紫外分光光度法測定亞硝酸鹽含量的不確定度評定

李斯斯 李鵬

【摘 要】文章簡要綜述了國內(nèi)外亞硝酸鹽的檢測方法，根據(jù)《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）對紫外分光光度法測定乳粉中亞硝酸鹽含量進(jìn)行不確定度評定。通過建立數(shù)學(xué)模型，分析其測定過程，確定影響結(jié)果的不確定度因素，從而計算亞硝酸鹽含量的不確定度及擴(kuò)展不確定度。根據(jù)主要不確定度來源，尋找有效降低結(jié)果不確定度的途徑。

【關(guān)鍵詞】分光光度法;乳粉;不確定度;亞硝酸鹽;擴(kuò)展

【中圖分類號】O657.32 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1674-0688（2022）02-0046-04

0 引言

隨著綠色生態(tài)環(huán)保理念的普及及消費(fèi)者消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，綠色產(chǎn)品逐漸成為市場主流[1]。然而近年來食品質(zhì)量安全事件頻發(fā)，居民乳制品消費(fèi)信心受到重創(chuàng)[2]，乳制品質(zhì)量安全受到消費(fèi)者重點(diǎn)關(guān)注，尤其針對亞硝酸鹽等指標(biāo)，使得眾多研究者[3-4]對GB 5009.33—2016檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)及探討。

亞硝酸鹽主要指亞硝酸鈉，其性狀為白色至淡黃色粉末或顆粒狀。因其具有較強(qiáng)氧化性，導(dǎo)致人體血液中低鐵血紅蛋白被氧化成高鐵血紅蛋白，失去攜氧功能，使人缺氧而發(fā)生中毒。亞硝酸鹽致癌機(jī)理可大致概括為胃酸條件下，亞硝酸鹽與某些物質(zhì)反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺，甚至通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，造成幼兒畸形。通常情況下，人體一次性攝入0.3 g以上的亞硝酸鹽會導(dǎo)致急性中毒甚至死亡。因而，保障乳制品安全、降低風(fēng)險是乳企義不容辭的責(zé)任。

本研究通過對亞硝酸鹽測定過程進(jìn)行分析，確定不確定度的主要來源，確保亞硝酸鹽結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期為評定測量結(jié)果質(zhì)量提供有力的理論依據(jù)及指導(dǎo)。

1 食品中亞硝酸鹽的檢測方法

亞硝酸鹽指標(biāo)作為典型的污染物質(zhì)，國家監(jiān)督執(zhí)法部門加強(qiáng)對食品安全的抽查及監(jiān)管，其檢測方法成為國內(nèi)外研究學(xué)者的課題熱點(diǎn)，大致分為以下幾類。

1.1 光度法

光度法基本原理為利用溶液中亞硝酸鹽在一定波長下具有選擇性吸收，其規(guī)律符合朗伯-比爾定律。其中，重氮偶合比色法（Griess法）最為典型，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與芳香族胺重氮化，重氮鹽與電位偶聯(lián)劑生成有色的偶氮化合物。常用芳香族胺有硝基苯胺、磺胺酸、對氨基苯乙酮等，電位偶聯(lián)劑有苯酚、1—苯酚、1—氨基萘、1，3—二氨基苯等。

1.2 熒光法

熒光法是近幾年較新的檢測方法，其原理主要為亞硝酸鹽與非熒光類物質(zhì)發(fā)生重氮化或亞硝化后產(chǎn)生熒光化合物[5]。杜曉陽[6]采用兩種方法制備了新型熒光探針NR-β-CD@AuNPs，研究發(fā)現(xiàn)該探針靈敏度高，在檢測水樣中的抗干擾性較強(qiáng)，加標(biāo)回收率為99.0%～102.0%。

1.3 色譜法

色譜法主要包括液相色譜法（紫外檢測器-液相色譜法）、離子色譜法（電導(dǎo)檢測器-離子色譜法、抑制電導(dǎo)檢測器-離子色譜法、紫外檢測器-離子色譜法）、氣相色譜法。李華麗[7]采用離子色譜法，對比電導(dǎo)檢測器和紫外檢測器發(fā)現(xiàn)，采用紫外檢測器加標(biāo)回收率為91.7%～97.5%，準(zhǔn)確性更高。

1.4 電化學(xué)法[8]

亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器的檢測原理為亞硝酸鹽被感應(yīng)元件中固定于電極表面的具有電活性和催化功能的修飾層催化，發(fā)生氧化反應(yīng)生成硝酸鹽，并將電極表面發(fā)生的反應(yīng)參數(shù)轉(zhuǎn)化成感應(yīng)信號，進(jìn)而測得電化學(xué)信號，經(jīng)電子系統(tǒng)處理后輸出并記錄。

1.5 快速檢測法

快速檢測法主要包括亞硝酸鹽檢測儀、亞硝酸鹽檢測管、亞硝酸鹽檢測試紙、亞硝酸鹽檢測試劑盒。陳敏[9]研制出一種以Whaterman的3 mm濾紙為材料的制作過程簡單、保存時間久、檢測限低的亞硝酸鹽檢測試紙，選用對氨基苯磺酸溶液與鹽酸萘乙二胺溶液按質(zhì)量比2∶1作為顯色劑，加入20%酒石酸超聲溶解后浸泡3 min，40 ℃真空干燥1.5 h。

2 材料與方法[10]

2.1 試劑與設(shè)備

2.1.1 基本試劑

試樣為隨機(jī)購買的乳粉。所用其他試劑（包括亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等）均為分析純;水為《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）規(guī)定的一級水。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)溶液

亞硝酸鈉（NaNO2）：純度99.90%，基準(zhǔn)試劑，天津市光復(fù)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，以亞硝酸鈉計）：稱取于110～120 ℃干燥至恒重的亞硝酸鈉基準(zhǔn)試劑0.100 0 g，加水溶解并移入500mL容量瓶中，定容搖勻，備用。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0μg/mL）：臨用前，于100 mL容量瓶中吸入2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至刻度，搖勻備用。

2.1.3 設(shè)備

紫外可見分光光度計（型號：TU-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);電子分析天平（型號：AL207-IC）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 原理

試樣經(jīng)提取沉淀后，在弱酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，后與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，通過外標(biāo)法測出亞硝酸鹽的含量。

2.2.2 試樣預(yù)處理

將乳粉裝入足夠大的帶蓋容器中，反復(fù)搖晃和顛倒容器使試樣混勻。

2.2.3 試樣前處理

稱取試樣10 g置于150 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL、50 g/L飽和硼砂溶液，加入約150 mL、70 ℃左右的水，混勻，于沸水浴中加熱15 min，冷卻并放至室溫。轉(zhuǎn)移上述試樣溶液于200 mL容量瓶中，依次加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液220 g/L乙酸鋅溶液各5 mL，搖勻。加水定容搖勻，放置30 min，過濾，棄初濾液30 mL，剩余濾液備用。

2.2.4 測定過程

于50 mL具塞比色管吸入40.0 mL濾液，另取9個50 mL具塞比色管，依次吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液。向以上比色管中各加4g/L對氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻，靜置3～5 min后，各加入2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，用水定容混勻，靜待15 min，在波長538 nm處用1 cm石英比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測量試樣吸光度，以亞硝酸鹽含量為橫坐標(biāo)，其吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時做試劑空白試驗(yàn)。

2.3 亞硝酸鹽含量的測量模型

公式（1）中，X為樣式中亞硝酸鹽的含量，mg/kg;V1為樣式處理液總體積，mL;V0為樣液總體積，mL;M為樣式的質(zhì)量，g;c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得測定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量，μg。

3 測量模型的構(gòu)建

3.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

Y=K1×c-K0（2）

公式（2）中，Y為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液吸光值;c為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的質(zhì)量，μg;K1為斜率;K0為截距。

3.2 不確定來源簡析[11]

根據(jù)檢測流程分析，本試驗(yàn)方法不確定來源主要由5個部分組成：①制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時的不確定度;②試樣測定時的不確定度;③試樣前處理過程引入的不確定度;④測定試樣重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度;⑤紫外可見分光光度計讀取吸光值引入的不確定度。

4 不確定度分量的確定與合成

4.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時的不確定度

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

將不同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度各測定3次，得到平均吸光度值分別為0.000，0.014 3，0.029 7，0.044 7， 0.061 3，0.077 7，0.113 0，0.148 3，0.190 0。對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性最小二乘擬合，得線性方程Y=0.015 09c-0.000 06;相關(guān)系數(shù)R=0.999 1，斜率K1=0.015 09，截距K0=-0.000 06，屬B類不確定度。

對樣液進(jìn)行測定3次，樣液中亞硝酸鈉的平均質(zhì)量c0=2.676 7μg。

則擬合直線求樣液亞硝酸鈉質(zhì)量時的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式如下：

公式（4）中，U1（c）為擬合曲線求樣液中亞硝酸鈉含量所產(chǎn)生的不確定度;s為通過貝塞爾公式求吸光度時的標(biāo)準(zhǔn)偏差;P為試樣溶液測定次數(shù)，取值3;m為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)，取值3;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液系列個數(shù)，取值9;Yi'為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值;K1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，取值0.015 09;K0為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，取值-0.000 06;ci為各標(biāo)液中亞硝酸鈉的質(zhì)量，單位為μg;c0試樣溶液中亞硝酸鈉的平均質(zhì)量，取值2.676 7μg;ci為各標(biāo)準(zhǔn)溶液中亞硝酸鹽的含量，取值5.003 0μg。

4.1.2 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度

配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度主要來自基準(zhǔn)試劑的純度、稱量過程、定容體積和溫度，均屬于B類不確定度。

將以上分量合成，則計算亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U2=1.444 1×10-2，將標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度合成，即Urel（c）=4.772 0×10-2。

4.2 試樣測定時的不確定度

4.3 試樣前處理過程引入的不確定度

4.3.1 試樣稱量時的不確定度

試樣稱量為10 g，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U1rel（m）=4.082 6×10-5。

4.3.2 試樣定容體積引入的不確定度（見表3）

試樣定容引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2rel（m）=6.791 6×10-4。

試樣稱量與試樣定容引入的相對不確定度Urel（m）=6.803 9×10-4。

4.4 測定試樣重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度

4.5 紫外可見分光光度計讀取吸光值引入的不確定度

5 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度

綜上所述，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：Uc（X）=4.889 9×10-2×1.34=0.065 mg/kg。

取置信水平區(qū)間95%，包含因子k=2，所以擴(kuò)展不確定度為U=Uc（X）×2=0.13 mg/kg。

6 測量不確定度的報告與表示[14]

乳粉中亞硝酸鹽含量為1.3 mg/kg，故其不確定度報告可表示為X=（1.3±0.1）mg/kg（k=2，置信區(qū)間95%）。

7 討論

通過不確定度來源及相對不確定度計算可知，亞硝酸鹽測定過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線對結(jié)果產(chǎn)生較大影響。在平時檢測過程中，應(yīng)盡可能采用較高精度的玻璃儀器、純度高的試劑，增加標(biāo)準(zhǔn)工作液的測定次數(shù)和試樣的測定次數(shù)，并掌握檢測的關(guān)鍵點(diǎn)，規(guī)范操作，以降低結(jié)果的不確定度，保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]王福財.基于消費(fèi)者綠色偏好視角下乳制品定價模型研究[D].西安：陜西科技大學(xué)，2020.

[2]劉彤.基于供應(yīng)鏈視角的乳制品質(zhì)量風(fēng)險評價及預(yù)警研究[D].石家莊：河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)，2020.

[3]武倫瑋，胡雪，段國霞，等.離子色譜法對乳與乳制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量測定的方法改進(jìn)及探討[J].飲料工業(yè)，2021（4）：22-30.

[4]同瑞婷，宋悅，蘭萌.嬰幼兒米粉類輔食中亞硝酸鹽測定方法的優(yōu)化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2021（13）：70-71.

[5]陳林林，韓可，李偉，等.亞硝酸鹽檢測方法的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2019（11）：3430-3435.

[6]杜曉陽.環(huán)糊精功能化金納米粒子的制備及亞硝酸根離子的檢測[D].溫州：溫州大學(xué)，2018.

[7]李華麗，蔡楚勇.離子色譜法測定奶粉中亞硝酸鹽含量的優(yōu)化[J].廣東化工，2021（13）：195-196.

[8]毛燕，包宇，韓冬雪，等.亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器研究進(jìn)展[J].分析化學(xué)，2018（2）：147-156.

[9]陳敏.食品中亞硝酸鹽快速檢測試紙方法的研制[J].食品安全導(dǎo)刊，2021（18）：89，93.

[10]GB 5009.33—2016，食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定[S].

[11]黃浦雁.嬰幼兒食品中左旋肉堿含量測定的不確定度[J].中國乳品工業(yè)，2016（4）：54-56.

[12]JJG 196—2006，常用玻璃器具檢定規(guī)程[S].

[13]JJG 10—2005，專用玻璃器具檢定規(guī)程[S].

[14]JJF 1059.1—2012，測量不確定度的評定與表示[S].