朱 琦，丁 丁，王凱娟，霍 然，張學(xué)森，劉婷婷，曹云霞，章志國

與體外受精(invitrofertilization，IVF)相比，體外成熟(invitromaturation，IVM)治療妊娠率相對較低，主要是因為獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目較少。胚胎在體外培養(yǎng)過程中不可避免地處于一個相對高氧的環(huán)境，導(dǎo)致胚胎產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，高水平的ROS會造成氧化應(yīng)激進(jìn)而引起細(xì)胞損傷、線粒體功能障礙、胚胎發(fā)育阻斷和凋亡[1]。因此，在培養(yǎng)液中添加抗氧化劑是抑制氧化損傷并促進(jìn)胚胎體外發(fā)育的重要途徑之一。褪黑素(melatonin，MT)作為一種強力的抗氧化劑，有動物研究[2]證明在培養(yǎng)液中添加合適濃度的MT可提高綿羊的囊胚形成率。然而，在人類胚胎培養(yǎng)液中添加MT進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)卻鮮有報道，因此，該研究旨在探討人類胚胎培養(yǎng)液中添加MT能否改善胚胎的發(fā)育結(jié)局。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組收集控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)周期中，年齡在36歲以下患者的未成熟卵母細(xì)胞(germinal，GV或metaphase I，MI)行IVM培養(yǎng)，隨后將體外成熟的卵母細(xì)胞(IVM-MII)隨機分為MT組和非MT組，MT組的IVM-MII卵母細(xì)胞行單精子胞漿內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后，置于添加了不同濃度(10-11、10-9、10-7、10-5mol/L)MT的分裂期胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，隨后將分裂期胚胎轉(zhuǎn)入與分裂期培養(yǎng)液所含MT濃度一致的囊胚期培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，而非MT組卵母細(xì)胞ICSI后直接置于不含MT的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察各階段胚胎發(fā)育情況。各組患者的年齡、基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌激素(estradiol，E2)、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、不孕年限和獲卵數(shù)等相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。該研究已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2015013)。

表1 患者基本臨床資料

1.2 藥物與試劑重組人卵泡刺激素(Serino Barueri，SP，Brazi)，促性腺激素釋放激素拮抗劑(Merck Serono SA-Geneva， Switzerland)，人絨毛膜促性腺激素(AESCA Pharma，Austria)，褪黑素(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO，USA)，胚胎培養(yǎng)液(Cook，Sydney，Australia)，組織培養(yǎng)油(Vitrolife，Goteborg，Sweden)，SurePlex DNA Amplification System試劑盒(New England Biolabs，USA)。

1.3 控制性超排卵方案所有入組患者均采用GnRH拮抗劑方案(靈活方案)進(jìn)行超促排卵，即從月經(jīng)周期第2～3天給予重組人卵泡刺激素(gonadotropins，Gn，Gonal F)進(jìn)行超排卵，4～5 d后根據(jù)卵泡大小及激素水平調(diào)整Gn用量，當(dāng)優(yōu)勢卵泡達(dá)到12～14 mm時添加促性腺激素釋放激素拮抗劑(gonadotropin-releasing hormone antagonist，GnRH-A，Cetrotide)至注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG，Pregnyl)日。當(dāng)卵巢上2～3個卵泡直徑 ≥18 mm時，注射10 000 U HCG，在陰道超聲指導(dǎo)下于36～38 h后完成取卵。

1.4 IVM培養(yǎng)收集COH周期的GV/MI卵母細(xì)胞，挑選形態(tài)正常的卵母細(xì)胞入已準(zhǔn)備好且平衡過夜的IVM液培養(yǎng)，24 h后挑選IVM-MII卵母細(xì)胞行ICSI，隨后進(jìn)行受精及胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)。IVM詳細(xì)過程參考已發(fā)表文獻(xiàn)[3]。

1.5 胚胎培養(yǎng)液的準(zhǔn)備用無水乙醇將MT溶解并稀釋至濃度為10-2mol/L(母液)，將母液分裝進(jìn)EP管，每管約10～20 μl，置于-20 ℃保存；每次實驗前1 d，取出一至多管母液復(fù)溫后用胚胎培養(yǎng)液(卵裂期或囊胚期胚胎培養(yǎng)液)通過稀釋倍數(shù)法將母液稀釋至適當(dāng)?shù)腗T濃度(10-11、10-9、10-7、10-5mol/L)，充分混勻后分別將不同MT濃度的胚胎培養(yǎng)液在直徑60 mm的培養(yǎng)皿中制備6～8滴液滴(30 μl/滴)，并覆蓋2 ml組織培養(yǎng)油。最后將培養(yǎng)皿移至37 ℃、6%CO2及飽和濕度條件下平衡18 h，備用。

1.6 胚胎體外培養(yǎng)IVM-MII卵母細(xì)胞行ICSI后，依次入分裂期及囊胚期培養(yǎng)液行5～6 d的胚胎體外培養(yǎng)，最后收集優(yōu)質(zhì)囊胚。ICSI授精、胚胎體外培養(yǎng)、發(fā)育觀察及胚胎評估等詳細(xì)過程參考已發(fā)表文獻(xiàn)[4]。

1.7 胚胎冷凍及復(fù)蘇應(yīng)用玻璃化法冷凍和復(fù)蘇所獲得的優(yōu)質(zhì)囊胚，并于-196 ℃液氮中保存半年，隨后解凍，復(fù)蘇后的胚胎應(yīng)用array CGH技術(shù)檢測其非整倍體的發(fā)生情況。胚胎凍融的詳細(xì)操作過程參考已發(fā)表文獻(xiàn)[5]。

1.8 Array CGH檢測應(yīng)用SurePlex DNA Amplification System試劑盒對復(fù)蘇后的胚胎進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后通過array CGH方法(BlueGnome 24SureV3 packagekit)對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測，最后通過PGXCloud系統(tǒng)PGS/gDNA分析軟件2.0分析并出具報告。

2 結(jié)果

2.1 MT對IVM-MII卵母細(xì)胞受精及受精后所獲胚胎發(fā)育的影響該研究共收集721枚人GV/MI卵母細(xì)胞行IVM培養(yǎng)，獲得IVM-MII卵母細(xì)胞589枚。如表2所示：589枚IVM-MII卵母細(xì)胞行ICSI受精和胚胎培養(yǎng)，共獲得囊胚125枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚53枚，見圖1，47枚發(fā)育自MT組，6枚發(fā)育自非MT組。10-9mol/L組的囊胚率分別與10-11、10-7、10-5、0 mol/L組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，P<0.0001，P<0.01)；10-9mol/L組的優(yōu)質(zhì)囊胚率分別與10-5mol/L和0 mol/L組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。以上結(jié)果表明胚胎培養(yǎng)液中添加10-9mol/L MT能明顯改善人卵母細(xì)胞ICSI后受精及受精后所獲胚胎的體外發(fā)育結(jié)果，且10-9mol/L是最佳的作用濃度。

圖1 優(yōu)質(zhì)囊胚代表圖 ×500a: 4AA; b: 4AB; c: 4AB; d: 4AB

表2 添加不同濃度MT對胚胎體外發(fā)育的影響

2.2 MT對源于GV/MI期的IVM-MII卵母細(xì)胞受精及受精后所獲胚胎發(fā)育的影響共589枚IVM-MII卵母細(xì)胞，其中295枚源于GV期卵母細(xì)胞(GV-IVM-MII)，294枚源自MI期卵母細(xì)胞(MI-IVM-MII)。

2.2.1MT對GV-IVM-MII卵母細(xì)胞受精及受精后所獲胚胎發(fā)育的影響 如表3所示：295枚GV-IVM-MII卵母細(xì)胞行ICSI授精和胚胎體外培養(yǎng)，共獲得囊胚71枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚32枚。10-9mol/L組的囊胚率分別與10-11、10-7、10-5mol/L組相比，差異統(tǒng)計學(xué)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，優(yōu)質(zhì)囊胚率方面，10-9mol/L組均高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 MT對GV-IVM-MII卵母細(xì)胞受精及受精后所獲胚胎發(fā)育的影響

2.2.2MT對MI-IVM-MII卵母細(xì)胞受精及受精后所獲胚胎發(fā)育的影響 如表4所示：294枚MI-IVM-MII卵母細(xì)胞行體外授精和胚胎體外培養(yǎng)，共獲得囊胚54枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚21枚。受精率、卵裂率、囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率方面：10-9mol/L組的受精率和卵裂率均高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；10-9mol/L組的囊胚率分別與10-7、10-5和0 mol/L組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；10-9mol/L組的優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 MT對MI-IVM-MII卵母細(xì)胞受精及受精后胚胎發(fā)育的影響

2.3 Array CGH檢測結(jié)果該研究共獲得并凍存優(yōu)質(zhì)囊胚53枚，隨后共復(fù)蘇40枚優(yōu)質(zhì)囊胚用于array CGH檢測，其中非MT組(0 mol/L)6枚胚胎接受檢測，而MT組共34枚(10-11mol/L：n=7；10-9mol/L：n=16；10-7mol/L：n=8；10-5mol/L：n=3)。非MT組有2枚胚胎被診斷為非整倍體(整條染色體水平和片段水平的缺失)，其余4枚胚胎正常；MT組中，共6枚胚胎被診斷為非整倍體(整條染色體水平和片段水平的缺失、重復(fù)和嵌合)，其余28枚胚胎正常。結(jié)果表明MT組的非整倍體發(fā)生率(17.6%)低于非MT組(33.3%)，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Array CGH結(jié)果代表圖如圖2所示。

圖2 優(yōu)質(zhì)囊胚CGH結(jié)果代表圖A：整條染色體水平缺失；B：整條染色體水平重復(fù)；C：整條染色體30%以下嵌合；D：整倍體平衡囊胚代表圖

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproduction technology, ART)中的受精和胚胎培養(yǎng)方案與過去相比有了很大改進(jìn)，然而ART得到的胚胎只有少數(shù)可以足月發(fā)育，主要原因是體外培養(yǎng)難以完全模擬胚胎體內(nèi)生長的動態(tài)環(huán)境。研究[6]表明氧化應(yīng)激對胚胎發(fā)育起著抑制作用。體內(nèi)生長的胚胎會受到體內(nèi)抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽等的保護(hù)而免受氧化應(yīng)激，而在體外培養(yǎng)的胚胎不可避免地處于一個相對高氧的環(huán)境，會因為抗氧化防御系統(tǒng)失衡而導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，使胚胎在發(fā)育過程中產(chǎn)生大量的ROS[7]，最終嚴(yán)重降低胚胎的體外發(fā)育潛能。MT作為調(diào)節(jié)體內(nèi)生理周期的內(nèi)源性物質(zhì)，能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激，直接清除ROS等自由基，具有很強的抗氧化作用[8]。因此該研究通過在胚胎培養(yǎng)液中添加不同濃度的MT，觀察MT的處理對胚胎體外發(fā)育的影響。

動物研究[9]顯示，在胚胎培養(yǎng)液中添加MT能改善胚胎的體外發(fā)育結(jié)果，同時也證實這種改善作用存在濃度相關(guān)性。另有研究證明MT可降低卵母細(xì)胞中ROS水平，并對小鼠[10]、牛[11]和豬[12]的體外胚胎培養(yǎng)起到促進(jìn)作用。2020年，Zou et al[6]發(fā)現(xiàn)在人IVM液中添加MT可以通過促進(jìn)線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而改善人未成熟卵子的IVM結(jié)果，并且證實10-5mol/L是最佳的作用濃度?；谝酝难芯拷Y(jié)論可以推測：在人類胚胎的培養(yǎng)液中添加MT也可以改善胚胎的體外發(fā)育結(jié)果，并且其作用效果也存在濃度相關(guān)性。因此，本研究收集了COH周期的人未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM培養(yǎng)，以獲得IVM-MII卵母細(xì)胞并對其進(jìn)行ICSI授精，接著用含0、10-11、10-9、10-7、10-5mol/L MT的培養(yǎng)液對受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)，隨后對各組的受精及胚胎的早期發(fā)育狀況進(jìn)行系統(tǒng)地比較分析。結(jié)果顯示：若不考慮卵母細(xì)胞未成熟階段，10-9mol/L組的囊胚率優(yōu)于10-11、10-7、10-5、0 mol/L組(P<0.05，P<0.01，P<0.000 1，P<0.01)；優(yōu)質(zhì)囊胚率也均高于其他組，但僅與10-5和0 mol/L組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。以上研究結(jié)果表明：10-9mol/L MT的應(yīng)用可以顯著改善人類胚胎的體外發(fā)育結(jié)果，提高優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。隨后，研究組將未成熟卵母細(xì)胞按發(fā)育階段進(jìn)一步分為GV組和MI組，發(fā)現(xiàn)MI組的成熟率高于GV亞組(90.7%vs83.2%，P<0.01)，而GV組的受精率高于MI組(88.4%vs74.9%，P<0.000 1)；卵裂率、囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率方面，GV組均高于MI亞組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。高明 等[4]研究發(fā)現(xiàn)：GV期卵母細(xì)胞的成熟率低于MI期；受精率和卵裂率方面兩者相當(dāng)；囊胚和優(yōu)胚率方面，GV期高于MI期，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ouandaogo et al[13]研究顯示GV期卵母細(xì)胞的受精率高于MI期卵母細(xì)胞。這些結(jié)果與本研究相一致，均提示了GV期卵母細(xì)胞來源的胚胎發(fā)育潛能可能高于MI期。

IVF過程中，染色體異常是導(dǎo)致胚胎發(fā)育失敗的關(guān)鍵因素，而非整倍體的發(fā)生率(3.1%～57%)是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要危險因素，盡管胚胎表現(xiàn)為正常的形態(tài)[14-15]。本研究array CGH結(jié)果顯示：MT組優(yōu)質(zhì)囊胚中的非整倍體發(fā)生率(17.6%，6/34)低于非MT組(33.3%，2/6)，表明在胚胎培養(yǎng)基中補充10-9mol/L MT是有效的。

IVF/ICSI作為ART的重要組成部分，越來越受到人們的關(guān)注，任何影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的因素都會影響其受精及后續(xù)胚胎的發(fā)育。本研究探究了不同濃度MT對COH周期中IVM-MII卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明人類胚胎培養(yǎng)液中添加MT可以促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育，這種促進(jìn)作用存在濃度相關(guān)性，10-9mol/L是最佳的作用濃度。這一結(jié)論為改善胚胎體外發(fā)育結(jié)果提供了一種新的策略，具有重要的臨床應(yīng)用價值。