鱸魚干加工過程中熱處理及內(nèi)源酶對風味形成的影響

劉夏磊，劉芯如，王雨恬，魏好程,2,3,4,5，李利君,3,4，倪 輝,2,3,4,5,*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心（大連工業(yè)大學），遼寧 大連 116000；3.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；4.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；5.廈門市食品與生物工程與技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，水產(chǎn)品總產(chǎn)量連續(xù)多年位居世界第一，2020年全國水產(chǎn)品總量為6 545萬 t[1]。水產(chǎn)品中含有豐富的蛋白質(zhì)、ω-3多不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是日常膳食的重要組成部分[2]。風味是評價水產(chǎn)品品質(zhì)的一項重要指標，也是消費者選擇食品的主要依據(jù)之一，對水產(chǎn)品的風味進行分析及改良控制具有重要的科學及產(chǎn)業(yè)價值。

風味成分萃取富集方式主要有頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）、同時蒸餾萃取[3]、吹掃捕集法和溶劑輔助風味蒸發(fā)等[4]，其中HS-SPME操作簡單便捷、樣品用量少、靈敏度高[3]，廣泛應用于各類風味物質(zhì)的萃取。風味成分鑒定分析方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞法[6]、氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[7]等，其中GC-MS儀器價格最便宜，應用范圍最廣[8]。風味評價主要采用感官評價法。對風味感官及成分差異進行統(tǒng)計分析的方法包括主成分分析[9]、方差分析[10]和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）[8]等。PLSR將復雜數(shù)據(jù)簡單化，其評價模型可用于風味品質(zhì)的量化評價。

水產(chǎn)品風味主要由脂類水解、氧化、美拉德等反應形成。在肌肉和脂肪組織中，脂肪酶和磷脂酶水解脂肪，釋放游離脂肪酸，進一步氧化產(chǎn)生揮發(fā)性化合物，形成產(chǎn)品風味[11]。此外，有學者發(fā)現(xiàn)酶和微生物均對咸魚熟化階段的風味形成具有重要作用[12]，熱加工方式及熱風干燥溫度對水產(chǎn)品風味影響顯著，（45f2）℃中溫風干和（30f2）℃低溫風干產(chǎn)品感官評價較好[13-14]。這些原因?qū)е虏煌庸すに囍频玫乃a(chǎn)加工制品風味存在明顯差異。目前，針對加工溫度、腌制和風干工藝等對水產(chǎn)品及其加工制品風味物質(zhì)影響的研究較多，關(guān)于水產(chǎn)品加工過程中熱處理和內(nèi)源酶引起風味成分變化規(guī)律研究尚不深入。

鱸魚（Lateolabrax japonicus）是我國淡水名魚之一，其肉質(zhì)堅實白嫩，清香、無腥味，富含蛋白質(zhì)、B族維生素、VA和多不飽和脂肪酸[15]，是重要的經(jīng)濟魚類。有學者發(fā)現(xiàn)鱸魚干樣品在腌制風干不同階段的揮發(fā)性成分差異顯著[16]?；诖耍狙芯坎捎酶泄僭u價和GC-MS結(jié)合PLSR分析，研究鱸魚干加工過程中內(nèi)源酶和熱處理引起的風味特征及成分變化，以期為優(yōu)化鱸魚干加工工藝提供理論基礎(chǔ)，同時為理解內(nèi)源酶和熱處理對水產(chǎn)品風味的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍鮮鱸魚中段肌肉 廣東省中山市大成冷凍食品有限公司。

2,4,6 -三甲基吡啶、正構(gòu)烷烴（C8～C20）（均為色譜級） 美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇（優(yōu)級純）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；食用鹽 福建省鹽業(yè)集團有限公司；魚組織蛋白酶B（Cath-B）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-MS-QP2010 plus GC-MS儀 日本島津公司；Rtx-5MS毛細管色譜柱（60 mh0.32 mm，0.25 μm）美國Restek公司；65 μm CAR/PDMS萃取頭、HH-157330-U手動SPME進樣器 美國Supelco公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；XB-CPJ高速多功能粉碎機 永康市久品工貿(mào)有限公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；Epoch2.T酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱸魚干樣品的制備

凍鮮鱸魚在5 ℃冰箱中自然解凍24 h，清洗瀝干后，切成4 cmh2 cm的魚塊，將3%食鹽均勻涂抹魚塊，于5 ℃條件下采用干腌法腌制24 h。腌制結(jié)束后將鱸魚樣品表面鹽分沖洗干凈，用濾紙吸干魚肉表面水分，按照如圖1所示的工藝制備4種鱸魚干樣品。內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化+輕度熱處理（S1）組：將魚肉置于40 ℃內(nèi)置風機的恒溫培養(yǎng)箱中風干4.5 h，風干后100 ℃蒸煮熟化10 min；內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化+高強度熱處理（S2）組：魚肉經(jīng)40 ℃風干4.5 h后200 ℃烘烤熟化10 min；輕度熱處理（S3）組：魚肉在腌制結(jié)束后先100 ℃蒸煮熟化10 min再40 ℃風干4.5 h；高強度熱處理（S4）組：魚肉腌制結(jié)束后先200 ℃烘烤熟化10 min再40 ℃風干4.5 h。制備好的鱸魚干樣品分別放入高速絞肉機中絞成魚糜狀，置于-18 ℃環(huán)境中凍藏備用。

圖1 4種鱸魚干樣品制作工藝流程圖Fig.1 Process flow chart for the preparation of four dried sea bass samples

1.3.2 鱸魚干樣品感官評價

采用定量描述感官評價方法，評價小組由10 名成員組成，其中男性5 名、女性5名。評價人員根據(jù)GB/T 16291.1ü2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則》進行培訓，分別對鱸魚干樣品5種感官屬性進行評價，包括青草香、甜香、橘香、脂香和魚腥味。風味強度采用5 分制進行打分（0 分沒有香氣，5 分香氣最強），記錄每位評價人員的評分，每個樣品重復評價3次。

1.3.3 鱸魚中組織蛋白酶B的提取及活力測定

取S1和S2組風干后、S3組蒸煮熟化和S4組烘烤熟化后鱸魚干樣品立即用液氮冷凍，磨成細膩粉狀，各取樣品（5.00f0.01）g，按照料液比1∶2加入pH 5.8 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），在冰浴條件下高速勻漿5次（18 000～22 000 r/min、每次10 s、間隔2 s），然后12 000 r/min、4 ℃冷凍離心30 min，用紗布過濾收集上清液，用等體積的飽和(NH4)2SO4溶液鹽析過夜后離心（10 000 r/min、30 min、4 ℃），所得沉淀用20 mmol/L pH 6.0 PBS溶解后裝入透析袋充分透析12 h，透析完成后離心（10 000 r/min，30 min、4 ℃）取上清液，用濾紙過濾后再用0.45 μm濾膜過濾，即得到粗酶液[17]。通過魚組織蛋白酶B（Cath-B）ELISA試劑盒進行顯色反應，在450 nm波長下檢測，建立標準曲線計算組織蛋白酶B活性。酶活力單位定義為在最適溫度37 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘水解底物1 nmol 3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺的酶量，單位U/g。

1.3.4 鱸魚干樣品GC-MS分析

分別取S1、S2、S3和S4組鱸魚干樣品2 g于20 mL頂空瓶中，再加入2 mL 5 g/100 mL NaCl溶液和1 μL 5 mg/mL 2,4,6-三甲基吡啶標準溶液（內(nèi)標物），混合均勻后密封瓶口，置于60 ℃水浴鍋中平衡30 min，平衡結(jié)束后將經(jīng)250 ℃老化后的SPME頭插入頂空瓶中頂空吸附30 min。吸附完成后迅速插入GC進樣口解吸附3 min，進行GC-MS分析。每個樣品進行4次平行實驗（樣品重復），定量結(jié)果取4次實驗平均值。

GC條件：Rtx-5MS色譜柱（60.0 mh0.32 mm，0.25 μm），載氣高純度氦氣（99.999%），柱流量3.04 mL/min，不分流進樣；程序升溫：初始溫度35 ℃，保持3.0 min，以8 ℃/min速率升到120 ℃，再以5 ℃/min速率升到250 ℃，保持5 min，總程序時間44.63 min。

MS條件：離子源溫度230 ℃，電子電離源，電離能量70 eV，接口溫度250 ℃，掃描方式Scan模式，掃描范圍m/z35～450，溶劑延遲時間3 min。

對比NIST11、NIST11s、FFNSC1.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行相似度檢索，根據(jù)不同化合物的基峰、質(zhì)荷比進行串聯(lián)檢索與人工解析，化合物鑒定標準為其質(zhì)譜匹配度大于80%。計算樣品中揮發(fā)性成分的保留指數(shù)（retention index，RI）與文獻報道的RI進行比對以及特征離子碎片等進行定性分析。RI參照Van Den Dool等[18]的方法按式（1）計算：

式中：tn和t（n+1）分別為待測組分出峰前后碳原子數(shù)為n和n+1正構(gòu)烷烴的保留時間/min。

采用內(nèi)標法進行定量，根據(jù)2,4,6-三甲基吡啶質(zhì)量濃度，按式（2）計算待測物含量：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Microsoft Office Excel 2016軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為 fs，制作柱狀圖；采用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析；使用Unscrambler VersionX 10.4軟件進行PLSR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鱸魚干樣品的感官定量描述分析

風干臘魚主要呈青香、果香和脂香等香氣[19]。熱加工后肉制品主要呈脂香和肉香[20]，蒸煮后的水產(chǎn)品魚腥味增強，青草香等香氣減弱[21]。如圖2所示，4 組鱸魚干樣品均呈現(xiàn)不同程度的青草香、脂香、橘香、魚腥味和甜香。S1組青草香和甜香強度明顯大于S3組。S3和S4鱸魚干樣品的脂香強度均略大于S1和S2組。此外，鱸魚干樣品S3表現(xiàn)出較明顯的橘香和令人不適的魚腥味，這與同樣經(jīng)過蒸煮熟化處理的S1組樣品形成較大反差。以上結(jié)果表明，4種不同加工工藝的鱸魚干樣品整體香氣輪廓與相關(guān)文獻報道一致，但內(nèi)源酶及熱處理對香氣具有顯著影響。其中S1和S2組鱸魚干樣品中內(nèi)源酶參與化學反應可顯著提高青草香和甜香，并減弱魚腥味。輕度熱處理提高了S3組鱸魚干樣品的魚腥味和橘香；高強度熱處理顯著增強了S4組鱸魚干樣品的脂香，但降低了其甜香。

圖2 4種鱸魚干樣品感官評價雷達圖Fig.2 Radar chart of sensory evaluation scores of four dried sea bass samples

2.2 不同加工工藝鱸魚干樣品風味成分的分析

蔡國華[14]在低溫風干工藝制備的河鲀魚中檢出醇、醛、酮、酯和烴類等揮發(fā)性成分；王玨等[13]在蒸煮鮐魚樣品中鑒定出醇、酮、醛和烷烴類等揮發(fā)性成分；榮建華等[22]對脆肉鯇生鮮、蒸熟魚肉的揮發(fā)性成分進行檢測，發(fā)現(xiàn)蒸制前后脆肉鯇魚肉中主要揮發(fā)性物質(zhì)為2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、己醛和壬醛等；徐永霞等[23]研究熱處理對鱸魚風味的影響發(fā)現(xiàn)，辛醛、壬醛、苯甲醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇、1-庚醇等為其主要揮發(fā)性化合物。圖3A為4 組鱸魚干樣品揮發(fā)性成分的總離子流圖。由表1和圖3B可知，在4 組鱸魚干樣品中共鑒定出41種揮發(fā)性成分，正己醛（135.36～340.32 μg/L）、壬醛（51.36～147.58 μg/L）、正辛醛（21.09～37.42 μg/L）、丁子香酚（341.71～739.64 μg/L）、1-辛烯-3-醇（68.54～81.91 μg/L）、2,3-辛二酮（28.13～38.63 μg/L）、苯甲醛（15.30～22.56 μg/L）、石竹烯（6.33～41.51 μg/L）和2,6-二叔丁基對甲酚（102.13～223.43 μg/L）質(zhì)量濃度均較高，為鱸魚干樣品主要揮發(fā)性成分。其中，正己醛和丁子香酚在4種鱸魚干樣品中含量均最高，這與康翠翠等[24]報道加熱鱸魚肉中含量最高的風味成分為己醛和壬醛等具有一定相似性。4種鱸魚干樣品中的揮發(fā)性成分含量差異顯著，這主要是由于不同強度的熱處理與內(nèi)源酶的相互作用導致，該結(jié)果與譚汝成[25]對腌臘魚制品工藝優(yōu)化的研究結(jié)果一致。

圖3 鱸魚干樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)的總離子流圖（A）和定量分析熱圖（B）Fig.3 Total ion current chromatogram (A) and heat map (B) of volatile substances from dried sea bass

與S3組相比，S1組鱸魚干樣品中正己醛、壬醛、苯甲醛、2-壬烯醛和反-2-辛烯醛等醛類物質(zhì)含量更高。郭雅[26]研究發(fā)現(xiàn)壬醛、己醛和反-2-辛烯醛等是風干鳊魚主要風味物質(zhì)，風干過程中內(nèi)源酶參與的生物化學反應促進了醛類等揮發(fā)性成分的生成。S1組醛類和酮類物質(zhì)含量是S3組的2 倍以上，反映了鱸魚加工過程中內(nèi)源酶將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化生成小分子醛、酮類物質(zhì)的重要性。S3組鱸魚干樣品中1-己醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、異佛爾酮、癸烯醛等物質(zhì)含量高于S1組，其醇類物質(zhì)含量較高。其中2-乙基己醇和異佛爾酮僅于S3組中檢出，是其主要揮發(fā)性成分。施文正等[10]研究發(fā)現(xiàn)不同溫度條件下草魚肉主要揮發(fā)性成分為1-己醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇等。表明對水產(chǎn)品進行高溫熱處理有利于脂肪降解和其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成醇類物質(zhì)。

S4組鱸魚干樣品中大多數(shù)揮發(fā)性成分含量高于S3組，且香葉基丙酮、十一醇、反-2-壬烯-1-醇、1-十一烯等物質(zhì)是區(qū)分S4和S3組鱸魚干樣品的主要揮發(fā)性成分。高溫可以降低脂質(zhì)氧化或氫過氧化物分解形成過氧自由基所需活化能，有助于脂質(zhì)氧化的發(fā)生。因此，高強度的熱處理更有利于鱸魚干樣品中揮發(fā)性成分的形成。S1與S2組、S3與S4組之間主要為醇類物質(zhì)含量存在較大差異，表明高強度的熱處理對醇類等揮發(fā)性成分的生成影響顯著。

S1與S2組鱸魚干樣品中大部分揮發(fā)性成分的含量均高于S3和S4組，S1和S2組中丁子香酚、石竹烯、蛇麻烯和2,6-二叔丁基對甲酚含量均高于S3和S4組。這是主要與鱸魚干樣品加工過程中的內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化作用有關(guān)。Xu Weimin等[27]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化作用有助于提高肉制品中揮發(fā)性成分含量，內(nèi)源酶參與的生物化學反應對肉制品風味影響顯著。

表1 4種鱸魚干樣品中揮發(fā)性成分定性定量結(jié)果Table 1 Qualitative and quantitative results of volatile components in four dried sea bass samples

續(xù)表1

2.3 鱸魚干樣品揮發(fā)性成分與感官屬性PLSR相關(guān)性分析

為進一步探究鱸魚干樣品揮發(fā)性風味化合物與5種感官屬性（甜香、脂香、青草香、魚腥味和橘香）之間的潛在相關(guān)性，以41種揮發(fā)性成分作為自變量（X），5種感官屬性作為因變量（Y），進行PLSR分析。如圖4所示，PLSR解釋了73%的X變量方差和89%的Y變量方差，香氣感官屬性和大多數(shù)香氣物質(zhì)位于50%和100%的解釋方差之間，可以很好地被PLSR模型解釋；因子1與魚腥味正相關(guān)，而與其他4種感官屬性呈負相關(guān)；因子2與橘香和甜香正相關(guān)，而與脂香和青草香負相關(guān)。苯甲醛（8）和2,3-辛二酮（12）與橘香相關(guān)性較高；癸烯醛（31）與脂香相關(guān)性較好；庚醇（9）與青草香密切相關(guān)；正辛醛（14）和苯乙酮（23）與甜香相關(guān)性較好?？梢姡郊兹?、庚醇、2-乙基己醇、正辛醛、癸烯醛和苯乙酮等風味物質(zhì)對鱸魚干樣品的整體香氣有重要貢獻。Qian Min等[28]研究發(fā)現(xiàn)腌制和熱加工肉制品中苯甲醛、正辛醛和庚醇等揮發(fā)性成分對其香氣的形成影響顯著。

圖4 鱸魚干樣品中揮發(fā)性風味化合物與感官屬性PLSR相關(guān)性分析載荷圖Fig.4 PLSR loading plot for correlation analysis between volatile flavor compounds and sensory attributes

由表1可知，S1和S2組中呈甜香的苯甲醛和呈青草香的庚醇的含量均高于S3和S4組，具有脂香的癸烯醛在S4組中含量較高，呈橘香的正辛醛和芳香的2-乙基己醇在S3和S4組中含量較高，該結(jié)果與鱸魚感官評價結(jié)果（圖2）基本一致。魚類中不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)在內(nèi)源酶作用下生成大量醛、酮類物質(zhì)，如苯甲醛、正辛醛、己醛和苯乙酮等[29]。組織蛋白酶B等系列內(nèi)源蛋白酶促進蛋白質(zhì)水解，氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基、脫氫、脫羧和還原反應，從而生成苯甲醛和苯乙酮等芳香族類物質(zhì)[30-31]。已有研究表明癸烯醛、正辛醛和2-乙基己醇為熱處理魚類中的主要揮發(fā)性成分[24]。苯甲醛、庚醇和苯乙酮主要由內(nèi)源酶作用產(chǎn)生[26,32]。脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中酰基酯中任意碳氫位點都能與自由基結(jié)合，進而形成新的香氣物質(zhì)或隨后再次降解為小分子物質(zhì)，如2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、異佛爾酮和癸烯醛等，甘油三酯在熱誘導作用下分解成游離脂肪酸，游離脂肪酸轉(zhuǎn)化生成酮類物質(zhì)，進而氧化生成醛、醇類物質(zhì)如2-乙基己醇和正辛醛（圖5）。

圖5 苯丙氨酸在內(nèi)源酶作用下生成苯乙酮和甘油三酯熱氧化降解生成2-乙基己醇和正辛醛的途徑Fig.5 Generation pathways of acetophenone from phenylalanine generates under the action of endogenous enzymes and thermal oxidative degradation of triglycerides to 2-ethylhexanol and n-octanaldehyde

如圖6所示，S1和S2組風干后鱸魚干樣品組織蛋白酶B活力分別為44.95 U/g和44.33 U/g，S3組蒸煮熟化和S4組烘烤熟化后鱸魚干樣品中組織蛋白酶B活力分別為4.99 U/g和4.56 U/g；該結(jié)果驗證了在風干階段內(nèi)源酶活力的存在，進一步佐證了內(nèi)源酶在風干過程中對風味形成的重要影響。

圖6 不同鱸魚干樣品中組織蛋白酶B活力Fig.6 Cathepsin B specific activity in dried sea bass samples

3 結(jié) 論

4種鱸魚干樣品具有不同的風味輪廓，其中經(jīng)內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化作用的S1和S2組主要呈青草香和甜香，輕度熱處理的S3組鱸魚干樣品魚腥味和橘香明顯，高強度熱處理的S4組鱸魚干樣品脂香較突出。在4種鱸魚干樣品中共檢出41種揮發(fā)性化合物，其中醛類、酮類和醇類是鱸魚干樣品中揮發(fā)性成分的主要種類。正己醛、壬醛、苯甲醛、正辛醛、丁子香酚、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、石竹烯和2,6-二叔丁基對甲酚等揮發(fā)性化合物含量較高，是鱸魚干樣品的主要揮發(fā)性化合物。PLSR分析表明苯甲醛、正辛醛、苯乙酮、癸烯醛、庚醇和2-乙基己醇是導致4種鱸魚干樣品風味差異的主要成分。內(nèi)源酶作用的S1和S2組鱸魚干樣品中正己醛、壬醛、苯甲醛、庚醇、反-2-辛烯醛、丁子香酚和苯乙酮等含量較高，其中苯乙酮和苯甲醛等芳香族物質(zhì)是氨基酸在一系列內(nèi)源酶作用下發(fā)生轉(zhuǎn)氨基、脫氫、脫羧和還原反應生成；S3組通過輕度熱處理促進了正辛醛、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇和異佛爾酮等揮發(fā)性成分的生成；高強度熱處理的S4組鱸魚干樣品中癸烯醛、壬醛、苯乙烯和反-2-辛烯醛等揮發(fā)性成分含量較高，甘油三酯在熱處理過程中產(chǎn)生大量的醛、醇類物質(zhì)如2-乙基己醇和正辛醛等。進一步檢測組織蛋白酶B活力可知，S1和S2組鱸魚干樣品中的風味物質(zhì)主要由內(nèi)源酶在風干過程中積極參與生物化學反應生成；而S3和S4組鱸魚干樣品通過不同強度的熱處理促進脂肪分解氧化生成風味物質(zhì)。本研究豐富了鱸魚干加工過程中內(nèi)源酶和熱處理等引起的風味特征及成分變化研究，為水產(chǎn)品風味的機理研究提供了參考。