李紅波，李 娜，閆向民，葉治兵，崔繁榮，張 楊

(1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆肉牛工程技術(shù)中心，烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】肉質(zhì)性狀是一個(gè)復(fù)合型的經(jīng)濟(jì)性狀，評定指標(biāo)有pH值、保水性、結(jié)締組織含量與分布、肌纖維直徑以及牛大理石花紋豐富度所決定的。pH值是反映肉的生化變化的重要指標(biāo)，其對肉的顏色、嫩度、保水性都有顯著影響[1]；蒸煮損失越小，肉的出品率越高[2]，剪切力越小，牛肉越嫩[3]；其中大理石花紋等級是最關(guān)鍵的指標(biāo)，不僅有利于牛肉嫩度還直接影響牛肉的品質(zhì)等級[4-6]；瘦素蛋白(leptin)是由ob (肥胖基因)編碼的基因參與調(diào)節(jié)機(jī)體基礎(chǔ)代謝和胴體脂肪沉積等并起著重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】leptin可顯著減少烏金豬和長白豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞中的甘油三酯和游離脂肪酸含量[7]。皮下脂肪中l(wèi)eptin表達(dá)量與母兔肌內(nèi)脂肪含量、熟肉率和pH值呈顯著的相關(guān)性[8]，血清瘦素蛋白濃度與牛胴體的大理石花紋等級、背膘厚度[9]，綿羊的脂肪沉積等呈極顯著相關(guān)[10]。【本研究切入點(diǎn)】leptin的表達(dá)水平與肉質(zhì)關(guān)系密切，能作為研究肉質(zhì)一個(gè)候選基因。但leptinmRNA表達(dá)量在新疆褐牛肉質(zhì)方面鮮見報(bào)道。亟需研究新疆褐牛瘦素基因在不同部位中表達(dá)水平與肉質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取新疆褐牛為研究對象，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，分析其與BPI、大理石花紋、剪切力、蒸煮損失、肌肉脂肪含量等肉質(zhì)性狀相關(guān)性，為新疆肉牛肉質(zhì)育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 褐牛

選擇新疆褐牛，肉樣取自伊犁西天山農(nóng)牧發(fā)展有限責(zé)任公司舍飼狀態(tài)，活重560 kg/頭，年齡2.5～3歲，根據(jù)《新疆褐牛品種標(biāo)準(zhǔn)》要求，隨機(jī)選取外貌特征顯著、年齡、營養(yǎng)條件均一致，健康的新疆褐牛成年公牛20頭，禁食12 h后屠宰。采集脂肪樣品(肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)300 g/樣品，立即投入液氮中保存，以備提取總RNA。經(jīng)屠宰后，胴體在0～4℃排酸72 h，取左側(cè)胴體12～13肋背最長肌組織，用于肉質(zhì)性狀檢測。

1.1.2 主要儀器試劑

儀器：BIOFUGE PRIMOR低溫離心機(jī)，超ZHJH C1112B凈工作臺，Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀，NanoDrop?ND-2000 Spectorphotometer可見/紫外分光光度計(jì)，CFX96TM實(shí)時(shí)定量PCR儀。

試劑：Oligo(dT)15；Ribonuclease Inhibitor，M-MLV5×Reaction Buffer，SYBR?Prime Script TMⅡ熒光定量試劑盒。

1.2 方 法

1.2.1 指標(biāo)測定

1.2.1.1 體重、體高

按常規(guī)方法進(jìn)行體重稱量，體尺測量。根據(jù)體重和體高數(shù)據(jù)計(jì)算肉用指數(shù)(Beef purpose index) BPI值即體重與體高比值。

1.2.2 等級評定

1.2.2.1 大理石花紋

依據(jù)第12～13處背最長肌橫切面內(nèi)，脂肪沉積量的多少進(jìn)行等級評定，大理石花紋等級從4至1依次為幾乎沒有、少量、豐富、極豐富，每2級間沒有0.5級。

1.2.2.2 胴體脂肪覆蓋

于屠宰后懸掛測定牛體皮下脂肪覆蓋度面積占整個(gè)胴體總面積的比率。脂肪覆蓋等級從4至1依次為特級、優(yōu)一級、優(yōu)二級和普通級。

1.2.2.3 pH

用NWF-IQ160G便攜式pH測定儀進(jìn)行測定。將探頭插入到肉樣中，使pH計(jì)電極與肌肉中的組織液充分接觸，待pH計(jì)湊數(shù)穩(wěn)定后記錄，每個(gè)肉樣重復(fù)測定4～6次，取平均值為最終pH值測定結(jié)果。

1.2.2.4 蒸煮損失(cooling loss, CL)

取排酸后的肉樣，將附著標(biāo)間的脛腱、脂肪后稱重，切成約2.5 cm左右厚，用塑料袋包扎好肉樣，保持袋口朝上，放入80℃水浴鍋中，加蓋后持續(xù)加熱，直至肌肉中心溫度達(dá)到70℃為止，取出肉樣使肌肉冷至室溫，吸干表面水分，稱蒸煮后重，計(jì)算蒸煮損失。

1.2.2.5 剪切力

蒸煮損失與嫩度測定同步進(jìn)行，將蒸煮后吸干表面水分并稱重后的肉樣，用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向鉆取肉柱(每個(gè)樣品至少取3根肉柱，避開肉筋)，然后用C-LM型嫩度計(jì)測定每個(gè)肉柱的剪切力值，取其平均值作為該樣品的剪切力值。

1.2.3 總 RNA 的提取及其純度

稱取150 mg的脂肪組織，研磨至于1 mL QIAzol裂解液中，并根據(jù)RNeasy Lipid Tissue Mini試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行RNA提取。獲得的RNA利用紫外可見分光光度計(jì)檢測純度及濃度，RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR體系：水7.4 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上有引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；35個(gè)循環(huán)(95℃ 30s，57℃ 1 min，72℃ 1 min)；72℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。

在NCBI網(wǎng)站上搜索目的基因序列，采用Oligo 6.0在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)目的基因引物。表1

1.3 數(shù)據(jù)處理

以gapdh基因作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法測定leptin基因的相對表達(dá)量，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并利用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)系數(shù)和顯著性。

表1 引物序列信息Table 1 The primer sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位脂肪組織中l(wèi)eptin 基因表達(dá)水平

研究表明，新疆褐牛不同部位leptin基因相對表達(dá)量由高到低依次為肌間脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和心周脂肪。皮下和腎周脂肪中l(wèi)eptin的表達(dá)水平極顯著低于肌間脂肪(P<0.01)，而心周脂肪中l(wèi)eptin的表達(dá)水平與肌間脂肪無差異(P>0.05)；在不同部位脂肪組織中l(wèi)eptin基因表達(dá)水平，肌間脂肪組織顯著高于其他部位脂肪組織。圖1

2.2 新疆褐牛背最長肌組織肉質(zhì)特性

研究表明，新疆褐?；钪仄骄鶠?20.15 kg，屠宰率59.33%；BPI為4.45，經(jīng)過適當(dāng)?shù)挠蕳l件，新疆褐牛12～13肋的橫斷面的面積為95.23 cm2，背最長肌的剪切力3.3 kg，肉質(zhì)嫩，具有較高的商品價(jià)值，背最長肌肌內(nèi)脂肪含量所占比例5.17%。表2

注：**表示在P<0.01水平具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3 不同部位leptin基因表達(dá)水平與肉質(zhì)性狀相關(guān)性

研究表明，新疆褐牛皮下脂肪組織中l(wèi)eptin表達(dá)水平與其外脊剪切力顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.555；與蒸煮損失顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別0.479；與肌內(nèi)脂肪含量顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.474，而腎周、肌間、心周脂肪組織中l(wèi)eptin表達(dá)水平與其肉質(zhì)性狀無顯著相關(guān)性(P>0.05)。表3

表3 不同部位leptin基因表達(dá)水平與肉質(zhì)性狀相關(guān)性Table 3 Correlation between leptin gene expression levels in different parts and meat quality traits

3 討 論

新疆褐牛的4個(gè)部位脂肪組織中l(wèi)eptin基因均有表達(dá)，證實(shí)了瘦素蛋白在新疆褐牛脂肪組織中內(nèi)普遍存在。新疆褐牛不同部位leptin基因相對表達(dá)量由高到低依次為肌間脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和心周脂肪。肌間脂肪中l(wèi)eptin的表達(dá)水平極顯著高于皮下和腎周脂肪，且與心周脂肪的表達(dá)無顯著差異性。Tomoya等[11]研究表明，成年日本和牛leptinmRNA表達(dá)水平由高到低依次為腎、肌間、皮下脂肪，與研究結(jié)果不完全一致。leptin基因出現(xiàn)空間上的表達(dá)差異主要是leptin表達(dá)依賴于不同部位脂肪細(xì)胞形態(tài)。新疆褐牛各部位脂肪單個(gè)細(xì)胞面積大小順序：腎周、皮下、心周和肌間；日本和牛各部位脂肪大小順序也不同：腸系膜、腎周、肌間、皮下脂肪；同時(shí)也有研究指出，脂肪組織中毛細(xì)血管網(wǎng)也廣泛的存在，脂肪生成依賴血管的生成，首先脂肪細(xì)胞的增殖主要發(fā)生在毛細(xì)血管簇中，其次抑制血管生成顯著降低脂肪組織的重量，血管生長因子能夠刺激細(xì)胞的分化，脂肪細(xì)胞也會分泌血管生長因子，脂肪組織生成基于血管形態(tài)和毛細(xì)血管的密度[12]。毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)為脂肪細(xì)胞提供營養(yǎng)，并允許脂肪細(xì)胞積極分泌脂肪細(xì)胞因子，如瘦素[13,14]。

瘦素是動(dòng)物脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，可以通過作用于下丘腦調(diào)節(jié)攝食，同時(shí)還可以通過促進(jìn)三酰甘油分解抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)的表達(dá)，也可以通過增加能量消耗來介導(dǎo)乙酰輔酶A羧化酶基因(Acetyl CoA carboxylase)的表達(dá)從而抑制脂肪的合成[15]。新疆褐牛肌內(nèi)脂肪含量和皮下脂肪組織中l(wèi)eptin基因的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.474，P<0.05)，皮下脂肪組織中的leptin基因?qū)?nèi)脂肪有顯著影響。皮下脂肪也能反映脂肪沉積的程度，肌內(nèi)脂肪也是沉積于肌束膜中的，兩者具有顯著相關(guān)性，也是評價(jià)牛肉品質(zhì)的一個(gè)重要因素。肌內(nèi)脂肪能夠促進(jìn)肉的嫩度，同時(shí)也可影響牛肉的多汁性[16，17]。利木贊牛肉肌內(nèi)脂肪含量較低約為1.4%，且具有較高的剪切力[18]。母兔的肌內(nèi)脂肪含量和皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)[8]，這與研究結(jié)果一致。研究南方黃牛肉質(zhì)嫩度調(diào)控的分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn)leptin基因表達(dá)水平與肌肉的剪切力值顯著相關(guān)性，與研究結(jié)果一致[19]。研究分析了皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)水平與肌肉嫩度(剪切力)、蒸煮損失的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)可能在新疆褐牛肉質(zhì)(嫩度、蒸煮損失)形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。今后需要在細(xì)胞水平上利用RNA干擾、過表達(dá)以及TALEN敲除技術(shù)來進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能，尋找新疆褐牛肉質(zhì)調(diào)控相關(guān)的遺傳標(biāo)記。

4 結(jié) 論

新疆褐牛不同部位脂肪中l(wèi)eptin基因均有表達(dá)，其相對表達(dá)量由高到低依次為肌間脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和心周脂肪。在不同部位脂肪組織中l(wèi)eptin基因表達(dá)水平，肌間脂肪組織顯著高于其他部位脂肪組織。皮下脂肪組織中l(wèi)eptin表達(dá)水平與其外脊剪切力(r=0.555,P<0.05)、蒸煮損失(r=0.479,P<0.05)顯著正相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪含量顯著正相關(guān)(r=0.474,P<0.05)；而腎周、肌間、心周脂肪組織中l(wèi)eptin表達(dá)水平與其肉質(zhì)性狀無顯著相關(guān)性(P>0.05)，提示皮下脂肪中l(wèi)eptin基因可能參與新疆褐牛肉質(zhì)形成過程，可作為研究新疆褐牛肉質(zhì)的一個(gè)候選基因。