牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負(fù)荷特征肽段篩選及其含量隨加熱溫度的變化規(guī)律

許博舟，王秀娟,*，胡玲玲，李 潔

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176；2.杭州璞湃科技有限公司，浙江 杭州 310051；3.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122）

牛乳營養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)，易于被人體消化吸收，是理想的天然食品之一。但生鮮乳容易受到病原微生物的污染，也是微生物生長繁殖的絕佳介質(zhì)。因此，生鮮乳需經(jīng)過熱加工處理殺滅微生物，才能確保安全飲用。

市售牛乳按其熱加工處理殺菌工藝可分為兩大類，包括巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳。超高溫滅菌乳經(jīng)過超高溫瞬時(shí)滅菌（135～150 ℃、4～15 s）處理，完全破壞其中可生長的微生物和芽孢，牛乳中無微生物存在，因此可在常溫下保存，且保質(zhì)期比較長，一般可達(dá)3～6個(gè)月。但是高溫會損害牛乳中B族維生素、VC等營養(yǎng)元素，對風(fēng)味和口感也有影響。而對牛乳采用較低溫的巴氏殺菌法進(jìn)行熱處理，溫度一般為72～85 ℃[1]，這一方法可殺死生鮮乳中各種生長型致病菌，僅殘留部分嗜熱菌及其芽孢等，這些多數(shù)是對人體有益的乳酸菌。因此，巴氏殺菌乳既能夠達(dá)到安全飲用標(biāo)準(zhǔn)，又能最大程度地保留生鮮乳的營養(yǎng)和風(fēng)味。但巴氏殺菌乳的貨架期較短，一般為7～12 d，且需要在2～6 ℃的低溫條件下保存，不利于長時(shí)間貯存，且運(yùn)輸、加工和保存成本較高。除此之外，乳品企業(yè)推出的一款介于傳統(tǒng)巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳之間的產(chǎn)品üü延長貨架期（extended shelf life，ESL）牛乳，近些年在市場廣受歡迎，該類產(chǎn)品的標(biāo)簽貨架期在低溫保存條件下為21～24 d[2-3]，遠(yuǎn)長于傳統(tǒng)巴氏殺菌乳10 d左右的貨架期。相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道，該類產(chǎn)品是采用較傳統(tǒng)巴氏殺菌乳更高的殺菌溫度進(jìn)行短時(shí)間殺菌（120 ℃、2～4 s），從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的較長貨架期[3]。而乳品企業(yè)則表示，該類產(chǎn)品是通過改進(jìn)加熱工藝和提高灌裝設(shè)備等級實(shí)現(xiàn)的更高效的殺菌。ESL牛乳因滿足消費(fèi)者對保質(zhì)期和牛乳新鮮度的要求，而在德國、奧地利等歐洲國家和地區(qū)的市場上廣受歡迎[4]，但目前，上述歐洲國家和我國對此類產(chǎn)品的加熱工藝、殺菌溫度等并沒有明確的規(guī)定，也沒有有效的鑒別方法[3]。

研究表明當(dāng)生鮮乳受熱時(shí)，會發(fā)生如磷酸鈣的沉淀、美拉德反應(yīng)和酪蛋白顆粒化等一系列變化，影響口感并導(dǎo)致營養(yǎng)損失。通常情況下，一些在未經(jīng)熱處理的牛乳中不存在的，或僅痕量存在的物質(zhì)，因其較好的穩(wěn)定性，便于含量測定，通常被用來表示高溫?zé)崽幚磉^程的熱損傷程度[5]。例如糠氨酸、乳果糖、賴丙氨酸、5-羥甲基糠醛等常被用作判斷食品受熱程度的指標(biāo)，在谷物、蛋類、肉制品、乳制品中均有應(yīng)用[6-8]，但此類物質(zhì)無法指示較低溫度或較低溫度變化下牛乳的熱處理強(qiáng)度[9-10]。乳清蛋白是生鮮乳中對熱最為敏感的蛋白質(zhì)，是指溶解分散在乳清中的蛋白質(zhì)，其在相對較低的溫度下，也易發(fā)生變性[11-12]，在生鮮乳熱加工過程中，當(dāng)溫度超過了其耐受溫度，其結(jié)構(gòu)、生物活性和溶解度都會發(fā)生變化[12-14]，即蛋白質(zhì)熱變性。研究表明，當(dāng)牛乳的加工條件為77.5 ℃加熱60 min或90 ℃加熱5 min時(shí)，其中的乳清蛋白會徹底變性[15]。Boitz等[16]研究發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌乳中乳清蛋白變性率約10%～20%，超高溫滅菌乳乳清蛋白變性率則高達(dá)40%～60%。由于熱加工的溫度和時(shí)間是影響乳清蛋白變性的重要因素，且乳清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與熱處理的強(qiáng)度呈反比[15]，本研究選用熱不穩(wěn)定的物質(zhì)üü乳清蛋白，作為牛乳熱處理過程標(biāo)志物，根據(jù)乳清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)評估生鮮乳中蛋白質(zhì)變性程度，從而判定牛乳熱處理工藝。

α-乳白蛋白（25%）和β-乳球蛋白（55%）在牛乳清蛋白中占比約80%，其在牛乳中總蛋白質(zhì)占比超過20%[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，由于Ca2+的存在，當(dāng)加熱溫度到達(dá)60 ℃或者pH值高于8.6時(shí)，β-乳球蛋白開始發(fā)生變性[18-19]，當(dāng)加熱溫度到達(dá)66 ℃，α-乳白蛋白開始發(fā)生變性[20]。在120 ℃加熱80 s、130 ℃加熱40 s、140 ℃加熱30 s條件下，β-乳球蛋白會徹底變性[21]。國際乳品聯(lián)合會（International Dairy Federation，IDF）評估不同加熱條件下液態(tài)乳中β-乳球蛋白的最低含量，在巴氏殺菌乳、高溫巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中分別為2 600、2 000 mg/L和50 mg/L[22]。目前的研究可通過乳清蛋白質(zhì)含量確定牛乳中蛋白質(zhì)變性溫度，但無法表示隨熱處理溫度的變化牛乳的熱損傷程度。因此，本研究以牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為目標(biāo)物，篩選出其經(jīng)熱處理后的蛋白質(zhì)熱負(fù)荷特征肽段，通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）進(jìn)行測定，依據(jù)篩選出的熱負(fù)荷特征肽段含量判斷牛乳的熱損傷程度，并通過熱負(fù)荷特征肽段含量指示牛乳熱處理溫度，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）模型，區(qū)分不同加熱溫度的牛乳，從而實(shí)現(xiàn)不同熱處理方式牛乳的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT，純度≥99.0%）、碘乙酰胺（iodocaetamide，IAA，純度≥99.0%）美國Sigma公司；胰蛋白酶（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥50.0%）美國Promega公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）美國賽爾科技公司；碳酸氫銨為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）、Proteome Discoverer 2.2數(shù)據(jù)處理軟件） 美國Thermo Fisher公司；ACQUITY UPLC Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；實(shí)驗(yàn)型殺菌機(jī) 中國上海輝展實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫混勻儀 中國杭州奧盛儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10純水系統(tǒng) 德國Merck Millipore公司；Vortex Genie 2渦旋振蕩器 美國Vortex公司；KQ-500DE超聲波清洗器 中國昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

在牧場分20 批次采集生鮮乳樣品，為避免個(gè)體樣品差異，將采集的全部樣品充分混勻，取10 L備用。采集市售牛乳樣品16 例，包括巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳和ESL牛乳，記錄其品牌、包裝、殺菌工藝、貨架期、建議保存溫度等信息。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，為獲得經(jīng)高溫?zé)崽幚砗蟮摩?乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負(fù)荷特征肽段，將乳清蛋白粉充分熱處理至120 ℃，持續(xù)2 min，至α-乳白蛋白和β-乳球蛋白徹底變性，獲得嚴(yán)重糖基化的乳清蛋白粉，備用。

1.3.3 熱處理

將10 L生鮮乳樣品冷卻至4 ℃后，注入實(shí)驗(yàn)型殺菌機(jī)，緩慢加熱至50 ℃，以每10 ℃為1 級變化梯度，從50 ℃加熱到150 ℃，每級變化梯度保持加熱時(shí)間5 s。當(dāng)達(dá)到加熱溫度和時(shí)間，依次接出已加熱的牛乳樣品，待樣品冷卻至室溫后密封貯存于-80 ℃。11 級不同加熱溫度梯度（50～150 ℃）的樣品依次制備完成，備用。

1.3.4 多肽的測定

1.3.4.1 前處理

取1 g待測樣品，用水稀釋至10 mL，渦旋混勻，超聲10 min，取200 μL稀釋液至2 mL塑料離心管中，加入200 μL 500 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解，渦旋混勻，加入10 μL 500 mmol/L DTT溶液，至于50 ℃溫箱中30 min，取出放至室溫，加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液，避光靜置30 min，加入1 mg/mL 20 μL胰蛋白酶，至于恒溫混勻儀中37 ℃酶解過夜，取出放至室溫，加入10 μL純甲酸終止酶解反應(yīng)，避光靜置15 min，用水定容至1 mL，過0.22 μm水相濾膜，待測。

1.3.4.2 儀器條件

參照文獻(xiàn)[11,23]前處理及其UPLC-MS/MS方法。Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液和B為0.1%甲酸-乙腈溶液；進(jìn)樣量1 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

依據(jù)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白經(jīng)胰蛋白酶的酶解方式，在嚴(yán)重糖基化的乳清蛋白粉中，篩選出的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負(fù)荷特征肽段，編號1#～6#，通過UPLC-MS/MS在ESI+模式下采用電噴霧電離多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行含量測定，質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白熱負(fù)荷特征肽段質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric conditions for analysis of signature peptides from α-lactalbumin and β-lactoglobulin

1.4 數(shù)據(jù)處理

為考察熱處理溫度對熱負(fù)荷特征肽段（肽段1#～6#）含量的影響，每批樣品進(jìn)行2個(gè)水平的平行實(shí)驗(yàn)，通過對比不同加熱溫度條件下熱負(fù)荷特征肽段定量離子峰強(qiáng)度，采用Minitab 17.0數(shù)據(jù)分析軟件，單因素方差分析研究加熱溫度對樣品中熱負(fù)荷特征肽段離子峰強(qiáng)度值的影響，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。

SIMCA-P 14.1（瑞典Umetrics公司）軟件用于建立PCA模型，采用交叉驗(yàn)證方差分析對模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，Q2及R2的值越接近于1，模型的鑒別效果越可靠且優(yōu)異，其中Q2＞0.5時(shí)，模型即被認(rèn)可具有良好預(yù)測能力，可通過以上分析和模型，鑒別市售巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理前α-乳白蛋白和β-乳球蛋白特征肽段選擇

選擇熱處理前的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白特征肽段是準(zhǔn)確測定目標(biāo)蛋白質(zhì)含量的關(guān)鍵。本研究通過在線計(jì)算預(yù)測工具PetptideMass（https://web.expasy.org/peptide_mass/），在UniProt數(shù)據(jù)庫中搜索α-乳白蛋白和β-乳球蛋白氨基酸序列，以及理論上被胰蛋白酶切割得到的特征肽段。采用堿性胰蛋白酶作為酶切工具，利用其特異性，水解精氨酸（R）與賴氨酸（K）羧基端的肽鍵，將乳清蛋白粉中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白酶切形成肽段[24]。根據(jù)其酶解方式，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在R、K位點(diǎn)酶切，見圖1，分別獲得9 條和13 條長短不一的多肽。由于氨基酸數(shù)少于6個(gè)的肽段特異性不強(qiáng)，氨基酸數(shù)大于12個(gè)的肽段色譜分辨率較低[25]，考慮到測定的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，故選擇6～12個(gè)氨基酸的多肽作為目標(biāo)肽段進(jìn)行分析。通過對多肽的離子豐度評估，經(jīng)篩選，α-乳白蛋白的2 條肽段LDQWLCEK、VGINYWLAHK，β-乳球蛋白的4 條肽段IPAVFK、TPEDDEALEK、VLVLDTDYK、IDALNENK符合檢測要求，可作為α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特征肽段。

圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白A/B氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequences of α-lactalbumin and β-lactoglobulin A/B

2.2 熱處理后α-乳白蛋白和β-乳球蛋白熱負(fù)荷特征肽段確定

為獲得牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負(fù)荷特征肽段，本研究制備了嚴(yán)重糖基化的乳清蛋白粉，經(jīng)胰蛋白酶酶切獲得的肽段，與未經(jīng)熱處理的乳清蛋白粉酶切獲得的IPAVFK、TPEDDEALEK等特征肽段對比，通過Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀采集信息，將結(jié)果導(dǎo)入至Proteome Discoverer 2.2軟件中，獲得如TKIPAVFK、LDQWLCEKL等10 條熱負(fù)荷特征肽段。由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白熱變性的本質(zhì)是蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊化，三級結(jié)構(gòu)被破壞，分子內(nèi)部的二硫鍵被暴露出來，形成改性單體蛋白。熱處理后，糖基化過程使α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的氨基酸序列中R或K位點(diǎn)處修飾單糖，導(dǎo)致胰蛋白酶無法在已修飾單糖的R、K位點(diǎn)酶切。因此，生鮮乳經(jīng)熱處理后，再經(jīng)胰蛋白酶酶切獲得的肽段發(fā)生變化，10 條特征肽段熱處理前后對比表詳見表3。通過UPLC-MS/MS對10 條熱負(fù)荷特征肽段逐一掃描，對比離子保留時(shí)間、峰面積、峰形、離子比率等條件，考慮測定的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，本研究篩選出6 條符合要求的熱負(fù)荷特征肽段，并采集其離子信息，定量離子色譜圖見圖2，對6 條熱負(fù)荷特征肽段進(jìn)行編號，即肽段1#～6#，見表2。熱處理程度越強(qiáng)，熱負(fù)荷特征肽段含量越高，相應(yīng)的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中熱處理前特征肽段含量越低。

圖2 肽段1#～6#定量離子MRM譜圖Fig.2 Quantitative ion MRM chromatograms of peptides 1#–6#

表3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白特征肽段熱處理前后對比Table 3 Signature peptides from α-lactalbumin and β-lactoglobulin before and after thermal treatments

2.3 熱負(fù)荷特征肽段含量隨熱處理溫度的變化規(guī)律

為考察牛乳熱處理過程中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負(fù)荷特征肽段含量與加熱溫度的關(guān)系，將制備完成的11 級不同加熱溫度梯度（50～150 ℃）的牛乳樣品進(jìn)行熱負(fù)荷特征肽段的定量離子峰強(qiáng)度分析。熱負(fù)荷特征肽段離子峰強(qiáng)度值表示熱負(fù)荷特征肽段在樣品中的含量，熱負(fù)荷特征肽段含量與蛋白變性程度有關(guān)。肽段1#、2#、4#～6#在100 ℃以下加熱的牛乳樣品中離子峰強(qiáng)度較低，當(dāng)加熱溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，離子峰強(qiáng)度顯著提高，見圖3，與加熱溫度100 ℃以下的樣品具有明顯差異（P＜0.05）。相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道α-乳白蛋白和β-乳球蛋白其變性溫度為96 ℃[26]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，說明蛋白質(zhì)變性程度和本研究篩選出的熱負(fù)荷特征肽段含量存在相關(guān)性。

牛乳樣品在熱處理溫度低于100 ℃時(shí)，肽段2#、5#（β-乳球蛋白熱負(fù)荷特征肽段）的離子峰強(qiáng)度值均低于15 000，熱處理溫度在100～130 ℃時(shí)，肽段2#、5#的離子峰強(qiáng)度值明顯升高，當(dāng)熱處理溫度高于130 ℃，肽段2#、5#的離子峰強(qiáng)度值不再升高，見圖3。說明隨著熱處理溫度升高和時(shí)間延長，肽段2#、5#的含量增加，130 ℃后，乳清蛋白完全變性，樣品中熱負(fù)荷特征肽段含量不再變化。有研究對牛乳的熱處理研究，在60～120 ℃條件下，其變性程度與熱敏指標(biāo)糠氨酸、乳果糖含量均存在很強(qiáng)的相關(guān)性（R2＞0.99）[27-28]。因此β-乳球蛋白的變性程度與溫度有關(guān)，篩選出的肽段2#、5#也可作為熱處理的指示物，其含量隨熱處理溫度升高和時(shí)間延長而增加。

隨著熱處理溫度升高和時(shí)間延長，肽段3#（α-乳白蛋白熱負(fù)荷特征肽段）的離子峰強(qiáng)度值增加，在熱處理溫度為60～80 ℃時(shí)，離子峰強(qiáng)度值明顯增加，如圖3所示。參考相關(guān)研究[20,28]，α-乳白蛋白的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度為66 ℃，即在66 ℃時(shí)有部分發(fā)生變性。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一致，說明α-乳白蛋白的熱負(fù)荷特征肽段3#也可作為牛乳熱處理過程的指示物。當(dāng)牛乳熱處理溫度超過80 ℃時(shí)，肽段3#離子峰強(qiáng)度值明顯高于低溫加熱牛乳。采用巴氏殺菌法加工而成的牛乳，特點(diǎn)是采用72～85 ℃左右的低溫殺菌[1]，因此，牛乳中熱負(fù)荷特征肽段3#的含量高低可用于鑒別巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳。

圖3 熱處理溫度對肽段1#～6#離子峰強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of heating temperature on the ion peak intensity of peptides 1#–6#

2.4 PCA模型建立

采集市售牛乳樣品16 例，包括8 例巴氏殺菌乳（1～8號）和8 例超高溫滅菌乳（9～16號），采用已建立的UPLC-MS/MS方法對樣品中的肽段1#～6#進(jìn)行含量測定，每例樣品2 組平行實(shí)驗(yàn)，采集獲得定量離子峰強(qiáng)度信息。將數(shù)據(jù)預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA-P 14.1中，進(jìn)行PCA模型擬合，以熱負(fù)荷特征肽段離子峰強(qiáng)度值和熱處理方式作為響應(yīng)變量，采用交叉驗(yàn)證方差分析對模型進(jìn)行驗(yàn)證，理論上，Q2和R2越接近1說明模型可靠性越強(qiáng)[29]。由于進(jìn)行巴氏殺菌法的加熱溫度一般為72～85 ℃[1]，超高溫滅菌法的溫度為135～150 ℃，當(dāng)熱加工溫度超過100 ℃時(shí)，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白糖基化程度明顯加劇，導(dǎo)致肽段1#～6#的離子峰強(qiáng)度值存在明顯差異，得到結(jié)果Q2=0.947，R2=0.967，見圖4。因此，該分析模型可靠。

圖4 市售牛乳樣品PCA模型分析Fig.4 PCA plot of commercial milk samples

2.5 巴氏殺菌乳與超高溫滅菌乳的鑒別

不同熱處理的市售牛乳樣品中肽段1#～6#的離子峰強(qiáng)度值均差異極顯著（P＜0.01）。其中，肽段1#、2#、5#、6#（β-乳球蛋白熱負(fù)荷特征肽段）在巴氏殺菌乳中的離子峰強(qiáng)度值分別低于1 100、10 000、7 500、6 400，在超高溫滅菌乳中均超過2 800、30 000、15 000和15 000。肽段3#和肽段4#（α-乳白蛋白熱負(fù)荷特征肽段）在巴氏殺菌乳中的離子峰強(qiáng)度值分別低于450和1 800，在超高溫滅菌乳中均超過2 700和2 800，見圖5。鑒此可采用PCA模型和肽段1#～6#的離子峰強(qiáng)度值，初步實(shí)現(xiàn)巴氏殺菌乳與超高溫滅菌乳的鑒別。

圖5 市售巴氏殺菌乳（A）和超高溫滅菌乳（B）中肽段1#～6#的離子峰強(qiáng)度值比較Fig.5 Comparison of ion peak intensity of peptides 1#–6# incommercial pasteurized milk (A) and UHT milk (B)

除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)，6號和7號樣品中肽段2#和肽段5#（β-乳球蛋白熱負(fù)荷特征肽段）的離子峰強(qiáng)度值高于其他隨機(jī)采集的市售巴氏殺菌乳樣品，但仍與超高溫滅菌乳差異極顯著（P＜0.01），見圖5。此2 例樣品標(biāo)識為巴氏殺菌乳，且要求2～6 ℃低溫保存，貨架期分別為15 d和21 d，明顯高于同類巴氏殺菌乳產(chǎn)品7～15 d的貨架期。依據(jù)本研究結(jié)果，隨著加熱溫度的變化，蛋白質(zhì)糖基化程度逐漸明顯，β-乳球蛋白的熱負(fù)荷特征肽段含量逐漸增加，熱處理前特征肽段含量逐漸減少。該結(jié)果與IDF評估過的不同加熱條件下液態(tài)乳中的β-乳球蛋白的含量關(guān)系基本一致，為巴氏殺菌乳高于高溫巴氏殺菌乳，高于超高溫滅菌乳[22]。前期調(diào)研結(jié)果顯示，部分廠家應(yīng)用創(chuàng)新的熱加工技術(shù)延長牛乳的貨架期，結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，乳品企業(yè)應(yīng)用了高溫巴氏殺菌工藝，雖然延長了產(chǎn)品貨架期，但較普通巴氏殺菌乳，糖基化程度增加，對鮮牛乳的營養(yǎng)和風(fēng)味會造成一定影響。

3 結(jié) 論

熱處理過程會導(dǎo)致牛乳中乳清蛋白糖基化，影響牛乳的風(fēng)味與口感。本研究以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為牛乳熱處理標(biāo)志物，依據(jù)胰蛋白酶酶切規(guī)律，運(yùn)用Proteome Discoverer 2.2軟件，篩選出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中共6 條熱負(fù)荷特征肽段，采用UPLC-MS/MS測定其在不同加熱溫度下的含量變化，結(jié)果表明，熱負(fù)荷特征肽段含量可用來指示熱處理溫度，隨熱處理溫度的升高而增加。通過測定市售牛乳樣品中熱負(fù)荷特征肽段的含量，基于食品組學(xué)技術(shù)，建立的PCA模型實(shí)現(xiàn)了巴氏殺菌乳與超高溫滅菌乳的鑒別。在乳制品生產(chǎn)中，可通過α-乳白蛋白糖和β-乳球蛋白熱負(fù)荷特征肽段的含量，較準(zhǔn)確的控制加熱條件，從而達(dá)到例如降低乳的致敏性、改善酸凝乳的凝膠特性等不同的需求。