應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析生物誘導(dǎo)后雷公藤懸浮細(xì)胞化學(xué)成分

張景紅，何秀枝，戴培委

(1.華僑大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 泉州 362021；2.華僑大學(xué) 分子藥物研究院，福建 泉州 362021)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)屬衛(wèi)矛科植物，被列為福建省道地藥材，具有抗炎、抗腫瘤、抑制免疫等藥理作用，臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、腎臟疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性疾病和皮膚病等疾病[1].目前，已從雷公藤中分離出380多種化學(xué)成分，主要為二萜類、三萜類和倍半萜類生物堿等.雖然利用化學(xué)提取法、化學(xué)合成法、人工栽培及半合成法都已經(jīng)得到多種雷公藤類的成分單體，但是從生長(zhǎng)年限7 a以上的雷公藤原藥材中提取的雷公藤甲素質(zhì)量比僅為120 mg·kg-1[2]，與目前日益增長(zhǎng)的需求相比，雷公藤新藥的開發(fā)仍顯得遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足.

針對(duì)這一現(xiàn)狀，國(guó)內(nèi)外學(xué)者體外培養(yǎng)雷公藤懸浮細(xì)胞、發(fā)狀根和不定根，并采用各種生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物誘導(dǎo)后雷公藤懸浮細(xì)胞、發(fā)狀根和不定根的雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤次堿、雷公藤定堿和雷公藤吉堿等活性成分的質(zhì)量比大幅度提升[3-9]，而其他成分的質(zhì)量比提升仍舊有限.

鑒于各種雷公藤體外培養(yǎng)體系中其他成分的質(zhì)量比較低、難以分離這一現(xiàn)狀，本文利用超高效相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜連用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS/MS)和化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)懸浮細(xì)胞中微量特征峰進(jìn)行表征和分析，比較誘導(dǎo)前后懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液中化學(xué)成分的變化.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 雷公藤 雷公藤由福建省三明市漢堂生物制藥股份有限公司雷公藤GAP(good argricultine practice)種植基地提供，經(jīng)扦插至華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)基地.

1.1.2 儀器 UPLC-Q-TOF-MS/MS(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)

1.1.3 試劑 MS(murashige and skoog)固體培養(yǎng)基、6，7-V液體培養(yǎng)基(北京海博生物技術(shù)有限公司)；茉莉酸甲酯(MeJA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)、酵母提取物(Ye，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)；硝酸銀(AgNO3，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、甲醇均為色譜純(上海麥克林試劑公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雷公藤懸浮細(xì)胞體系的建立 選取扦插雷公藤嫩葉，分別用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞(HgCl2)和無(wú)菌水清洗后，切成0.5 cm×0.5 cm左右的方塊，接種于40 mL的MS固體培養(yǎng)基中.雷公藤愈傷組織培養(yǎng)至4代之后，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、質(zhì)地疏松的雷公藤愈傷組織轉(zhuǎn)入6，7-V液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)后，加入聯(lián)合誘導(dǎo)子(MeJA濃度為80 mol·L-1，Ye質(zhì)量濃度為 1 g·L-1，AgNO3質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1)，培養(yǎng)期間檢測(cè)指紋圖譜，分析化學(xué)成分的質(zhì)量比變化，待其質(zhì)量比達(dá)標(biāo)后，即得到誘導(dǎo)后雷公藤懸浮細(xì)胞體系.

1.2.2 懸浮細(xì)胞中化學(xué)成分的分離 將懸浮細(xì)胞烘干后，用適量乙酸乙酯回流提取，并合并提取液.使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘?jiān)舾珊螅眠m量的甲醇溶解.將適量甲醇溶解液和硅膠粉末混合拌樣，上樣，硅膠填料量為20 g.依次用200 mL不同比例的石油醚與乙酸乙酯洗脫液(石油醚∶乙酸乙酯分別為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10)進(jìn)行洗脫，收集10個(gè)餾分洗脫液.使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘?jiān)舾珊?，加適量的甲醇溶解成100 μg·mL-1的溶液，經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜過濾，裝于進(jìn)樣瓶中保存?zhèn)錅y(cè).

1.2.3 培養(yǎng)液中化學(xué)成分的分離 將培養(yǎng)液與等體積石油醚充分混合，重復(fù)萃取3次，再用 1/2 體積的乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘?jiān)舾珊?，用適量的甲醇溶解備用.

1.2.4 色譜分析方法 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析各種提取液的化學(xué)成分，色譜柱為 Acqity Uplc BEH C18(1.7 μm)；柱溫為25 ℃；流動(dòng)相為乙腈，流動(dòng)相水梯度洗脫；流速為0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL.

流動(dòng)相梯度洗脫條件，如表1所示.表1中：t為時(shí)間；w為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；V為流速.

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.2.5 數(shù)據(jù)處理的方法 UPLC-Q-MS/MS的數(shù)據(jù)由Analyst軟件分析，樣品相似度、聚類、共有峰等由ChemPattern軟件(北京科邁恩科技有限公司)分析.根據(jù)解卷積色譜峰提供的化合物特征碎片離子信息，自動(dòng)匹配不同樣品所表征的成分.以化合物的色譜分離信息(色譜峰保留時(shí)間)為主，結(jié)構(gòu)信息(化合物的解卷積質(zhì)譜)為輔，匹配化合物的質(zhì)譜信息.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液指紋圖譜的建立

懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液的總離子流疊加色譜，如圖1所示.圖1中：4-67-0-PYY為誘導(dǎo)0 d的培養(yǎng)液；4-67-0-XF為誘導(dǎo)0 d的懸浮細(xì)胞；4-67-5-PYY為誘導(dǎo)5 d的培養(yǎng)液；4-67-5-XF為誘導(dǎo)5 d的懸浮細(xì)胞；4-67-7-PYY為誘導(dǎo)7 d的培養(yǎng)液；4-67-7-XF為誘導(dǎo)7 d的懸浮細(xì)胞；4-67-9-PYY為誘導(dǎo)9 d的培養(yǎng)液；4-67-9-XF為誘導(dǎo)9 d的懸浮細(xì)胞；I為強(qiáng)度.

圖1 懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液的總離子流疊加色譜

懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液的總離子流共有模式色譜，如圖2所示.由圖2可知：共有模式圖譜得到554個(gè)共有峰的質(zhì)譜指紋圖譜；誘導(dǎo)后的懸浮細(xì)胞及其培養(yǎng)液的色譜峰群峰密集；誘導(dǎo)后峰面積增幅較大；誘導(dǎo)后化學(xué)成分群從懸浮細(xì)胞向培養(yǎng)液流動(dòng)，生物誘導(dǎo)促進(jìn)了多種化學(xué)成分的溶出和積累.

圖2 懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液的總離子流共有模式色譜

2.2 相似度、聚類(HCA)分析和主成分分析(PCA)

懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液的總離子流差異性分析，如圖3所示.圖3中：1為誘導(dǎo)0 d的培養(yǎng)液；2為誘導(dǎo)0 d的懸浮細(xì)胞；3為誘導(dǎo)5 d的培養(yǎng)液；4為誘導(dǎo)7 d的培養(yǎng)液；5為誘導(dǎo)9 d的培養(yǎng)液；6為誘導(dǎo)5 d的懸浮細(xì)胞；7為誘導(dǎo)7 d的懸浮細(xì)胞；8為誘導(dǎo)9 d的懸浮細(xì)胞.

實(shí)驗(yàn)通過ChemPattern軟件中夾角余弦法計(jì)算各樣品相似度，并與共有模式進(jìn)行比較，如圖3(a)所示.由圖3(a)可知：2號(hào)樣品的相似度為0.95，與共有模式有較強(qiáng)相似性，而其余樣品的相似度比共有模式低；3，4，5，6，7，8號(hào)樣品的相似度一致；1號(hào)樣品的相似度比其余樣品偏低.

(a)相似度

各樣品聚類分析的檢測(cè)結(jié)果，如圖3(b)所示.圖3(b)中：樣品分為3類，第Ⅰ類包含4，3，5，6，7，8號(hào)6個(gè)樣品，第Ⅱ、Ⅲ類均包含1個(gè)樣品，分別為1，2號(hào)；s為距離.由圖3(b)可知：誘導(dǎo)后的懸浮細(xì)胞及其培養(yǎng)液中的次生代謝產(chǎn)物有密切的化學(xué)親緣關(guān)系，但是與誘導(dǎo)前的化學(xué)關(guān)系疏遠(yuǎn).

各樣品主成分分析結(jié)果，如圖3(c)所示.圖3(c)中：S為得分.由圖3(c)可知：PC1累積方差為90.02，PC2累積方差為100.00，因此，樣品間100%的差異滿足數(shù)據(jù)分析要求，說明誘導(dǎo)前后懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液中主成分變化較大，具有顯著的差異.誘導(dǎo)后.不論是懸浮細(xì)胞還是培養(yǎng)液，其化合物的種類和質(zhì)量比都有很大的不同，相似度差異明顯.

2.3 懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液中化學(xué)成分的變化

通過對(duì)雷公藤離體培養(yǎng)體系中的質(zhì)譜指紋圖譜的比對(duì)，鑒定了104種化學(xué)成分，70個(gè)共有峰，其中，懸浮細(xì)胞共有成分有44種，已鑒定的有33種，而培養(yǎng)液中共有成分有26種，已鑒定的有19種.誘導(dǎo)后，在懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液中化學(xué)成分均發(fā)生較大的變化.

在懸浮細(xì)胞中，雷公藤甲素的質(zhì)量比提高了1.24倍，而雷公藤內(nèi)酯乙、山海棠酸衍生物1、TH1、雷公藤甲素衍生物2、雷酚內(nèi)酯、雷公藤甲素衍生物1和雷酚新內(nèi)酯的質(zhì)量比則分別提高了7.41，6.50，6.07，5.85，3.63，1.59，1.13倍，其m/z值分別為224，278，678，701的未鑒定成分的質(zhì)量比分別提高了2.88，1.57，4.04，6.27倍.在培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)子能有效提高31種化合物的質(zhì)量比，已鑒定的萜類有11種，分別為雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤甲素衍生物5、雷公藤甲素衍生物2、棓兒茶酸(gallocatechin)、雷酚萜甲醚衍生物1、TH1、TH5、齊墩果酸、兒茶素和雷酚萜；已經(jīng)鑒定的生物堿有1種，為雷公藤酸C；未鑒定的化合物有19種，其m/z值分別為223，227，246，278，287，301，309，339，362，374，383，464，475，481，539，566，685，700，905.

在懸浮細(xì)胞中，雷公藤甲素衍生物1、雷酚新內(nèi)酯、wilformine A的質(zhì)量比分別提高了2.05，2.18和1.08倍；在培養(yǎng)液中，m/z值為224的未鑒定成分的質(zhì)量比升高最顯著，提高了8.11倍，而m/z值為409和701的未鑒定成分的質(zhì)量比分別升高了1.01和2.14倍.說明誘導(dǎo)促進(jìn)了多種代謝產(chǎn)物從懸浮細(xì)胞中轉(zhuǎn)移，無(wú)論從化合物的類別或種類上都與懸浮細(xì)胞有很大的差異，培養(yǎng)液中也出現(xiàn)了各種代謝產(chǎn)物的積聚和變化.經(jīng)過共有峰比對(duì)和并參閱參考文獻(xiàn)[10-13]，可以得到部分共有峰的化學(xué)信息確認(rèn)和分析，如表2所示.

表2 部分共有峰的化學(xué)信息確認(rèn)和分析

3 結(jié)論

利用UPLC-Q-TOF-MS/MS[14-15]和化學(xué)計(jì)量學(xué)[8]成功建立了含有554個(gè)共有峰的質(zhì)譜指紋圖譜.以往對(duì)雷公藤懸浮細(xì)胞中的色譜分析大多以雷公藤甲素、雷公藤吉堿和雷公藤次堿3種化學(xué)成分為主，涉及的種類和數(shù)量均較少[16-17].Zeng等[13]利用液相和質(zhì)譜聯(lián)合的分析方法，確定18種雷公藤藥材中的化學(xué)成分.劉超等[10]利用UPLC-Q-TOF-MS/MS建立雷公藤葉片的指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行PCA分析，鑒定了23種與昆明山海棠葉片差異的代謝物.但是鮮有對(duì)雷公藤離體細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行全成分、全景式的指紋圖譜鑒定和分析，可能是因?yàn)槔坠偎幉纳L(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)20 a，許多活性成分質(zhì)量比極低.生物誘導(dǎo)和體外培養(yǎng)技術(shù)成功提高雷公藤中活性成分的質(zhì)量比，將雷公藤類指紋圖譜表征的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量從23種，提高到554種，這對(duì)于整體挖掘雷公藤類整體活性成分、建立雷公藤離體培養(yǎng)體系的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)都是有積極意義的.

通過對(duì)誘導(dǎo)前后懸浮細(xì)胞的化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子對(duì)懸浮細(xì)胞本身的固有成分有促進(jìn)和積聚作用，例如，懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)后，可增加19種成分，其中，已知成分共有10種，萜類產(chǎn)物共有7種，分別為棓兒茶酸、雷酚萜甲醚、tripterinin、雷酚萜、TH5、雷酚萜甲醚衍生物1和雷公藤紅素；而生物堿類成分則有3種，包括wilformine A、雷公藤酸C和wilforsinine B.另外，未鑒定成分有9種，其m/z值分別為222，246，339，409，453，685，579，679和701.雷公藤內(nèi)酯乙、山海棠酸衍生物1、TH1和雷公藤甲素衍生物1的質(zhì)量比分別提高了7.41，6.50，6.07，1.59倍，m/z值為453，224，278，678，701的未鑒定化合物質(zhì)量比分別提高了7.40，2.88，1.57，4.04，6.27倍.結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析和UPLC-Q-TOF-MS/MS，對(duì)雷公藤離體培養(yǎng)體系中的多種化學(xué)成分進(jìn)行分析和表征，這不僅為雷公藤的整體化學(xué)成分的表征提供了有益的思路，也為雷公藤的活性成分評(píng)價(jià)和藥效基礎(chǔ)的研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)方法.

誘導(dǎo)后，培養(yǎng)液中化學(xué)成分種類也變得極為豐富，部分產(chǎn)物的質(zhì)量比極大地提高，特別是部分水不溶解的次生代謝產(chǎn)物從懸浮細(xì)胞中發(fā)生代謝流，從而轉(zhuǎn)移積聚到培養(yǎng)液中.誘導(dǎo)子促進(jìn)了18種化合物在培養(yǎng)液中的快速積累，已鑒定的萜類成分有11種，分別為雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤甲素衍生物5、雷公藤甲素衍生物2、棓兒茶酸、雷酚萜甲醚衍生物1、TH2、TH5、齊墩果酸、兒茶素和雷酚萜；已鑒定的生物堿有1種，為雷公藤酸C；未鑒定的化合物有6種，其m/z值分別為227，246，278，339，685，579.目前未見到相關(guān)誘導(dǎo)子可以同時(shí)對(duì)18種萜類和生物堿進(jìn)行調(diào)控.誘導(dǎo)子不僅對(duì)未知的代謝產(chǎn)物調(diào)控非常顯著(m/z值為224和701產(chǎn)物的質(zhì)量比分別提高了8.22，8.14倍)，而且可以提高已知成分包括雷公藤甲素衍生物1、雷酚新內(nèi)酯和雷公藤甲素衍生物4的質(zhì)量比(分別提高了2.05，2.22和1.16倍).這是因?yàn)檫@些成分質(zhì)量比較低，難于分離，且生物誘導(dǎo)子可以調(diào)控特殊的代謝酶，啟動(dòng)代謝酶調(diào)控代謝流的快速流動(dòng)，次生代謝產(chǎn)物從懸浮細(xì)胞中發(fā)生代謝流，轉(zhuǎn)移積聚到培養(yǎng)液中.實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)部分成分存在誘導(dǎo)子抑制現(xiàn)象，這可能與誘導(dǎo)子對(duì)不同代謝酶的調(diào)控機(jī)制不同有關(guān).試驗(yàn)不僅為雷公藤活性成分的挖掘提供了有效的技術(shù)方法，而且為解決雷公藤類藥材野生資源匱乏的問題提供了有意義的探索，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.