陳科霖，王明元，尤長(zhǎng)勝，劉建福，林萍，李雨晴，陳文亮

(1.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.泉州市金勝生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，福建 泉州 362000)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl)為蘭科開(kāi)唇蘭屬的一種多年生草本植物，具有清熱涼血、除濕解毒的功效，以全草入藥[1].金線蓮含有多種生物活性化合物，如金線蓮苷、多糖、黃酮和糖苷，常用于治療肝病、糖尿病、高血脂和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2-3].國(guó)內(nèi)金線蓮已被開(kāi)發(fā)成各種不同劑型的產(chǎn)品，同時(shí)在臨床上用于治療手足口病和慢性肝炎[4].金線蓮因其獨(dú)特的藥用和食用特性，市場(chǎng)需求逐年增加，但過(guò)度消費(fèi)導(dǎo)致野生金線蓮資源急劇減少.金線蓮作為一種遮蔭植物，對(duì)其小氣候環(huán)境有著嚴(yán)格的要求.自然環(huán)境下，金線蓮繁殖能力低，生存競(jìng)爭(zhēng)力差[5-6]；而化學(xué)肥料的長(zhǎng)期使用，會(huì)嚴(yán)重影響金線蓮的可食性和安全性.

植物內(nèi)生真菌具有改善和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力[5，7-9]，是成功定居在維管植物組織中的微生物，據(jù)報(bào)道幾乎在所有植物中都有分離[10].Berg等[11]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌直接影響一些植物的功能性狀，如葉片營(yíng)養(yǎng)水平、葉片壽命、比葉面積和地上部與根的比例.Cipriano等[12]在甘蔗上發(fā)現(xiàn)的促生菌具有固氮，促進(jìn)植物激素產(chǎn)生的功能.李福艷等[13]篩選的3株真菌通過(guò)產(chǎn)生吲哚-3-乙酸(IAA)直接促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng).真菌分泌的IAA與內(nèi)源植物的IAA協(xié)同反應(yīng)，繼而刺激植物生長(zhǎng).

目前，金線蓮內(nèi)生真菌促生菌株的研究已有報(bào)道，然而已發(fā)現(xiàn)的促生菌株依然有限，商業(yè)化應(yīng)用菌株選擇空間不多.因此，繼續(xù)挖掘金線蓮促生真菌資源是非常必要與迫切.本文從福建金線蓮品種‘紅霞’的莖中分離到一株產(chǎn)IAA能力較強(qiáng)的真菌PJ3，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)基因序列分析進(jìn)行鑒定，確定其為角擔(dān)菌屬，并優(yōu)化其產(chǎn)IAA的發(fā)酵條件.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源及處理 金線蓮品種‘紅霞’來(lái)自福建省泉州金勝生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司金線蓮林下種植基地.從基地采集‘紅霞’金線蓮的完整植株，裝盒，快速帶回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃下保存.

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基，pH=5.6～6.0；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，pH=5.6～6.0；產(chǎn)IAA培養(yǎng)基：L-色氨酸1 g，LB液體培養(yǎng)基定容至1 L；初始液體培養(yǎng)基：蔗糖20 g，無(wú)水硫酸鎂0.5 g，無(wú)水磷酸氫二鉀1.5 g，無(wú)水磷酸二氫鉀1.5 g，蛋白胨10 g，去離子水定容至1 L，pH=5.6～6.0.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 取金線蓮的根、莖、葉在流水下沖洗60 min，超凈臺(tái)下剪成0.5～1.0 cm小段，將各組織在75%乙醇下浸泡1 min；用1%升汞分別浸泡根部8 min，莖4 min，葉2 min，將片段浸入75%乙醇浸泡1 min.最后用無(wú)菌水清洗3次，并在滅菌濾紙上風(fēng)干.將切好的根、莖、葉小段分別接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待從根、莖、葉切口處長(zhǎng)出菌后，挑取尖端進(jìn)行純化培養(yǎng)[14].

1.2.2 產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)真菌的篩選及能力評(píng)估 將分離純化后的菌株接入產(chǎn)IAA的培養(yǎng)基.培養(yǎng)條件：溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間為5～7 d.隨后將菌懸液于12 000 r·min-1下離心10 min，取2 mL上清液，并加入等體積顯示劑(Salkowski 比色液).對(duì)照組：等體積未接種LB液體培養(yǎng)基和Salkowski比色液混合液為陰性對(duì)照，室溫黑暗下靜置30 min，顏色不變色為陰性，不產(chǎn)IAA；變成粉紅色則為陽(yáng)性，產(chǎn)IAA，可進(jìn)行IAA定量測(cè)定其D(530)值，每株菌試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行[15].分別配置0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg·L-1分析純的IAA系列濃度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終IAA含量換算公式為

C=C1V1/V2.

上式中：C為樣品吲哚乙酸濃度，μg·mL-1；C1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的IAA濃度，μg·mL-1；V1為樣品提取液體積，mL；V2為樣品反應(yīng)液體積，mL.

1.2.3 菌株形態(tài)鑒定及ITS分子學(xué)鑒定 通過(guò)初步篩選，依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[16]和《中國(guó)真菌志》[16]對(duì)促生效果最佳的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并進(jìn)一步ITS序列分析和進(jìn)化樹(shù)分析.根據(jù)真核生物ITS保守序列通用引物ITS1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[18]送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.將測(cè)定所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù) BLAST 同源性比對(duì)分析，選取同源性較高的模式菌株用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.2.4 菌株生長(zhǎng)曲線繪制 在初始液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)156 h，裝液量(體積分?jǐn)?shù))為20%，置于28 ℃，180 r·min-1下，初始3 d每24 h取樣1次，之后每12 h取樣1次，測(cè)量菌株產(chǎn)IAA能力，并繪制曲線確定取樣時(shí)間.

1.2.5 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化 1)分別選取葡萄糖、蔗糖、乳糖作為碳源和牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉作為氮源，置于28 ℃，180 r·min-1下培養(yǎng)4 d，測(cè)量其產(chǎn)IAA能力，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)；2)在最佳碳源、氮源下分別添加不同質(zhì)量濃度的氮源或碳源，測(cè)量其產(chǎn)IAA能力，確定最佳添加量，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)；3)在優(yōu)化培養(yǎng)基上 設(shè)置不同裝液量(體積分?jǐn)?shù))、pH值和搖床轉(zhuǎn)速，分別測(cè)量其產(chǎn)IAA能力，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù).

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)5因素4水平正交試驗(yàn)，確定菌種產(chǎn)IAA的最佳條件.表1為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表.表1中：ρC，ρN分別為碳源和氮源的質(zhì)量濃度；φ為裝液量(體積分?jǐn)?shù))；ω為搖床轉(zhuǎn)速.

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 金線蓮內(nèi)生促生菌篩選

從‘紅霞’金線蓮的根、莖、葉中共分離16種內(nèi)生真菌，只有PJ1，PJ3，PY2和PG5能夠產(chǎn)IAA，如圖1所示.圖1中：ρIAA為IAA質(zhì)量濃度.從圖1可知：從莖中分離得到的PJ3產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，質(zhì)量濃度達(dá)到(106.78±4.43)μg·mL-1，顯著高于其他3個(gè)菌株.

圖1 金線蓮內(nèi)生菌產(chǎn)IAA能力比較

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 PJ3菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)，如圖2所示.由圖2可知：PJ3菌株菌落覆蓋密集的白色菌絲；菌落圓形，開(kāi)始是白色，隨后顏色逐漸加深變黃，最后為深褐色；光學(xué)顯微鏡下菌絲呈樹(shù)枝狀分布，分生孢子球形，無(wú)色透明.

(a)菌落形態(tài)A (b)菌落形態(tài)B (c)光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)

2.2.2 PJ3菌株ITS分子鑒定 PJ3菌株的ITS 擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，將序列提交 GenBank 獲得登錄號(hào) KM387384.根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索進(jìn)行BLAST比對(duì).結(jié)果表明：PJ3菌株ITS基因序列與Ceratobasidiumsp.AG-V具有97.96%的相似性.選擇已知的20種不同角擔(dān)菌屬序列，利用MEGA 7.0構(gòu)建PJ3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示.從圖3的結(jié)果初步鑒定，菌株P(guān)J3為角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium)中的一員.

圖3 基于ITS 基因序列構(gòu)建的PJ3及相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間 PJ3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株P(guān)J3分泌IAA的影響，如圖4所示.圖4中：ρIAA為IAA質(zhì)量濃度；t為培養(yǎng)時(shí)間.由圖4可知：PJ3菌株在培養(yǎng)過(guò)程中，IAA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)；從24 h到108 h，菌株快速產(chǎn)IAA；108 h時(shí)，PJ3菌株產(chǎn)IAA量達(dá)到最大值，為108.78 μg·mL-1，隨后趨于穩(wěn)定.因此，可以確定最佳取樣時(shí)間為132 h.

圖4 菌株產(chǎn)IAA濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間變化

2.3.2 碳源和氮源 不同碳源、氮源對(duì)菌株P(guān)J3分泌IAA的影響，如圖5所示.圖5中：ρIAA，ρC，ρN分別為IAA和碳源(葡萄糖)、氮源(酵母浸粉)的質(zhì)量濃度.

從圖5(a)，(b)可知：當(dāng)碳源為葡萄糖，其分泌IAA質(zhì)量濃度最高，為122.61 μg·mL-1；不同葡萄糖添加量以15 g·L-1為最佳，IAA質(zhì)量濃度高達(dá)124.81 μg·mL-1.從圖5(c)，(d)可知：當(dāng)?shù)礊榻湍附蹠r(shí)，其分泌IAA質(zhì)量濃度顯著高于蛋白和牛肉膏組(P<0.05)，添加量為10 g·L-1時(shí)，最高達(dá)到193.36 μg·mL-1.綜上所述，當(dāng)碳源為葡萄糖，氮源為酵母浸粉時(shí)，菌株P(guān)J3分泌IAA量最大.

(a)不同碳源 (b)碳源添加量

2.3.3 PJ3菌株發(fā)酵條件篩選 不同的裝液量、pH值、搖床轉(zhuǎn)速下，PJ3菌株分泌IAA能力如圖6所示.圖6中;φ為裝液量(體積分?jǐn)?shù))；ω為搖床轉(zhuǎn)速.從圖6可知：裝液量為28%時(shí)，PJ3菌株分泌IAA量顯著高于其他組；pH值為6時(shí)，PJ3菌株分泌IAA量最佳，IAA質(zhì)量濃度為182.59 μg·mL-1；搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時(shí)，PJ3菌株分泌IAA量最佳，IAA質(zhì)量濃度為181.62 μg·mL-1.

(a)裝液量 (b)pH值 (c)搖床轉(zhuǎn)速

2.3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 表2為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，表3為正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析.表2中：ρIAA為IAA質(zhì)量濃度.從表2，3可知：5個(gè)因素對(duì)PJ3菌株分泌IAA的影響順序?yàn)?B>C>D>E>A，最佳水平組合為A1B2C2D2E2，產(chǎn)量為193.59 μg·mL-1.

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

IAA產(chǎn)量方差分析結(jié)果，如表4所示.從表4可知：B因素對(duì)PJ3菌株分泌IAA的影響顯著高于其他幾個(gè)因素.綜合可知，最佳組合為A1B2C2D2E2，即1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中含葡萄糖10.0 g、酵母浸粉15.0 g、裝液量(體積分?jǐn)?shù))為28%，初始pH值為5，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1.

表4 IAA產(chǎn)量方差分析

3 討論

植物內(nèi)生菌種類(lèi)多樣性取決于自身和寄主種類(lèi)多樣性，以及寄主不同部位分布的可選性[19].目前，關(guān)于金線蓮內(nèi)生菌分離的報(bào)道較少，研究主要集中在金線蓮組織培養(yǎng)優(yōu)化和藥物成分分析上.植物內(nèi)生菌對(duì)植物本身幾乎無(wú)毒，通過(guò)生物控制和生物施肥，從根系進(jìn)入植物體內(nèi)并行使相關(guān)功能，因此，內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)將更有效[20-21].

角擔(dān)菌是一大類(lèi)與陸生蘭花形成共生關(guān)系的蘭花菌根真菌(OMF)，對(duì)于種子萌發(fā)和維持蘭花的自然種群至關(guān)重要[22].最近，Zhang等[22-23]發(fā)現(xiàn)Ceratobasidiumsp.AR2菌株和野生金線蓮共培養(yǎng)促進(jìn)了金線蓮生長(zhǎng)，并增加了黃酮類(lèi)化合物和糖苷積累，但在我國(guó)關(guān)于角擔(dān)菌屬產(chǎn)IAA的能力鮮有報(bào)道.本研究從金線蓮品種‘紅霞’健康植株的莖中分離到1株內(nèi)生真菌PJ3，經(jīng)ITS序列及進(jìn)化樹(shù)分析鑒定菌株為Ceratobasidium.因此，推測(cè)該菌株能夠促進(jìn)金線蓮品種‘紅霞’的生長(zhǎng)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)IAA的特性較好，產(chǎn)量為106.78 μg·mL-1.

眾多研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化促生菌發(fā)酵條件可以提高菌絲體生長(zhǎng)量、IAA產(chǎn)量及促生效果[18].葛春輝等[15]和李引等[24]通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氮源是影響菌株產(chǎn)IAA的主要因素，Shokri等[25]也發(fā)現(xiàn)氮源是菌株產(chǎn)IAA的主要因素，并且當(dāng)KNO3為氮源的IAA產(chǎn)率最高.本研究將PJ3產(chǎn)IAA產(chǎn)量作為重要考量指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了菌株最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖10.0 g·L-1、酵母浸粉15.0 g·L-1、裝液量(體積分?jǐn)?shù))為28%，初始pH值為5，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，試驗(yàn)結(jié)果比未優(yōu)化前IAA產(chǎn)量提高了81.30%.此外，主要影響PJ3菌株產(chǎn)IAA的因素為氮源含量，本試驗(yàn)為金線蓮的菌劑開(kāi)發(fā)提供了一定的借鑒.