基于GC-MS的低鹽蝦醬低溫發(fā)酵過程中代謝組學(xué)分析

李文亞，班雨函，于宏偉，馬愛進(jìn)，桑亞新，孫紀(jì)錄,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

傳統(tǒng)蝦醬是由毛蝦、蜢子蝦等小型蝦或低值蝦添加食鹽發(fā)酵制成的調(diào)味品。傳統(tǒng)蝦醬含鹽量高，約為25%～30%。攝入食鹽過多可能會導(dǎo)致血壓升高等一系列健康問題，所以傳統(tǒng)高鹽蝦醬并不符合現(xiàn)代人群健康的理念。與之相比，低鹽豆醬[1]、低鹽魚醬[2]和低鹽腌魚[3]等低鹽產(chǎn)品更加受到消費者的歡迎。近年來，低鹽蝦醬已在滄州黃驊等一些傳統(tǒng)蝦醬產(chǎn)區(qū)悄然興起。低鹽蝦醬同樣是以低值蝦類經(jīng)過加鹽發(fā)酵而成，但是，其含鹽量顯著降低，約為10%～12%。目前，國內(nèi)已有學(xué)者對低鹽蝦醬的發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，包括添加酶制劑發(fā)酵[4]、低溫發(fā)酵[5]和人工接種發(fā)酵[6]等。由于含鹽量的降低，一些腐敗微生物可能得不到抑制而大量增長，從而對低鹽蝦醬的風(fēng)味、形態(tài)及營養(yǎng)價值產(chǎn)生一定的影響。因此，目前許多低鹽蝦醬生產(chǎn)企業(yè)采用低溫發(fā)酵的方式控制腐敗微生物的生長。

代謝組學(xué)是一種系統(tǒng)確定生物樣品中低分子質(zhì)量代謝物的方法，在發(fā)酵水產(chǎn)品中，已被用于監(jiān)測從原材料到終端產(chǎn)品這一過程中的質(zhì)量、安全性和微生物的變化過程，確保產(chǎn)品的品質(zhì)[7]。發(fā)酵水產(chǎn)品的代謝組學(xué)分析也已用于記錄發(fā)酵過程中的代謝物變化，以期達(dá)到預(yù)測終端產(chǎn)品的感官特性和營養(yǎng)質(zhì)量的目的[8]。目前，代謝組學(xué)的研究手段主要為液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、核磁共振和高效液相色譜等[9]。水產(chǎn)品的發(fā)酵過程可以看作一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，含有多種微生物菌群，對營養(yǎng)成分進(jìn)行水解，從而釋放出大量的代謝物，如氨基酸、有機酸和苷元化合物等。由于代謝組學(xué)能夠同時檢測多種代謝物的變化，因此被廣泛用于發(fā)酵食品的代謝物組變化中，如灰樹花的發(fā)酵[10]、沙棘油[11]、發(fā)酵乳[12]和高度黑糯米酒[13]。在發(fā)酵水產(chǎn)品中，代謝組學(xué)應(yīng)用還不夠廣泛，在低鹽蝦醬中更是研究匱乏。Chen Daian等[14]研究了發(fā)酵過程中蟹醬代謝組學(xué)的演變，發(fā)現(xiàn)蟹醬的質(zhì)量明顯受到發(fā)酵的影響，質(zhì)量變化表現(xiàn)為乳酸、甜菜堿、?；撬帷⑷装?N-氧化物、三角堿、肌苷、二磷酸腺苷、2-吡啶醇的下降，一系列氨基酸的波動，以及蔗糖、甲酸、乙酸鹽、三甲胺、次黃嘌呤的積累。Lee等[15]對在不同環(huán)境中發(fā)酵的高鹽蝦醬進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在高鹽環(huán)境下酶的作用受到抑制，導(dǎo)致在發(fā)酵后期氨基酸和葡萄糖含量仍然沒有顯著性差異，同時推測在蝦醬樣品發(fā)酵過程中，原料蝦體內(nèi)的內(nèi)源性蛋白酶和脂肪酶發(fā)揮著重要作用，尤其是對感官特性有十分重要的影響。

蝦醬發(fā)酵過程中的代謝物直接影響蝦醬的品質(zhì)和風(fēng)味，而低鹽蝦醬作為一種近年出現(xiàn)的新型產(chǎn)品，其代謝物組的研究十分匱乏。因此，本實驗擬使用GC-MS技術(shù)對低溫發(fā)酵的低鹽蝦醬中代謝物組進(jìn)行分析，并通過t檢驗和變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析等多元統(tǒng)計分析方法對差異代謝物進(jìn)行篩選，以期揭示低溫發(fā)酵工藝生產(chǎn)的低鹽蝦醬中代謝物組變化規(guī)律。研究結(jié)果將為低鹽蝦醬的質(zhì)量評估和進(jìn)一步完善低鹽蝦醬生產(chǎn)工藝提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜢子蝦購自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場，產(chǎn)地為黃驊。

氯仿（色譜級） 上海沃凱生物技術(shù)有限公司；超純水、甲醇、乙腈 美國Fisher Chemical公司；吡啶（色譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧胺鹽酸鹽、L-2-氯苯丙氨酸 上海阿達(dá)瑪斯科技有限公司；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷） 美國Regis公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；JXDC-20氮吹儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；8890B-5977B GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；TH2-D恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低鹽蝦醬的制作

挑選新鮮蜢子蝦，清洗、瀝水、稱質(zhì)量，搗碎后添加蜢子蝦質(zhì)量10%的食鹽[6]，分裝于玻璃發(fā)酵容器中，用兩層紗布封口，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫發(fā)酵。一批放于10 ℃恒溫培養(yǎng)，另一批放于20 ℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定時視為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵0 d的低鹽蝦醬被標(biāo)識為S0，10 ℃發(fā)酵的低鹽蝦醬為低溫組（L組），被標(biāo)識為LX；20 ℃發(fā)酵的低鹽蝦醬為對照組（H組），被標(biāo)識為HX；其中X表示蝦醬發(fā)酵周數(shù)。

1.3.2 樣品前處理

精確稱取50 mg樣本到2 mL離心管里，加入0.5 mL甲醇-水溶液（4∶1，V/V，含0.02 mg/mL的內(nèi)標(biāo)L-2-氯-苯丙氨酸）。加入一顆鋼珠，放入-20 ℃研磨機中研磨（50 Hz，3 min）。加入200 μL氯仿，研磨機中研磨（50 Hz，3 min），超聲提取30 min。-20 ℃靜置30 min。4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液裝入玻璃衍生瓶中，氮氣吹干。向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg/mL），渦旋振蕩2 min后，于振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃肟化反應(yīng)90 min。取出后再加入80 μL的N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）衍生試劑，渦旋振蕩2 min后，于70 ℃反應(yīng)60 min。取出樣本，室溫放置30 min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

1.3.3 GC條件

衍生化后樣本用分流模式注入GC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分析，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。樣品經(jīng)DB-5MS毛細(xì)管柱（40 mh0.25 mm，0.25 μm）分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測。進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，隔墊吹掃流速3 mL/min，溶劑延遲5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，平衡0.5 min，然后以8 ℃/min升至310 ℃，并維持6 min。

1.3.4 MS條件

電子電離源；傳輸線溫度310 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500，掃描頻率3.2 scan/s。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進(jìn)行峰提取、對齊等數(shù)據(jù)預(yù)處理操作，最終得到代謝物鑒定結(jié)果及數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)合t檢驗和VIP值篩選出差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽蝦醬中代謝物的多元統(tǒng)計分析

2.1.1 不同溫度發(fā)酵低鹽蝦醬的OPLS-DA

為了分析2種溫度下低鹽蝦醬中的代謝物是否會產(chǎn)生明顯的差異，使用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）法分析2種處理下低鹽蝦醬樣品之間的差異性，從而更好區(qū)分組間差異，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溫度下發(fā)酵低鹽蝦醬的OPLS-DA圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig.1 OPLS-DA (A) and permutation test (B) plots of low-salt shrimp paste fermented at different temperatures

由圖1A所示，2種不同溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬能夠被明顯區(qū)分，證明溫度能夠明顯影響微生物的代謝，使2 組樣品間菌體代謝物種類和含量存在明顯的差異[10]。對于OPLS-DA模型圖，往往需要使用置換檢驗對模型的有效性進(jìn)行驗證，以防發(fā)生過度擬合現(xiàn)象導(dǎo)致模型出現(xiàn)偏差，在圖1B中，和分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2標(biāo)示模型的預(yù)測能力。、和Q2越接近1表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2＞0.5表示模型的預(yù)測能力較好。在本次檢驗結(jié)果中，、和Q2值分別為0.709、0.992和0.989，證明該OPLS-DA模型有效，不存在過擬合現(xiàn)象。因此，對于分析不同溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬之間代謝物的差異性準(zhǔn)確。

2.1.2 不同溫度發(fā)酵低鹽蝦醬代謝物PLS-DA

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，2種溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬代謝物大部分可以明顯分開。由圖2A所示，H組樣品中原料S0中的代謝物能夠明顯與其他5個時間段的樣品區(qū)分開；發(fā)酵4 周和8 周的樣品與其他樣品能夠明顯區(qū)分；在發(fā)酵中后期，第12、16周和第20周的蝦醬樣品并沒有明顯區(qū)分。這可能是因為剛開始發(fā)酵后菌種活力較高，微生物生物量增加導(dǎo)致代謝物變化較大，導(dǎo)致第4周和第8周的樣品能夠明顯區(qū)分，而進(jìn)入發(fā)酵中后期后，代謝物的變化速度降低，使發(fā)酵中后期樣本區(qū)分不明顯。由圖2B所示，原料S0與5個取樣點樣品都能明顯區(qū)分，第4、8周和第12周樣品能夠明顯區(qū)分，這可能是因為在發(fā)酵前期，由于低溫環(huán)境的影響，微生物菌種活力相對較低，但由于前期碳源較為充足，代謝物之間相互作用產(chǎn)生一些酯類和酚類等化合物，使代謝物能夠明顯區(qū)分[13]。在發(fā)酵后期第16周和第20周，由于能源物質(zhì)基本被消耗，微生物發(fā)酵作用受到抑制，造成代謝物變化不明顯，所以不能被很好區(qū)分。

圖2 不同溫度發(fā)酵低鹽蝦醬代謝物的PLS-DA圖Fig.2 Partial least squares discriminant (PLS-DA) plots of metabolites in low-salt shrimp paste fermented at different temperatures

2.1.3 不同發(fā)酵階段低鹽蝦醬代謝物PLS-DA

為更加全面地了解不同溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬代謝物的變化，對同一發(fā)酵階段不同處理的蝦醬中的代謝物進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果如圖3所示。在發(fā)酵第0周時，2種低鹽蝦醬的代謝物并無差異。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，2種低鹽蝦醬中的代謝物都能夠被明顯區(qū)分，這可能是因為發(fā)酵溫度對于微生物活力有很大影響，導(dǎo)致微生物在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生不同的代謝物，從而能夠很好地被區(qū)分開。

圖3 不同發(fā)酵階段的低鹽蝦醬代謝物的PLS-DAFig.3 PLS-DA plots of metabolites in low-salt shrimp paste at different fermentation stages

2.2 低鹽蝦醬中的主要代謝物分析

基于GC-MS的檢測結(jié)果，對不同溫度下發(fā)酵的兩組蝦醬中主要代謝物（組內(nèi)不同發(fā)酵周數(shù)的總量）進(jìn)行分析。2 組低鹽蝦醬中共有44種主要代謝物，包括氨基酸類16種、脂肪酸類6種、胺類2種、有機酸類8種、醇類3種、核苷酸類3種、其他類6種，表1列出部分主要代謝物。

表1 不同溫度下發(fā)酵蝦醬中主要代謝物相對含量Table 1 Relative contents of major metabolites in shrimp paste fermented at different temperatures

氨基酸類物質(zhì)是低鹽蝦醬中含量最豐富的代謝物，在蝦醬發(fā)酵后有助于各種口味的形成，包括鮮味、甜味、苦味、酸味和咸味特征，而且還是低鹽蝦醬中重要的營養(yǎng)和風(fēng)味前體物質(zhì)，為發(fā)酵過程中的微生物生長提供氮源。實驗檢測到的主要氨基酸中，呈現(xiàn)甜味的氨基酸主要為甘氨酸、L-蘇氨酸和L-絲氨酸。呈現(xiàn)苦味的氨基酸為L-苯丙氨酸和L-脯氨酸，呈現(xiàn)鮮味的氨基酸為天冬氨酸、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺。這些氨基酸在低鹽蝦醬發(fā)酵過程中共同作用帶給蝦醬獨特的風(fēng)味[16]。

脂肪酸，尤其是長鏈多不飽和脂肪酸已被視為飲食中必需營養(yǎng)物質(zhì)，對生物的生長、發(fā)育和繁殖至關(guān)重要。蝦醬和其他類型的海洋來源食物是不飽和脂肪酸的良好來源。在2 組低鹽蝦醬中主要檢測到6種脂肪酸，分別為棕櫚酸、油酸、棕櫚油酸、肉豆蔻酸、反-13-十八烯酸和十七烷酸。棕櫚酸和肉豆蔻酸屬于飽和脂肪酸，而油酸屬于n-9不飽和脂肪酸。油酸有降血壓和膽固醇的功效，同時也能降低心血管疾病的發(fā)病率，是人體良好的營養(yǎng)物質(zhì)來源，食用富含油酸的食品有助于改善健康狀況[17]。

有機酸是低鹽蝦醬中重要的組成部分，在原料蝦中（S0）含有較少部分有機酸，在發(fā)酵過程中有機酸的含量有所升高。在低鹽蝦醬L-乳酸相對含量較高。L-乳酸在食品、制藥、化妝品和其他化學(xué)工業(yè)中具有廣泛的用途，其具有爽口的酸味，是發(fā)酵水產(chǎn)品中主要的有機酸類。但有機酸含量過高會導(dǎo)致低鹽蝦醬產(chǎn)品的酸化，對產(chǎn)品的品質(zhì)造成不利影響，所以在發(fā)酵過程中更應(yīng)該控制有機酸的過量產(chǎn)生。

2.3 低鹽蝦醬中的差異代謝物的篩選和分析

對2種溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬中差異代謝物進(jìn)行研究，通過聚類熱圖和VIP條形圖，展示各差異組中代謝物在各樣本中的表達(dá)模式和代謝物在多元統(tǒng)計分析的VIP值，以及單維統(tǒng)計中的P值，從而直觀顯示出差異代謝物的重要性和含量趨勢變化，結(jié)果如圖4所示。圖4A中，顏色表示該代謝物在該組樣本中相對表達(dá)量大小，紅色越深表示該代謝物相對表達(dá)量越大，藍(lán)色越深表示代謝物相對表達(dá)量越小。圖4B中，條形長度表示該代謝物對2 組差異的貢獻(xiàn)值，默認(rèn)不小于1，值越大表示該代謝物在2 組間差異越大。

在本次差異代謝物篩選中，共篩選出40種差異代謝物，篩選出VIP值大于1且P值小于0.05的差異代謝物共30種（圖4），VIP值從大到小排序為乙醇胺（VIP=3.11）、L-絲氨酸（VIP=2.91）、硫氰酸芐酯（VIP=2.86）、甘油酸（VIP=2.76）、2-乙基己酸（VIP=2.73）、乙酸橙花酯（VIP=2.62）、L-蘇氨酸（VIP=2.56）、肌氨酸（VIP=2.53）等。在2種不同溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬中，主要篩選出的差異代謝物為酯類、嘌呤類、酚類、胺類、有機酸類、酮類、醇類、氨基酸等。大多數(shù)被檢測到的差異代謝物早已在發(fā)酵水產(chǎn)品中被鑒定出來，例如魚醬和魚露[18]。具有揮發(fā)性化合物在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出動態(tài)變化，有些增加，而另一些出現(xiàn)下降趨勢，這表示總體風(fēng)味特征在整個發(fā)酵過程中也發(fā)生變化。

圖4 不同溫度下發(fā)酵低鹽蝦醬中差異代謝物的層級聚類分析熱圖Fig.4 Heatmap obtained by hierarchical clustering analysis of differential metabolites in low-salt shrimp paste fermented at different temperatures

酸類物質(zhì)在低鹽蝦醬發(fā)酵過程中不僅有呈味作用，同時也能在發(fā)酵過程中對雜菌起到抑制作用，有的有機酸類還可以通過磷酸化參與糖酵解為細(xì)胞提供能量，蝦醬中的酸類物質(zhì)一部分來源于原料蜢子蝦，另一部分來源于發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生。本研究在差異代謝物檢測中檢測到的酸類物質(zhì)有壬酸、哌啶羧酸、4-羥基苯乙酸和吲哚-3-丙酸。壬酸主要存在于H組蝦醬中，其常作為精油的呈味物質(zhì)，在食用香料方面有很高的利用價值。尿刊酸和甘油酸主要在L組中產(chǎn)生，甘油酸作為一種化學(xué)中間體，在日常生活中有很高的需求量，在食品中主要用于食品添加劑用于改善風(fēng)味[19]，同時能夠進(jìn)一步磷酸化后形成甘油酸3-磷酸，參與糖酵解提供細(xì)胞生長產(chǎn)生所需能量。尿酸在2種處理組蝦醬中均被檢測到，在L組發(fā)酵過程中均存在，但在H組蝦醬樣品只在第4周和第8周被檢測到。尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，同時也是痛風(fēng)的主要原因。在L組含量高的原因可能是在發(fā)酵過程中黃嘌呤和次黃嘌呤含量較高，導(dǎo)致其代謝終產(chǎn)物中尿酸含量也有所增加。在對錦州蝦醬揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)主要酸類差異代謝物為乙酸和丁酸[20]，乙酸的產(chǎn)生起源于乳酸菌的作用，丁酸在蝦制品中提供奶酪香氣，這與本研究結(jié)果不同，可能是因為原料來源和發(fā)酵條件不同導(dǎo)致。

酮類物質(zhì)是通過微生物對脂質(zhì)或氨基酸的酶促反應(yīng)產(chǎn)生，主要為低鹽蝦醬提供甜的花香風(fēng)味，其產(chǎn)生機理是由多不飽和脂肪酸經(jīng)過氧化產(chǎn)生，同時也能通過降解氨基酸產(chǎn)生，對低鹽蝦醬的風(fēng)味有十分重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)其存在于魚露中，有類似干酪的香氣[21]。在低鹽蝦醬發(fā)酵過程中，主要存在于H組蝦醬樣品中的2-哌啶酮作為主要差異酮類代謝物被篩選出來。

糖類物質(zhì)作為主要的碳源，在糖酵解過程中被消耗，通過碳水化合物代謝途徑為微生物的生長提供必需的能量[22]，本次在代謝物差異中所檢測到的糖類物質(zhì)的衍生物分別為1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇和肌醇半乳糖苷。在L組蝦醬中1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇含量較H組更多，在L組發(fā)酵初期（第4周），1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇含量很少，隨著發(fā)酵時間的延長1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇含量增加，在之后整個發(fā)酵過程中都能被檢測到，在H組蝦醬中只在第20周檢測到了1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇。

嘌呤類化合物是細(xì)胞中最為豐富的代謝物，對于提供細(xì)胞能量和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)起十分重要的作用[12]。本次檢測到的嘌呤類差異化合物有黃嘌呤和次黃嘌呤，黃嘌呤是嘌呤降解途徑的產(chǎn)物，并且能夠在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，這是L組中尿酸含量大于H組的原因。次黃嘌呤別名為6-羥基嘌呤，可通過進(jìn)一步分解得到黃嘌呤，黃嘌呤形成后經(jīng)過參與代謝轉(zhuǎn)化得到終產(chǎn)物甘氨酸[23]。

氨基酸不僅是代謝過程中必需的，而且還是有益的前體物質(zhì)。氨基酸主要來自發(fā)酵過程中細(xì)菌中的蛋白酶對原料中蛋白質(zhì)的酶促降解以及酵母和其他微生物的自溶作用。蝦醬中氨基酸含量十分豐富。氨基酸不僅可以為微生物的生長提供氮源，還可以為蝦醬增加鮮味。氨基酸是蝦醬發(fā)酵過程中不可缺少的成分之一，具有多種味感，例如鮮味、甜味、苦味、酸味和咸味。在發(fā)酵過程中，一些氨基酸被酵母用作營養(yǎng)素，一些被轉(zhuǎn)化為高級醇，對于蝦醬的風(fēng)味及感官品質(zhì)的形成具有十分重要的作用。對2 組蝦醬差異代謝物的篩選中，發(fā)現(xiàn)肌氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸、N-甲基丙氨酸和L-谷氨酰胺。其中亮氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸是3種人體必需氨基酸，苯丙氨酸也是鮮味氨基酸的一種。在低鹽蝦醬發(fā)酵過程中，肌氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸只在L組被檢測到，在H組中并沒有表達(dá)量。L-蘇氨酸作為人體生長必需的氨基酸，具有十分重要的作用，如促進(jìn)生長，提高免疫機能等，在L組低鹽蝦醬發(fā)酵前期（第4、8周）含量達(dá)到了最大值，隨著發(fā)酵時間的不斷延長含量逐漸降低，到第20周時，L-蘇氨酸含量幾乎減少為0，但在H組中從始至終未表達(dá)。肌氨酸在人體中的存在形式是磷酸肌酸，可作為能量來源。在L組整個發(fā)酵過程中，肌氨酸一直被檢測到，但在H組中，只在發(fā)酵早期（第4周）檢測到肌氨酸。L-絲氨酸不僅是構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的底物而且是生物體內(nèi)重要的能源構(gòu)成部分[24]。在整個發(fā)酵過程中，L組樣品均檢測到了L-絲氨酸，而H組樣品在整個過程中并未檢測到。N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸和N-甲基丙氨酸在H組發(fā)酵過程中均被檢測到，但在L組樣品中，只在發(fā)酵末期（第20周）有較低的含量。

櫻黃素、褪黑素和辛弗林也被鑒定2 組低鹽蝦醬樣品中差異代謝物。櫻黃素是從幾種植物中提取的異黃酮類中的一種代表性O(shè)-甲基化類黃酮[25]。該化合物已顯示出許多有益的活性，如抗炎、抗肥胖、應(yīng)激反應(yīng)以及調(diào)節(jié)蛋白水解活性[26]。同時也發(fā)現(xiàn)櫻黃素具有抗肥胖的潛力，并參與人類肝臟中醛脫氫酶的抑制[27]。在整個發(fā)酵過程中，櫻黃素只在H組中被檢測到，在L組樣品中并未表達(dá)。褪黑素是一種親脂性和親水性的吲哚類化合物，由于其代謝物具有抗氧化性，故認(rèn)為褪黑素具有級聯(lián)抗氧化效應(yīng)，在人體和動物體內(nèi)具有增強人體免疫力和抗氧化能力[28]。褪黑素在2 組低鹽蝦醬樣品中均被檢測到，在整個發(fā)酵階段中，H組每個階段都檢測到該樣品，而在L組樣品中，褪黑素只在發(fā)酵末期（第20周）被檢測到，且表現(xiàn)出較低的含量。辛弗林屬于生物堿中麻黃堿類的一種，在中藥中常用作減肥促進(jìn)劑，其作用機理是對腎上腺素受體進(jìn)行刺激而產(chǎn)生熱量。在整個發(fā)酵過程中，L組樣品中各個階段均檢測到辛弗林，而在H組中并不是每個階段低鹽中都能檢測到辛弗林，而只在發(fā)酵后期（第16、20周）檢測出較低的含量。

錦州蝦醬樣品中，醛類（46.34%）和酸類（35.99%）是蝦醬樣品中的主要揮發(fā)性成分[20]，但在本研究中，醛類物質(zhì)并不是主要差異代謝物，除此之外還在低鹽蝦醬樣品中發(fā)現(xiàn)了酯類差異代謝物，主要是硫氰酸芐酯和乙酸橙花酯，酯類物質(zhì)也是發(fā)酵產(chǎn)品中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一，H組樣品中，2種酯類化合物含量均高于L組樣品，乙酸橙花酯是一種源于橙花基焦磷酸的單萜類衍生物，廣泛存在于植物精油中[29-30]。乙酸橙花酯是橙花香和玫瑰香氣的來源，已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域[31]。在食品工業(yè)中，乙酸橙花酯已被食品藥品監(jiān)督管理局重新認(rèn)可并批準(zhǔn)為安全的食品調(diào)味劑。乙酸橙花酯具有抗菌性能，可以用作食品防腐的潛在抗菌劑[32]。此外，乙酸橙花酯也被歐洲食品安全局評估為一種安全的調(diào)味食品，可用于所有動物的飼料。在2 組不同溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬中，乙酸橙花酯主要在H組中被檢測到，在L組中未檢測到較高含量。

2.4 低鹽蝦醬中的差異氨基酸分析

如圖5所示，在低鹽蝦醬發(fā)酵過程中，涉及到許多微生物產(chǎn)生各種蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)分解，從而釋放出不同種氨基酸，對提高發(fā)酵食品的感官特性有十分重要的作用。眾所周知，許多氨基酸和小肽可以起到增味劑的作用，使食物中的鮮味、甜味、咸味和濃香味得以體現(xiàn)。大部分氨基酸有D型和L型2種對映體，其中L型氨基酸是構(gòu)成天然蛋白質(zhì)底物和生物體內(nèi)重要的能源供給部分[24]，主要的4種氨基酸類差異代謝物中，L組蝦醬中L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺和肌氨酸含量高于H組蝦醬，這說明L組蝦醬中氨基酸營養(yǎng)成分高于H組。L-絲氨酸和L-蘇氨酸是人體細(xì)胞重要的能源之一，L-絲氨酸是人體非必需氨基酸，僅在膠質(zhì)細(xì)胞（主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞）中通過糖酵解中間體3-磷酸甘油酸的代謝途徑而形成。這種代謝途徑被稱為磷酸化途徑，通過3種酶促反應(yīng)將3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為L-絲氨酸[32]。具有抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[33]。L-蘇氨酸是人體必需氨基酸，主要存在于血紅蛋白，胰島素和乳球蛋白中[34]，在畜牧營養(yǎng)研究中具有增強機體免疫力等作用[35]。L-谷氨酰胺是人體中最豐富的氨基酸之一，是由內(nèi)源性酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行分解而產(chǎn)生的小分子化合物，除了在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用外，L-谷氨酰胺還能參與合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，從而減少鐮狀紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，是血管閉塞性疼痛危機的標(biāo)志[34]。同時L-谷氨酰胺能夠增加雞腸道黏膜免疫機能[36]和緩解人體急性酒精肝損傷[37]。

圖5 低鹽蝦醬中差異氨基酸分析Fig.5 Analysis of differential amino acids in low-salt shrimp paste

綜上所述，在10 ℃發(fā)酵的低鹽蝦醬中氨基酸含量大于常溫發(fā)酵的低鹽蝦醬，與傳統(tǒng)蝦醬相比，低鹽蝦醬中含鹽量降低，氨基酸態(tài)氮含量升高，提高了蝦醬的品質(zhì)[38]。結(jié)合其他指標(biāo)看，本研究的低鹽蝦醬產(chǎn)品不僅是一個健康產(chǎn)品同時也符合人類綠色健康生活理念。

3 結(jié) 論

利用GC-MS技術(shù)對低鹽蝦醬發(fā)酵過程中的代謝物進(jìn)行監(jiān)測分析。結(jié)果表明，溫度對低鹽蝦醬中的代謝物有明顯影響。通過PLS-DA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 ℃和20 ℃發(fā)酵的低鹽蝦醬中代謝物均能在第4、8周明顯分開，說明這些代謝物有顯著差異。2種溫度下發(fā)酵的低鹽蝦醬中代謝物主要為氨基酸類和脂肪酸類物質(zhì)?；赩IP值大于1且P值小于0.05共篩選出30種差異代謝物，主要為氨基酸類、有機酸類、酯類、嘌呤類和醇類物質(zhì)。與20 ℃發(fā)酵的低鹽蝦醬相比，10 ℃發(fā)酵低鹽蝦醬中L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺、肌氨酸和嘌呤類化合物含量較高，而酯類物質(zhì)含量較少。與傳統(tǒng)蝦醬相比，10 ℃發(fā)酵的低鹽蝦醬不僅含鹽量降低，而且營養(yǎng)特性較高。本研究有助于低鹽蝦醬發(fā)酵過程中代謝物的變化和差異，為低鹽蝦醬的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。