韓政宏，段宇軒，徐善斌，王敬國(guó)，劉化龍，楊洛淼，賈 琰，辛 威，鄭洪亮，鄒德堂

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻(Oryzasativa)是世界范圍內(nèi)最主要的糧食作物之一，為全球1/2以上的人口提供主要的食物來(lái)源[1]。近年來(lái)，人們對(duì)優(yōu)質(zhì)稻米的需求量逐漸增加，優(yōu)質(zhì)稻米除了有良好的食味品質(zhì)外，還應(yīng)該具有良好的外觀品質(zhì)。水稻粒型是稻米外觀品質(zhì)的重要構(gòu)成因素之一，對(duì)稻米的外觀品質(zhì)有直接影響。因此，通過(guò)改良粒型提高水稻外觀品質(zhì)，是近年來(lái)水稻育種的一個(gè)重要目標(biāo)。迄今為止，水稻中已有多個(gè)粒型相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)并克隆，如GSA1[2]、GW2[3]、GS2/GL2[4]、TGW2[5]、GS3[6]、OsLG3[7]、GL3.1/qGL3[8]、qLGY3/OsLG3b[9]、TGW3/GL3.3[10]、GL4[11]、qSW5/GW5[12]、GS5[13]、TGW6[14]、GW6a[15]、GL6[16]、GLW7[17]、GL7/GW7[18]、GW8[19]和GS9[20]等。其中，GS3、GL3.1/qGL3、TGW3/GL3.3和TGW6是水稻粒長(zhǎng)性狀的主效基因，并對(duì)該性狀起負(fù)調(diào)控作用；而OsLG3、qLGY3/OsLG3b和GL4對(duì)水稻粒長(zhǎng)性狀起正調(diào)控作用。GW2、TGW2和qSW5/GW5是對(duì)水稻粒寬性狀起負(fù)調(diào)控作用的主效基因，而GS5、GW6a和GW8對(duì)水稻粒寬性狀起正調(diào)控作用。GSA1、GS2、GL6和GLW7對(duì)水稻粒長(zhǎng)和粒寬性狀都有正向調(diào)控作用。GL7/GW7正向調(diào)控粒長(zhǎng)，但對(duì)粒寬起負(fù)調(diào)控作用；而GS9負(fù)調(diào)控粒長(zhǎng)，但正向調(diào)控粒寬。對(duì)于一些負(fù)調(diào)控水稻粒型性狀的QTL，如GS3、GL3.1/qGL3、GW2、TGW2等，可通過(guò)弱等位基因或功能缺失等位基因替換的方法，快速、精確改良水稻粒型相關(guān)性狀[21]。這種方法可以靠2種生物技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，一種是通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種從供體材料中引入弱等位基因或功能缺失等位基因，另一種是通過(guò)CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行敲除。在水稻中，通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種構(gòu)建近等基因系和準(zhǔn)確引入多個(gè)等位基因需要多年時(shí)間。此外，打破基因之間的連鎖也是一大難題[22]，難以廣泛應(yīng)用。然而，利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，對(duì)負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行突變或敲除，可以方便、準(zhǔn)確、高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻粒型相關(guān)性狀的改良，相對(duì)于傳統(tǒng)育種還能縮短育種年限，加快優(yōu)良種質(zhì)資源的創(chuàng)制。

CRISPR/Cas9技術(shù)是繼ZFNs[23]技術(shù)和TALENs[24]技術(shù)之后的新型基因編輯技術(shù)[25]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種快速且高效的基因編輯工具，通過(guò)sgRNA(Single guide RNA)和Cas9(CRISPR associated protein 9)核酸酶對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，sgRNA是一種具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，可以識(shí)別PAM(Protospacer adjacent motif)序列并引導(dǎo)Cas9(CRISPR associated protein 9)核酸酶對(duì)其進(jìn)行切割，在PAM序列上游的第3或第4個(gè)堿基處造成DNA雙鏈斷裂(DSB)[26]。隨后，生物體通過(guò)同源重組(Homologous direct recombination，HDR)修復(fù)和非同源末端連接2種方式進(jìn)行修復(fù)(Nonhomologous end joining，NHEJ)，在DNA雙鏈的修復(fù)過(guò)程中形成堿基的插入、缺失和替換等突變類型，從而對(duì)目的基因進(jìn)行編輯和改造。

CRISPR/Cas9技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種作物的遺傳育種研究中[27-33]，水稻作為單子葉模式作物，可利用CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組水平上進(jìn)行定向編輯和改造。Zhang等[34]通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，在水稻W(wǎng)axy基因引入功能缺失突變，破壞Waxy正常表達(dá)，使稻米支鏈淀粉含量增加，水稻品種由非糯性變?yōu)榕葱?。Zheng等[35]通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)水稻己糖激酶基因OsHXK1進(jìn)行敲除，上調(diào)水稻光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，且增加了水稻的光合產(chǎn)物和產(chǎn)量。Zeng等[36]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻基因OsPIN5b、GS3和OsNYB30同時(shí)進(jìn)行敲除，得到了高產(chǎn)且高耐寒性的長(zhǎng)粒水稻品種。

本研究以圓粒型粳稻品種東富139、龍粳31和長(zhǎng)粒型粳稻品種東農(nóng)427為研究材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)對(duì)水稻粒型基因GS3和GS9進(jìn)行敲除，得到了多個(gè)無(wú)轉(zhuǎn)基因成分且純合突變的長(zhǎng)粒型突變株系，創(chuàng)制了多個(gè)長(zhǎng)粒型粳稻品種，并且分析GS3和GS9功能缺失突變對(duì)粒型及其他性狀的影響，加快了長(zhǎng)粒型粳稻品種的選育進(jìn)程，旨在為粳稻品種改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

受體材料：本研究以東富139(DF139)、龍粳31(LJ31)和東農(nóng)427(DN427)3個(gè)粳稻品種為試驗(yàn)材料。其中，東富139和龍粳31粒型為圓粒型，稻谷長(zhǎng)寬比1.7，東農(nóng)427粒型為中長(zhǎng)粒型，長(zhǎng)寬比2.0。

載體：試驗(yàn)所用載體pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H雙元載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈(zèng)。

1.2 敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

通過(guò) NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得GS3(Os03g0407400)、GS9(Os09g0448500)的基因序列，利用 CRISPR-GE 在線網(wǎng)站[37](http：//skl.scau.edu.cn/)的“CRISPR Primer Designer”模塊設(shè)計(jì)GS3和GS9基因靶序列，在GS3第1外顯子設(shè)計(jì)2對(duì)靶點(diǎn)及接頭引物，在GS9第1外顯子設(shè)計(jì)1對(duì)靶點(diǎn)接頭引物，T1-F/R、T2-F/R及T3-F/R(表1)。并利用NCBI網(wǎng)站上Blast程序進(jìn)行篩選，未找到脫靶序列。

參照Ma等[38]的試驗(yàn)方法分別構(gòu)建GS3敲除載體和GS3、GS9雙基因敲除載體。

表1 本研究中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 質(zhì)粒擴(kuò)繁及陽(yáng)性克隆篩選

將構(gòu)建好的載體通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入Mach1-T1感受態(tài)大腸桿菌中，涂板培養(yǎng)并挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取陽(yáng)性菌落搖菌后提取質(zhì)粒，隨后用AscⅠ內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，將酶切檢測(cè)無(wú)誤的質(zhì)粒通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入到EHA105感受態(tài)農(nóng)桿菌中。

1.4 T0植株的獲得

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CRISPR/Cas9表達(dá)載體轉(zhuǎn)入粳稻品種東富139、龍粳31和東農(nóng)427的愈傷組織，用潮霉素篩選出陽(yáng)性愈傷組織并分化成T0植株。采用CTAB法[39]提取T0植株全基因組DNA，以潮霉素基因特異性引物Hyg-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)陽(yáng)性植株。并設(shè)計(jì)引物GS3-seq-F/R和GS9-seq-F/R(表1)，分別擴(kuò)增GS3和GS9基因靶點(diǎn)及其附近的序列，對(duì)所有轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用兼并序列解碼(DSDecode)方法[40]進(jìn)行分析。

1.5 T1純合突變植株及無(wú)T-DNA原件植株的篩選

在T1植株分蘗期，取葉片提取全基因組DNA，利用GS3-seq-F/R和GS9-seq-F/R引物進(jìn)行PCR測(cè)序，篩選出純合突變的植株，再利用Hyg-F和Hyg-R引物在純合植株中篩選無(wú)T-DNA元件插入的植株，并將這些植株自交繁殖至T2。

1.6 T2植株農(nóng)藝性狀考察

種植東富139、龍粳31、東農(nóng)427野生型和T2無(wú)T-DNA元件插入的純合突變體植株，成熟后分別測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬、千粒質(zhì)量、結(jié)實(shí)率及穗粒數(shù)。利用SPSS 18.0軟件對(duì)農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻GS3和GS9敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

本研究在GS3的第1外顯子設(shè)計(jì)了2對(duì)gRNA靶點(diǎn)接頭引物，在GS9第1外顯子處設(shè)計(jì)了1對(duì)gRNA靶點(diǎn)接頭引物，具體靶點(diǎn)信息見圖1。

圖1 GS3、GS9基因結(jié)構(gòu)及靶點(diǎn)位置Fig.1 Gene structure and target site of GS3，GS9

2.2 GS3和GS3、GS9基因表達(dá)載體的構(gòu)建

利用“金門”克隆法將帶有靶點(diǎn)的gRNA連接到Cas9的載體骨架上，構(gòu)建好的載體即為pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體(圖2)。

圖2 pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體Fig.2 pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA vector and pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA vector

2.3 T0轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的獲得

分別用轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的農(nóng)桿菌侵染3個(gè)粳稻品種的愈傷組織，在T0突變體植株成熟時(shí)，提取基因組DNA，用載體特異性引物Hyg-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性植株。結(jié)果表明，共獲得轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體的陽(yáng)性植株48株，其中東富139、龍粳31和東農(nóng)427分別獲得20，10，18株；轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的陽(yáng)性植株100株，其中東富139、龍粳31和東農(nóng)427分別獲得35，32，33株。

2.4 T0突變體GS3和GS9基因靶點(diǎn)突變類型分析

對(duì)已篩選的陽(yáng)性植株，利用引物GS3-seq-F/R和GS9-seq-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序分析，篩選得到的148株陽(yáng)性植株中，檢測(cè)到GS3靶點(diǎn)突變植株125株，GS3靶點(diǎn)突變率為84%；對(duì)GS9基因進(jìn)行編輯，得到100株陽(yáng)性植株，其中檢測(cè)到GS9靶點(diǎn)突變的植株共28株，GS9靶點(diǎn)的突變率為28%。在轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體的48株陽(yáng)性植株中獲得45株突變植株，突變率高達(dá)93.75%。在轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的100株陽(yáng)性植株中獲得85株陽(yáng)性突變植株，突變率為85%，其中東富139、龍粳31和東農(nóng)427分別篩選出GS3單基因突變植株19，15，23株，GS9單基因突變植株2，2，1株，GS3、GS9雙基因突變植株7，10，6株(表2)。

表2 轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的T0植株測(cè)序Tab.2 Sequencing results of T0 plants transformed into pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA vector

2.5 T1純合無(wú)T-DNA元件植株篩選

為獲得東富139、龍粳31和東農(nóng)427 3個(gè)品種的GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無(wú)T-DNA元件突變植株，在T1利用引物GS3-seq-F/R、GS9-seq-F/R和Hyg-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。最終獲得東富139背景下GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無(wú)T-DNA元件突變植株3，2，2株；龍粳31背景下GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無(wú)T-DNA元件突變植株各2株；東農(nóng)427背景下GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無(wú)T-DNA元件突變植株4，2，1株。

在3個(gè)品種T1的gs3、gs9和gs3gs9純合無(wú)T-DNA元件突變體中各選1株繁殖至T2，并進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察。詳細(xì)突變情況見圖3。

紅色堿基為插入；紅色虛線為堿基缺失；PAM序列用下劃線及藍(lán)色標(biāo)注。Base insertion was marked with red letters；Base deletion was marked with red dotted line；PAM sequence was marked with underscore and blue.

2.6 T2植株農(nóng)藝性狀分析

將T2突變株系分別與其對(duì)應(yīng)的野生型品種進(jìn)行粒長(zhǎng)、粒寬、千粒質(zhì)量、結(jié)實(shí)率和穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀的比較分析(圖4)。

在3個(gè)粳稻品種中，gs3、gs9和gs3gs9突變體的粒長(zhǎng)與野生型相比均顯著增加(圖5)。其中g(shù)s3突變體粒長(zhǎng)較野生型增加了8%～17%，gs9突變體粒長(zhǎng)較野生型增加了5%～15%，gs3gs9突變體粒長(zhǎng)較野生型增加15%～21%，且每種突變體的粒長(zhǎng)與其野生型相比都達(dá)到了顯著水平。東富139突變體的粒長(zhǎng)較野生型增加16%～21%，龍粳31突變體的粒長(zhǎng)較野生型增加11%～19%，東農(nóng)427突變體的粒長(zhǎng)較野生型增加5%～15%，其中東富139的gs3gs9突變體粒長(zhǎng)增加幅度最大，為21%；而東農(nóng)427的gs9突變體增加幅度最小，為5%。GS3、GS9單基因突變都能顯著增加水稻粒長(zhǎng)，而GS3、GS9雙基因突變對(duì)水稻粒長(zhǎng)的影響，表現(xiàn)為2個(gè)基因的加性效應(yīng)。

在粒寬方面，同一品種中，gs3突變體的粒寬與野生型相比，都沒(méi)有顯著變化；而gs9和gs3gs9突變體的粒寬都減少，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其中g(shù)s9突變體的粒寬較野生型相比減少了7%～13%，gs3gs9突變體粒寬較野生型相比減少了8%～12%(圖6)。不同品種的gs9、gs3gs9突變體的粒寬較野生型粒寬顯著減少。說(shuō)明GS3單基因突變對(duì)粒寬沒(méi)有顯著影響，而GS9單基因突變可顯著減少水稻粒寬，在gs3gs9突變體中，粒寬減少主要是GS9的基因突變?cè)斐傻挠绊憽?/p>

圖4 3個(gè)粳稻品種野生型及突變體粒型比較Fig.4 Comparison of grain size of wild type and mutant in three japonica rice varieties

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖6—9同。Different small letters show significantly different at 0.05.The same as Fig.6—9.

圖6 3個(gè)粳稻品種野生型及突變體粒寬比較Fig.6 Comparison of grain width of wild type and mutant in three japonica rice varieties

在千粒質(zhì)量方面，3個(gè)品種的gs9突變體千粒質(zhì)量與野生型相比，沒(méi)有顯著差異；而gs3和gs3gs9突變體的千粒質(zhì)量與野生型相比都顯著增加，且增加幅度相近。其中g(shù)s3突變體千粒質(zhì)量較野生型增加8%～15%，gs3gs9突變體較野生型增加10%～13%(圖7)。這一結(jié)果表明，GS9基因突變對(duì)千粒質(zhì)量性狀無(wú)顯著影響，GS3基因突變可增加水稻千粒質(zhì)量，gs3gs9突變體千粒質(zhì)量增加，主要是GS3單基因的效應(yīng)。在結(jié)實(shí)率方面，3個(gè)品種突變體的結(jié)實(shí)率與野生型植株相比均沒(méi)有顯著差異(圖8)。在穗粒數(shù)方面，3個(gè)品種的突變體中的穗粒數(shù)都略微減少，但都未達(dá)到顯著水平(圖9)。

圖7 3個(gè)粳稻品種野生型及突變體千粒質(zhì)量比較Fig.7 Comparison of 1000-grain weight of wild type and mutant in three japonica rice varieties

圖8 3個(gè)粳稻品種野生型及突變體結(jié)實(shí)率比較Fig.8 Comparison of seed-setting rate of wild type and mutant in three japonica rice varieties

圖9 3個(gè)粳稻品種野生型及突變體穗粒數(shù)比較Fig.9 Comparison of grain number per panicle of wild type and mutant in three japonica rice varieties

3 結(jié)論與討論

將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的改良，不僅具備便捷、高效等優(yōu)點(diǎn)，還能縮短育種年限。因此，這一技術(shù)正被廣泛應(yīng)用于水稻育種中[41-45]。本研究選擇圓粒型粳稻品種東富139、龍粳31和中長(zhǎng)粒型粳稻品種東農(nóng)427為受體材料，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)GS3、GS9基因進(jìn)行編輯，在3個(gè)品種中都得到了GS3單基因純合突變、GS9單基因純合突變和GS3、GS9雙基因純合突變的突變體材料。

本研究構(gòu)建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體，用分別轉(zhuǎn)入這2個(gè)載體的農(nóng)桿菌侵染3個(gè)品種的水稻愈傷組織，成苗后篩選陽(yáng)性植株，其中，轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體的48株陽(yáng)性植株中，有45株為突變植株，突變率高達(dá)93.75%；轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的100株陽(yáng)性植株中，有85株為突變植株，突變率為85%，并且這85株突變植株中，有80株在GS3位點(diǎn)都發(fā)生突變。在之前的研究中，Chen等[46]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建GS3、GL3.1雙敲除載體對(duì)水稻品種日本晴進(jìn)行基因編輯，得到的所有陽(yáng)性突變植株均在GS3靶點(diǎn)發(fā)生純合突變。Shen等[47]研究結(jié)果表明，GS3靶點(diǎn)的誘變效率極高，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論?？傮w上看，試驗(yàn)中所有陽(yáng)性植株中GS3靶點(diǎn)的突變率為84%，該頻率高于前人的研究結(jié)果；而對(duì)GS9基因進(jìn)行編輯的受體材料中，GS9靶點(diǎn)的突變率為28%，顯著低于前人的研究結(jié)果。有研究表明，靶序列的CG含量可能影響突變效率[38]。因此，推測(cè)不同靶序列中CG含量的差異，可能是造成基因突變率有顯著差異的因素之一。

GS3是水稻粒型的主效QTL。沈蘭等[48]研究結(jié)果表明，在4個(gè)粳稻品種中，gs3突變體的粒長(zhǎng)較野生型增加了8%～18%，千粒質(zhì)量較野生型增加2%～21%，結(jié)實(shí)率較野生型略微下降，但未達(dá)到顯著水平，而粒寬和穗粒數(shù)較野生型沒(méi)有顯著差異。本試驗(yàn)中，3個(gè)粳稻品種的gs3突變體較野生型的粒長(zhǎng)增幅(8%～17%)、千粒質(zhì)量增幅(8%～15%)均與前人試驗(yàn)結(jié)果相近，結(jié)實(shí)率、粒寬和穗粒數(shù)的分析結(jié)果，也與前人試驗(yàn)結(jié)果基本一致。以上結(jié)果表明，GS3單基因突變可顯著增加水稻粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量，并且在粒寬、結(jié)實(shí)率和穗粒數(shù)等性狀較野生型沒(méi)有顯著差異，通過(guò)對(duì)GS3進(jìn)行基因編輯，理論上可以增加水稻粒長(zhǎng)，并通過(guò)增加千粒質(zhì)量提高增產(chǎn)潛力。

GS9負(fù)調(diào)控水稻粒長(zhǎng)，但對(duì)水稻粒寬有正調(diào)控作用[20]。張晨[49]研究結(jié)果表明，NIL(gs9)近等基因系的粒長(zhǎng)較野生型增加9%，粒寬減少8%，千粒質(zhì)量、株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀較野生型沒(méi)有顯著差異。本試驗(yàn)中，3個(gè)品種的gs9突變體粒長(zhǎng)、粒寬的變化幅度，與前人NIL(gs9)近等基因系的粒長(zhǎng)、粒寬較野生型的變化幅度大致相近。前人試驗(yàn)結(jié)果表明，構(gòu)建近等基因系也是精確改良水稻性狀的有效方法。而本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到3個(gè)品種的gs9突變株系，相比前人構(gòu)建近等基因系的方法，更加省時(shí)省力，并且對(duì)3個(gè)品種的突變株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析的結(jié)果，理論上來(lái)說(shuō)更具說(shuō)服力。綜合本試驗(yàn)與前人試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GS9作為一個(gè)控制粒長(zhǎng)粒寬的主效QTL，可以在不影響其他農(nóng)藝性狀的基礎(chǔ)上通過(guò)增加粒長(zhǎng)并減少粒寬改良水稻粒型。

粒型是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的性狀，受多個(gè)QTL影響，而GS3、GS9都是控制粒型的主效QTL，理論上結(jié)合這2個(gè)主效QTL，可以在水稻粒型的改良中，達(dá)到更理想的效果。徐善斌等[50]研究結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)GS3和GS9進(jìn)行基因編輯，粒長(zhǎng)比野生型增加26.43%～27.01%，增幅大于GS3、GS9單基因突變體，粒寬降低13.4%～24.6%，千粒質(zhì)量增加18.34%～41.36%，并且增產(chǎn)10.82%～12.11%。本試驗(yàn)中，3個(gè)品種的gs3gs9突變體的粒長(zhǎng)、粒寬和千粒質(zhì)量較野生型的變化幅度均低于前人研究結(jié)果，但粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量增幅明顯大于GS3和GS9單基因突變體，與前人結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，相較于單獨(dú)敲除GS3或GS9基因，同時(shí)對(duì)GS3和GS9這2個(gè)主效QTL進(jìn)行基因編輯，可以在改良水稻粒型中取得更好的效果，并且在一定程度上提高水稻的增產(chǎn)潛力。

綜上所述，本試驗(yàn)以3個(gè)粳稻品種東富139、龍粳31和東農(nóng)427為受體材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)GS3、GS9基因進(jìn)行定向敲除，3個(gè)品種均獲得了gs3、gs9和gs3gs9且無(wú)T-DNA元件的純合突變體，創(chuàng)制了多個(gè)粒型改良的粳稻新種質(zhì)，加快了長(zhǎng)粒型粳稻新品種的選育進(jìn)程。