并分別取100 μL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落顏色、形狀、光滑程度等特征[15]。挑取不同形態(tài)的單菌落劃線純化3次，對革蘭氏染色為紫色、接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性的單菌落初步判定為乳酸菌，用50%甘油保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 耐酸性實(shí)驗(yàn)

參考張娜[16]的方法，將實(shí)驗(yàn)菌株于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化至3 代，以0.1%接種量接種于10 mL pH 3.0無菌MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以菌株在24 h與0 h的OD600nm之差ΔOD600nm為指標(biāo)，進(jìn)行初步耐酸菌株篩選。

1.3.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

參考劉璐等[17]的方法并加以修改，將實(shí)驗(yàn)菌株于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化至3 代，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，用無菌生理水洗滌菌液，并調(diào)節(jié)菌液濃度為1h109CFU/mL。以2%接種量接種于含0.1%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，分別取0 h和3 h菌液進(jìn)行稀釋涂布測定活菌數(shù)，存活率按式（1）計(jì)算：

1.3.4 模擬人工胃腸液實(shí)驗(yàn)

人工胃液的配制：氯化鉀0.514 395 g、磷酸二氫鉀0.108 872 g、碳酸氫鈉7.644 91 g、氯化鈉2.244 096 g、六水氯化鎂0.067 089 g、二水氯化鈣0.088 212 g、胰蛋白酶（1 500 U/mg）66.67 mg、牛膽酸鈉5.376 9 g、蒸餾水1 L，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，用0.22 μm過濾器除菌備用。

人工腸液的配制：氯化鉀0.506 94 g、磷酸二氫鉀0.122 481 g、碳酸氫鈉2.100 25 g、氯化鈉2.758 368 g、六水氯化鎂0.024 396 g、碳酸銨0.048 045 g、二水氯化鈣0.022 053 g、胃蛋白酶（3 200 U/mg）625 mg、蒸餾水1 L，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用0.22 μm過濾器除菌備用。

參考Brodkorb等[18]方法并加以修改，將實(shí)驗(yàn)菌株于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化至3 代，在4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌菌液，并調(diào)節(jié)菌液濃度為1h109CFU/mL。取1 mL菌液于9 mL人工胃液中，37 ℃、90 r/min培養(yǎng)2 h，利用平板計(jì)數(shù)法分別測定0、2 h活菌數(shù)。按式（2）計(jì)算存活率：

取上述模擬消化后的溶液1 mL于9 mL人工腸液中，37 ℃、90 r/min培養(yǎng)2 h，利用平板計(jì)數(shù)法分別測定0、2 h活菌數(shù)，按式（3）計(jì)算存活率：

1.3.5 黏附實(shí)驗(yàn)

參考Celebioglu等[19]方法并加以修改，采用熒光標(biāo)記法。取50 mL已活化菌液，在4 000hg、4 ℃離心10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，并調(diào)整菌液濃度OD600nm為0.5f0.05。在37 ℃用100 mmol/L 5(6)-羧熒光素二乙酸酯染色30 min，PBS洗滌2次，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，以激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm于酶標(biāo)儀下測定熒光強(qiáng)度。

HT-29細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并稀釋調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5h105cells/mL，均勻接種于24 孔板，每孔500 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合態(tài)，加入500 μL上述已熒光標(biāo)記的菌懸液，同時(shí)用鼠李糖乳桿菌LGG作對照，37 ℃培養(yǎng)1 h后，PBS洗滌3次，加入500 μL含1 g/100 mL SDS的0.1 mol/L NaOH溶液溶解黏附的乳酸菌，以激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm測定熒光強(qiáng)度。細(xì)胞黏附率按式（4）計(jì)算：

1.3.6 細(xì)胞活力檢測

參考Zhao Xiaohong等[20]方法并加以修改。將胰酶消化后的RAW264.7細(xì)胞濃度調(diào)整到5.0h104cell/mL，均勻接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合態(tài)。加入10 μL濃度為1.0h108CFU/mL菌液孵育3 h，同時(shí)用鼠李糖乳桿菌LGG作對照孔，以未加菌液為空白孔，加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h后，測定每孔OD450nm。存活率按式（5）計(jì)算：

1.3.7 NO釋放水平測定

參考Emam等[21]方法并加以修改。將胰酶消化后的RAW264.7細(xì)胞懸液，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)法將濃度調(diào)整為2.5h105cells/mL，均勻接種于24 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合態(tài)。加入1 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激24 h，然后加入50 μL已活化濃度為1h108CFU/mL的菌液培養(yǎng)3 h，收集上清液。根據(jù)NO檢測試劑盒說明書操作，按式（6）計(jì)算NO濃度。同時(shí)用鼠李糖乳桿菌LGG作陽性對照，以未處理正常細(xì)胞作空白。

式中：c為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，20 μmol/L；n為稀釋倍數(shù)（n=4）。

1.3.8 IL-6、IL-1β細(xì)胞因子水平測定

按1.3.7節(jié)方法進(jìn)行處理得到上清液，然后按照試劑盒說明書測定上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β水平。

1.3.9 16 S rRNA基因序列分析

菌株活化至3 代后，于MRS固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR。16S rRNA基因采用反向引物1492R（5’-AGAGTTTGA TTTGATCCTGGCTAG-3’）、正向引物27F（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增，以25 μL反應(yīng)體系，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、64 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后取4 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，測序，測序結(jié)果在NCBI的GenBank序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，在基因庫選取參考菌株進(jìn)行同源性比較，鑒定到種。選取適宜的參考菌株序列，采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酸筍發(fā)酵液中乳酸菌的分離純化

根據(jù)革蘭氏染色為紫色和接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性，從3 份樣品中共篩選得到46 株疑似乳酸菌，均為乳白色單菌落，呈桿狀或短桿狀，并且伴有酸味。乳酸菌SS-31菌落形態(tài)與革蘭氏染色圖如圖1所示。

圖1 乳酸菌SS-31菌落（A）與革蘭氏染色鏡檢形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain SS-31

2.2 酸筍發(fā)酵液中乳酸菌的耐酸能力

表146 株分離菌株在pH 3.0 MRS培養(yǎng)基中24 h的生長情況Table 1 Growth status of isolated strains cultured for 24 hours in MRS medium at pH 3.0

益生菌發(fā)揮益生作用的前提是存活于人體胃腸道中，需具有一定耐酸、堿能力。胃液酸性環(huán)境中胃蛋白酶原被激活，殺死隨食物進(jìn)入胃內(nèi)的微生物[23]。從表1可以看出，菌株SS-4、SS-10、SS-13、SS-14、SS-17、SS-20、SS-21、SS-22、SS-28、SS-30、SS-31、SS-33、SS-37、SS-42、SS-44、SS-45 ΔOD600nm為0.20～0.44，表現(xiàn)出較強(qiáng)耐酸能力。這是由于乳酸菌在生長代謝過程中產(chǎn)生各種有機(jī)酸，使其環(huán)境pH值降低，具有較強(qiáng)耐受能力。竇芳嬌等[24]從福建長桿白菜泡菜中篩選得到的植物乳桿菌RPC21、鼠李糖乳桿菌RCQ4在pH 2.5環(huán)境下培養(yǎng)18 h的ΔOD600nm分別為0.075、0.025，說明本實(shí)驗(yàn)篩選得到的乳酸菌具有較強(qiáng)的耐酸能力，在胃部低pH值環(huán)境下具有一定生存能力。

2.3 酸筍發(fā)酵液中乳酸菌的耐膽鹽能力

人體小腸中的膽鹽濃度一般為0.03%～0.3%。膽鹽耐受能力也是衡量優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)[25]。由表2可以看出，上述篩選得出的耐酸菌株在含0.1%牛膽鹽MRS培養(yǎng)基中的存活率為8.64%～139.77%，所有菌株活菌數(shù)均在106CFU/mL以上，其中存活率達(dá)80%以上的菌株為SS-10、SS-14、SS-17、SS-31、SS-32、SS-37、SS-44、SS-45，表現(xiàn)出較高的膽鹽耐受性。據(jù)報(bào)道植物乳桿菌200655和KCTC 3108也具有較高的膽鹽耐受水平，在0.3%牛膽鹽MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的存活率分別為102.48%和100.76%[26]。有研究表明，膽鹽通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞膜中的多種脂質(zhì)對菌株的膽鹽耐受能力具有影響[27]。

表2 乳酸菌的耐膽鹽能力Table 2 Bile salt tolerance of the tested strains

2.4 酸筍發(fā)酵液中乳酸菌的耐胃腸道消化能力

胃腸道消化環(huán)境復(fù)雜，含胃蛋白酶、胰蛋白酶等，能夠分解菌體蛋白質(zhì)，抑制甚至殺死外來微生物。對耐酸、耐膽鹽能力較強(qiáng)的8 株乳酸菌通過連續(xù)培養(yǎng)方式進(jìn)行模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)。由表3可以看出，經(jīng)過2 h人工胃液消化后，所有菌株活菌數(shù)均呈下降趨勢，但活菌數(shù)均保持在107CFU/mL以上，存活率在65%以上，其中SS-32、SS-37、SS-45菌株存活率超過85%，SS-37存活率高達(dá)90.59%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受能力。

表3 乳酸菌在人工胃液中的耐受性Table 3 Tolerance of LAB in artificial gastric juice

相比于人工胃液消化，人工腸液消化影響更為顯著（表4），經(jīng)過2 h腸液處理后，所有菌株活菌數(shù)均較大程度降低，存活率為0.56%～36.67%。SS-17菌株表現(xiàn)出較高的腸道消化耐受能力，而SS-14、SS-37、SS-44存活率均不超過1%。綜合分析，篩選得到SS-10、SS-17、SS-31、SS-32、SS-45 5 株菌進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表4 乳酸菌在人工腸液中的耐受性Table 4 Tolerance of LAB in artificial intestinal fluid

不同來源及種類的乳酸菌對胃酸和膽鹽的耐受能力不同。杜蘭蘭等[28]發(fā)現(xiàn)類植物乳桿菌L-ZS9經(jīng)模擬胃腸道消化后，活菌數(shù)由109CFU/mL降低至107CFU/mL，而本實(shí)驗(yàn)研究中SS-17活菌數(shù)由108CFU/mL降低至106CFU/mL。有研究通過細(xì)菌微膠囊化保證通過胃腸道過程中的菌體完整性，從而保持其益生活性，充分發(fā)揮益生特性[29]。

2.5 乳酸菌的黏附能力分析

益生菌通過黏附腸道細(xì)胞定植，競爭性地抑制致病菌與腸壁黏附，從而調(diào)節(jié)腸道菌群和發(fā)揮益生特性[19,30]。由圖2可知，不同菌株對HT-29細(xì)胞的黏附率在2.21%～4.95%之間，其中SS-45黏附率（4.69%）最高，與鼠李糖乳桿菌LGG（4.95%）無顯著差異（P＞0.05），其次是SS-31（4.47%）。據(jù)報(bào)道，短乳桿菌KU15153、植物乳桿菌Ln1、短乳桿菌B13-2對HT-29細(xì)胞黏附率分別為5.62%、2.69%、6.11%[31-33]。因此選擇SS-17、SS-31、SS-45進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 乳酸菌對HT-29細(xì)胞的黏附作用Fig.2 Adhesion of LAB to HT-29 cells

2.6 乳酸菌對LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制作用

抑制NO釋放是治療多種炎癥性疾病的重要途徑。由圖3可知，所測菌株在濃度1.0h108CFU/mL時(shí)均對RAW264.7細(xì)胞無毒性作用，且均能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生。陽性對照LGG組NO濃度為7.35 μmol/L，LPS組NO濃度為41.49 μmol/L，與模型組相比，SS-17、SS-31、SS-45組NO濃度分別為11.50、6.11、13.44 μmol/L，表明這3 株菌株均能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO釋放量。與LGG相比，菌株SS-31治療效果更顯著（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道，從新疆奶酒與青海發(fā)酵酸奶中分離篩選得到的乳酸桿菌M5-L與Q8-L對LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞具有抗炎效果；M5-L與Q8-L活菌體及滅活菌體作用均能顯著降低NO分泌水平，其原因可能是活菌體與滅活菌體與LPS結(jié)合，導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）不能被激活[34]。LPS是革蘭氏陰性菌的主要致病成分。當(dāng)機(jī)體受到多種細(xì)胞因子或LPS等刺激時(shí)，核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）活化，NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）激酶被激活，IκBα/β磷酸化，磷酸化IκB進(jìn)一步被泛素化，然后被蛋白酶降解，使NF-κB從NF-κB-IκBs復(fù)合物中解離并轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯，釋放促炎因子及次級(jí)炎癥介質(zhì)，從而導(dǎo)致炎癥惡性循環(huán)，加重炎癥反應(yīng)[35]。

圖3 乳酸菌對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性（A）及其對LPS誘導(dǎo)釋放NO的影響（B）Fig.3 Effect of LAB on the survival rate (A) and NO secretion level (B) of LPS-treated RAW264.7 cells

2.7 SS-31對LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的抑制作用

為進(jìn)一步研究菌株SS-31對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞免疫應(yīng)答的干預(yù)作用，本實(shí)驗(yàn)檢測LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞上清液中炎癥因子水平。

如圖4所示，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌大量促炎因子IL-1β和IL-6，乳酸菌SS-31能夠顯著抑制IL-1β、IL-6分泌（P＜0.05），抑制率分別為49.21%、14.12%，且SS-31對IL-1β的抑制效果優(yōu)于對照組LGG（20.40%），但對IL-6的抑制效果與LGG（13.79%）無顯著差異。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵乳桿菌CQPC04能有效緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥狀，抑制促炎因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12的釋放，增加血清中抗炎因子IL-10的釋放[14]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

圖4 乳酸菌SS-31對RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用Fig.4 Regulation of strain SS-31 on the secretion of inflammatory factors in RAW264.7 cells

2.8 SS-31的16S rRNA基因序列分析

如圖5所示，SS-31與Lactobacillus fermentum親緣性最高，同源性在99%以上，且序列相似性達(dá)100%。同時(shí)菌株SS-17、SS-45經(jīng)鑒定也均為L.fermentum，相似性均達(dá)100%。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain SS-31 based on 16S rRNA gene sequence

宿主免疫系統(tǒng)第一道防線的中心為巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，乳酸菌可刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。李川[11]建立2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型發(fā)現(xiàn)，從泡菜中篩選得到的植物乳桿菌NCU116通過調(diào)整腸道菌群平衡，預(yù)防氧化應(yīng)激對腸道損傷，調(diào)節(jié)IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ的釋放緩解炎癥作用。Zhou Xianrong等[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌CQPC04下調(diào)促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和iNOS的表達(dá)，上調(diào)促炎因子IL-10，通過抑制NF-κB信號(hào)通路從而緩解炎癥。Jin Junhua等[9]發(fā)現(xiàn)活和熱滅活植物乳桿菌Zhang-LL通過保護(hù)腸道屏障通透性，維持腸道菌群穩(wěn)定性減輕大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。此外，雙歧桿菌BCM、嗜酸乳桿菌LCM[36]也均具有抗炎活性。由于不同地區(qū)、來源的乳酸菌所處環(huán)境不同，且同屬不同種菌株間也存在特異性，所發(fā)揮益生特性也不盡相同，因此從酸筍發(fā)酵液篩選得到的發(fā)酵乳桿菌SS-31的具體抗炎機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

3 結(jié) 論

發(fā)酵食品中乳酸菌資源豐富，安全性高，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，但酸筍發(fā)酵液中的乳酸菌資源報(bào)道較少。本研究結(jié)合傳統(tǒng)乳酸菌分離鑒定方法，從柳州采集的3 份酸筍發(fā)酵液中共篩選得到46 株革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性的疑似乳酸菌。耐酸、耐膽鹽、耐胃腸道以及黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株SS-17、SS-31、SS-45在腸道內(nèi)具有較強(qiáng)存活能力，充分保證了乳酸菌在腸道內(nèi)定植并發(fā)揮益生作用。通過LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，3 株菌均不同程度降低細(xì)胞上清液中NO水平，但菌株SS-31效果更為顯著，且與模型組相比，顯著下調(diào)促炎因子IL-6、IL-1β水平，并通過16S rRNA測序鑒定為發(fā)酵乳桿菌。但其免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚未明確，有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酸筍發(fā)酵液可作為篩選具有益生活性乳酸菌的優(yōu)良來源，發(fā)酵乳桿菌SS-31具有作為益生菌的潛力，為后續(xù)開發(fā)具有廣西特色發(fā)酵食品提供了菌株資源和理論基礎(chǔ)。