史建磊，熊自立，蘇世聞，王克磊，宰文珊

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 溫州 325006；2.福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，福建 福州 350002)

青枯病是一種毀滅性的土傳維管束病害，又稱細(xì)菌性枯萎病，病原為青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，Rs)，具有明顯的生理分化和寄主多樣性。作為世界上最重要的植物病原細(xì)菌之一，青枯菌可從植物傷口或次生根的根冠侵入，一定條件下大量繁殖并快速傳播，破壞并阻塞維管束，影響水分運(yùn)輸，從而導(dǎo)致植株萎蔫死亡。該病主要發(fā)生在熱帶亞熱帶氣候濕潤、土壤呈酸性的地區(qū)，在我國主要發(fā)生在長江流域及以南的廣大地區(qū)，但受全球氣候變暖等的影響，有向北蔓延的趨勢，是造成多種作物減產(chǎn)、甚至絕收的主要原因，特別是對茄科作物番茄的危害尤為嚴(yán)重。番茄(Solanumlycopersicum)是全球重要蔬菜，但遺傳基礎(chǔ)狹窄，經(jīng)常受到各種病害的影響。由于連作重茬、土壤富集病菌和高溫高濕氣候，我國番茄產(chǎn)區(qū)青枯病日趨嚴(yán)重，已成為番茄生產(chǎn)的主要障礙。

隨著二代測序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)已成為研究基因表達(dá)變化和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效手段，為抗病候選基因的鑒定和分子標(biāo)記開發(fā)提供了基礎(chǔ)。目前，RNA-seq技術(shù)已在番茄多種生物或非生物脅迫研究中得到廣泛應(yīng)用[1-8]。關(guān)于青枯病響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄組鑒定，Ishihara等[9]利用基因芯片技術(shù)對莖刺法接種Rs的番茄莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)致病、激素信號和木質(zhì)素生物合成相關(guān)的140個(gè)基因在抗病番茄LS-89中上調(diào)表達(dá)，β-1，3-葡聚糖酶基因尤為明顯；French等[10]對傷根法接種Rs的番茄根進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)抗病番茄Hawaii7996根部防御基因更早更強(qiáng)被激活，同時(shí)生長素信號途徑被抑制；Zuluaga等[11]對傷根法接種Rs的野生馬鈴薯根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，在抗感材料中分別發(fā)現(xiàn)221，644個(gè)差異表達(dá)基因，前者誘導(dǎo)產(chǎn)生大量新的轉(zhuǎn)錄本，后者激素相關(guān)基因更突出；Chen等[12]對傷根法接種Rs的茄子莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)抗病材料分別有1 137，9 048個(gè)基因上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，而感病材料對應(yīng)數(shù)目是6 087，5 832個(gè)；謝冰等[13]葉轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，Y87作為砧木能夠提高接穗HD PAL活性和木質(zhì)素、多酚及病程相關(guān)蛋白等多種抗性基因表達(dá)量，從而提高煙草青枯病抗性。

面對各種病原微生物傷害，植物在漫長的進(jìn)化過程中形成了完善的自我保護(hù)機(jī)制，抗病基因(R基因)在識別和抵御病原菌入侵方面具有重要作用。盡管前人已在番茄青枯病響應(yīng)方面進(jìn)行了相關(guān)研究，但不同材料、不同接種方法、不同取樣部位等獲得的研究結(jié)果不盡一致，有必要拓展和豐富這一課題。

本研究利用高通量測序技術(shù)對傷根法接種Rs后的抗感番茄自交系地上部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合基因功能注釋，挖掘青枯病響應(yīng)相關(guān)基因并進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，以期為候選基因抗源的有效利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄AH13112111為溫州農(nóng)業(yè)科學(xué)院番茄課題組2013年春從荷蘭瑞克斯旺公司引進(jìn)品種愛好與自育AH1雜交選育的高代自交系，黃色小果型，苗期人工接種鑒定為高抗青枯病；G149351121為以色列海澤拉公司同步引進(jìn)的品種3951與自育G14雜交選育的高代自交系，紅色普通型，對青枯病表現(xiàn)為高感。青枯菌株(生理小種1生化變種Ⅲ)從田間發(fā)病番茄植株上自行分離。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 建庫與測序 番茄幼苗長到4～6片真葉時(shí)用傷根法接種青枯菌，接后48 h植株萎蔫前分別取幼嫩組織，錫箔紙包裹，立即置于液氮中，再放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆肹14]。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。參照植物TRIzol總RNA提取試劑盒(Sangon Biotech)說明書提取RNA。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；加入Fragmentation Buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷；以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase Ⅰ合成第2條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫質(zhì)控合格后進(jìn)行Illumina轉(zhuǎn)錄組測序(Biomarker Technologies)。

1.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 去除原始數(shù)據(jù)中帶有接頭序列和低質(zhì)量的reads，得到Clean reads。計(jì)算Clean reads的Q30值和GC含量。從茄科基因組數(shù)據(jù)庫(Solanaceae Genomics Network，https：//solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome)下載番茄參考基因組(ITAG4.0)的序列文件和注釋文件。使用HISAT2[15]進(jìn)行測序序列的比對。比對分析完成后利用StringTie[16]對符合要求的reads進(jìn)行組裝和定量?；谒x參考基因組序列，使用StringTie對mapped reads進(jìn)行拼接，并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較，尋找原來未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)，發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因。

1.2.3 差異基因篩選 以差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate，F(xiàn)DR)<0.01作為標(biāo)準(zhǔn)，利用DESeq2[17]進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，篩選差異表達(dá)基因。通過Blast比對工具，將測序基因與蛋白相鄰類聚簇?cái)?shù)據(jù)庫(Cluster of orthologous groups of proteins，COG)[18]、基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene ontology consortium，GO)[19]、東京基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[20]、蛋白質(zhì)真核同源數(shù)據(jù)庫(Eukaryotic orthologous groups，KOG)[21]、非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-redundant protein datebase，NR)[22]、Pfam[23]和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss prot protein datebase，Swiss-Prot)[24]進(jìn)行序列比對，獲得基因的注釋信息。

1.2.4 基因定量驗(yàn)證 以SlRPL2為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物(表1)。RT-qPCR反應(yīng)體系包括2 μL cDNA，0.4 μL PCR primer，10 μL SYBR，7.2 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，整體反應(yīng)在StepOne Plus型熒光定量PCR儀(ABI，F(xiàn)oster，CA，美國)中進(jìn)行，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著極差法(LSD)進(jìn)行多重比較和差異顯著性分析。

表1 部分RT-qPCR引物Tab.1 Part of the primers used for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

經(jīng)檢測，樣本RNA的OD260/280均為2.2，OD260/230≥1.8，28S/18S ≥2.0，RIN≥8，表明所提RNA滿足后續(xù)分析需求?？垢蟹呀臃N前后12個(gè)樣本原始測序數(shù)據(jù)去除接頭序列和低質(zhì)量序列，共獲得75.02 Gb Clean reads，各樣本凈堿基數(shù)均不小于5.73 Gb，GC含量在43.27%～44.17%，Q30堿基百分比均超過了94%(表2)。將各樣本的Clean reads與指定參考基因組進(jìn)行序列比對，比對效率為95.00%～96.31%，且比對到唯一位置的reads均超過了90%(表3)?；诨虮磉_(dá)量，重復(fù)樣本間相關(guān)系數(shù)在0.947～0.993(表4)，生物學(xué)重復(fù)良好。

表2 番茄各樣本RNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 RNA sequencing data statistics of tomato libraries

表3 番茄各樣本Clean reads與參考基因組比對Tab.3 Comparing Clean reads onto the reference genome in each tomato library

表4 生物學(xué)重復(fù)樣本的相關(guān)性Tab.4 Correlation between biological replicates

2.2 差異表達(dá)基因篩選

本研究測序共獲得35 371個(gè)基因，其中新基因1 296個(gè)。經(jīng)log2FC和FDR過濾，在抗感番茄中分別獲得970，695個(gè)DEGs，二者重復(fù)基因353個(gè)，DEG總數(shù)1 312個(gè)(新基因32個(gè))，占基因總數(shù)的3.71%。其中，上調(diào)基因分別為457，450個(gè)，重復(fù)214個(gè)，總計(jì)693個(gè)；下調(diào)基因分別為513，245個(gè)，重復(fù)137個(gè)，總計(jì)621個(gè)(表5)。2種材料接種后均上調(diào)或下調(diào)的基因分別為214，137個(gè)；抗病材料上調(diào)而感病材料下調(diào)的基因數(shù)目是0，反之是2(Solyc04g074440.1和Solyc12g096780.2)；抗病材料上調(diào)且感病材料不變的基因是198個(gè)，反之是216個(gè)；抗病材料下調(diào)且感病材料不變的基因是316個(gè)，反之是104個(gè)，后6種表達(dá)模式基因總數(shù)為836個(gè)(新基因18個(gè))(表6)。

表5 差異表達(dá)基因數(shù)目Tab.5 Number of differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因注釋

本研究注釋基因共31 903個(gè)，注釋率為90.20%。其中，抗感番茄DEG在GO和KEGG等八大數(shù)據(jù)庫的注釋數(shù)目分別為951，687個(gè)，注釋率均超過了98%；總注釋DEG是1 290個(gè)，注釋率是98.32%。這些注釋基因包括4個(gè)NBS類抗病基因、6個(gè)植物-病原互作基因、11個(gè)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、22個(gè)防御反應(yīng)基因、32個(gè)蛋白激酶、65個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其他多個(gè)重要功能因子。

表6 差異表達(dá)基因的模式分布Tab.6 Pattern distribution of differentially expressed genes

1 312個(gè)DEGs GO注釋基因?yàn)?73個(gè)，注釋率74.16%。將這些基因劃分成47個(gè)功能組，根據(jù)功能組的不同，又分為生物過程(Biological process，BP，19個(gè)亞類)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC，15個(gè)亞類)和分子功能(Molecular function，MF，13個(gè)亞類)三大類(圖1)。在生物過程中，主要涉及代謝過程、細(xì)胞過程、單生物體過程、生物調(diào)控和刺激響應(yīng)等亞類；對于細(xì)胞組分，主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器、膜部分、細(xì)胞器部分和大分子復(fù)合物等亞類；結(jié)合催化活性在分子功能中非常顯著，其次是轉(zhuǎn)運(yùn)活性和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，再次是電子載體活動(dòng)、抗氧化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和信號傳導(dǎo)活性。

1.代謝過程；2.細(xì)胞過程；3.單生物體過程；4.生物調(diào)控；5.刺激響應(yīng)；6.定位；7.細(xì)胞組成與發(fā)生；8.信號；9.發(fā)育過程 ；10.多細(xì)胞生物體過程；11.生殖過程；12.生物群體過程；13.生長；14.繁殖；15.免疫系統(tǒng)過程；16.細(xì)胞死亡；17.節(jié)律過程；18.移動(dòng)；19.生物粘附；20.細(xì)胞；21.細(xì)胞部分；22.膜；23.細(xì)胞器；24.膜部分；25.細(xì)胞器部分；26.大分子復(fù)合物；27.膜內(nèi)腔；28.胞間區(qū)；29.細(xì)胞連接；30.共質(zhì)體；31.胞間區(qū)部分；32.顆粒；33.顆粒部分；34.類核；35.結(jié)合；36.催化活性；37.轉(zhuǎn)運(yùn)活性；38.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；39.結(jié)構(gòu)分子活性；40.電子載體活性；41.分子傳導(dǎo)活性；42.信號傳導(dǎo)活性；43.抗氧化活性；44.轉(zhuǎn)錄因子活性-蛋白結(jié)合；45.養(yǎng)分存儲活性；46.蛋白質(zhì)標(biāo)簽；47.金屬伴侶活性。

本研究209個(gè)(15.93%)DEGs被注釋到88個(gè)代謝通路中，分為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和生物系統(tǒng)五大類代謝途徑(圖2-A)。其中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成相關(guān)基因分別為16個(gè)，淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因13個(gè)，植病互作相關(guān)基因11個(gè)，同時(shí)注釋還包括核酸、糖、脂肪、蛋白、萜類和黃酮類等的生物合成與代謝相關(guān)基因。依據(jù)q-value和富集因子大小，取前20個(gè)最顯著富集的代謝途徑(圖2-B)，主要包括DNA復(fù)制(9個(gè)DEGs)、二萜合成(7個(gè)DEGs)、組氨酸代謝(6個(gè)DEGs)、苯丙烷生物合成(16個(gè)DEGs)、類固醇生物合成(5個(gè)DEGs)、類黃酮生物合成(6個(gè)DEGs)、萜類骨架合成(5個(gè)DEGs)、谷胱甘肽代謝(9個(gè)DEGs)。另外，植病互作(rank 38)、淀粉和蔗糖代謝(rank 46)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(rank 47)相關(guān)基因分別為11，13和16個(gè)。

圖2 差異表達(dá)基因KEGG注釋(A)與富集(B)Fig.2 KEGG annotation(A)and enrichment(B)of differentially expressed genes

植病互作通路在抗感番茄接種后顯著富集，抗病番茄KEGG分析該通路中有7個(gè)基因差異表達(dá)，感病番茄該通路中有6個(gè)基因差異表達(dá)，2個(gè)材料中共有差異表達(dá)基因11個(gè)(圖3)。該通路中抗病番茄接種后CNGCs(Solyc02g086980.3和Solyc05g050380.4)、EIX1/2(Solyc07g008620.1)、FLS2(Solyc02g031790.3、Solyc02g068820.3和Solyc02g070890.3)和WRKY25/33(Solyc09g014990.4)上調(diào)表達(dá)；感病番茄接種后CaM/CML(Solyc04g058170.1)、FLS2(Solyc02g068820.3)、PIK1(Solyc06g075550.3)和RPM1(Solyc01g073985.1)上調(diào)表達(dá)，CNGCs(Solyc05g050380.4和Solyc09g007840.3)既有上調(diào)表達(dá)又有下調(diào)表達(dá)。

圖3 植病互作通路差異表達(dá)基因KEGG富集Fig.3 KEGG enrichment of differentially expressed genes in the plant-pathogen interaction pathway

2.4 差異表達(dá)基因啟動(dòng)子分析

基于基因功能注釋，選取74個(gè)DEGs進(jìn)行啟動(dòng)子分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因啟動(dòng)子主要包括轉(zhuǎn)錄起始(TATA-box和CAAT-box)、防御與脅迫(W box、TC-rich repeats和AT-rich sequence)、干旱(MBS)和低溫(LTR)、MeJA(CGTCA-motif和TGACG-motif)、ABA(ABRE)、SA(TCA-element)、GA(TATC-box、Pbox和GARE-motif)和AUX(TGA-element、TGA-box、AuxRR-core和AuxRE)、光響應(yīng)及厭氧誘導(dǎo)等元件(圖4)。其中，29個(gè)DEGs含42個(gè)防御與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。

2.5 差異表達(dá)基因的誘導(dǎo)表達(dá)

選取上述50個(gè)DEGs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。與轉(zhuǎn)錄組測序相比，28個(gè)基因青枯菌接種前后的表達(dá)變化趨勢一致，結(jié)合差異顯著性分析，11個(gè)基因表達(dá)調(diào)控模式一致，其中6個(gè)基因完全一致(圖5)。番茄接種青枯菌后，Solyc02g086980.3和Solyc04g011670.3在不同材料中相對表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)，抗病材料中分別提高2.62，2.36倍，感病材料分別提高1.06，1.34倍，為正調(diào)控基因；其他4個(gè)基因(Solyc01g073985.1、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1)表達(dá)量在感病材料中極顯著上調(diào)(P<0.01)，分別提高1.16，1.19，1.63，0.87倍，但在抗病材料中變化不顯著(P>0.05)，為負(fù)調(diào)控基因。推測Solyc02g086980.3和Solyc04g011670.3可能參與抗病反應(yīng)，Solyc01g073985.1、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1可能參與感病反應(yīng)。

A.已知基因；B.新基因。A.Known genes；B.New genes.

3 結(jié)論與討論

番茄青枯病是由青枯菌引起的一種土傳維管束病害，獲得抗病相關(guān)基因并理解其作用機(jī)制非常重要，而RNA-seq技術(shù)為這一問題的解決提供了有效途徑。本研究測序共獲得35 371個(gè)基因，其中1 296個(gè)新基因，1 312個(gè)DEGs，836個(gè)材料特異DEGs，并對其進(jìn)行了功能注釋和RT-qPCR驗(yàn)證，這為目的基因篩選、功能驗(yàn)證和相關(guān)機(jī)制解析提供了基礎(chǔ)。

3.1 差異表達(dá)基因的篩選與注釋

本研究測序共獲得75.02 Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù)，各樣本均達(dá)到5.73 Gb，Q30堿基占比均大于94%，過濾數(shù)據(jù)與番茄參考基因組比對率均不小于95%，說明樣品不存在污染且參考基因組選擇合適，所有樣本測序質(zhì)量良好，數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)分析。獲得的35 371個(gè)基因中注釋基因數(shù)目是31 903個(gè)，略多于Heinz 1706的測序基因數(shù)30 855個(gè)[25]，可能源自材料的不同和技術(shù)手段的改進(jìn)?；谒x參考基因組序列，共發(fā)掘到1 296個(gè)新基因，說明RNA-seq技術(shù)在新基因挖掘上的可行性。生物學(xué)重復(fù)可有效消除基因表達(dá)在不同個(gè)體間的可變性，本研究重復(fù)樣本皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.9，表明生物學(xué)重復(fù)良好?？垢蟹呀臃N前后DEG數(shù)目多于Ishihara等[9]的鑒定結(jié)果，但少于French等[10]的鑒定結(jié)果，主要?dú)w因于接種方法、取樣部位和基因表達(dá)計(jì)算的不同。有研究表明，地上部早期對青枯病的防御反應(yīng)遠(yuǎn)沒有地下部強(qiáng)烈，但萎蔫病癥出現(xiàn)后卻有大量基因差異表達(dá)[26]?？共》袲EG要多于感病番茄，尤其是下調(diào)基因，說明抗病性主要與病菌侵染后某些基因下調(diào)表達(dá)有關(guān)。不同材料間DEG數(shù)目少于接種前后的1 312個(gè)，說明差異表達(dá)主要來自接種。感病番茄接種前后DEG少于接種前抗感材料間的DEG，且不同材料接種后DEG變少，說明感病番茄對青枯菌侵染的響應(yīng)不如抗病番茄劇烈，這和前人研究結(jié)果一致[9-10]?？垢胁牧咸禺惐磉_(dá)的836個(gè)DEGs可作為病害響應(yīng)基因和候選目的基因的篩選基礎(chǔ)。

R和S分別表示抗病和感病番茄。不同大小寫字母分別表示0.01和0.05水平下的差異顯著性。R and S represent resistant and susceptible tomato lines，respectively.Different upper and lowercase letters indicate statistically significant differences at the 0.01 and 0.05 level，respectively.

本研究通過抗感材料轉(zhuǎn)錄組分析表明，病菌侵染會(huì)啟動(dòng)植物相關(guān)基因的表達(dá)及多條代謝通路。對這些DEG進(jìn)行GO富集分析，抗病反應(yīng)主要發(fā)生在膜和細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)也發(fā)生在細(xì)胞連接和細(xì)胞外部區(qū)域等部位，通過調(diào)節(jié)催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性以及抗氧化活性等分子功能，引起以細(xì)胞過程、代謝過程、單生物體過程和生物調(diào)控為主，定位、刺激響應(yīng)、細(xì)胞成分組成、信號、免疫系統(tǒng)過程等一系列生物過程的協(xié)同變化，抵抗病原菌的入侵。通過KEGG分析表明，DEG在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、DNA復(fù)制、嘧啶代謝、嘌呤代謝、植病互作、谷胱甘肽代謝、苯丙烷生物合成、氨基酸合成代謝、玉米素生物合成、泛素化蛋白水解、類黃酮生物合成、萜類物質(zhì)合成、異喹啉生物堿生物合成、芪類化合物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、內(nèi)吞作用、角質(zhì)蠟質(zhì)生物合成、油菜素甾醇生物合成、VB1/6和VC代謝和生理節(jié)律等多個(gè)代謝通路富集，說明這些代謝基因可能參與了抗病調(diào)控。本研究選取番茄幼苗地上部進(jìn)行分析，其對青枯病的防御反應(yīng)既與地下部部分重疊，又具有自身獨(dú)特的代謝途徑[10]。

基于基因功能注釋，50個(gè)DEGs用來RT-qPCR驗(yàn)證(這些基因普遍具有轉(zhuǎn)錄起始和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，28個(gè)基因在番茄接種青枯菌前后表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。推測Solyc02g086980.3和Solyc04g011670.3可能參與抗病反應(yīng)，Solyc01g073985.1、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1可能參與感病反應(yīng)。2種策略的相關(guān)性不強(qiáng)，基因表達(dá)結(jié)果不完全一致，主要?dú)w因于計(jì)算原理和表示方法的不同。本研究結(jié)合2種方法和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，篩選到6個(gè)病害響應(yīng)基因?；虮磉_(dá)受植物生長發(fā)育與環(huán)境脅迫響應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控，一方面通過R基因的過量表達(dá)抵御外界不良刺激，另一方面通過非編碼RNA調(diào)控和可變剪接等降低基因表達(dá)量[27]。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)多個(gè)感病基因(S基因)，與R基因堆疊相比，破壞單個(gè)S基因是實(shí)現(xiàn)作物廣譜和持久抗性的更有效策略[28]。

3.2 抗病相關(guān)分子機(jī)制初步解析

上述這些物質(zhì)有些可能對抗性有直接影響，有些則可能進(jìn)一步形成抗性物質(zhì)。其中植物-病原互作代謝通路包括PTI(Pattern-triggered immunity)和ETI(Effector-triggered immunity)，當(dāng)植物受到胞外病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)刺激時(shí)，Ca2+濃度增加，激活鈣離子蛋白激酶(CDPK)和鈣調(diào)蛋白(CaM/CML)，將信號傳導(dǎo)至NADPH氧化酶活性氧中間體(RBOH)和一氧化氮合成酶(NOS)，激活活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)超敏反應(yīng)(Hypersensitive response，HR)、細(xì)胞壁加固和氣孔關(guān)閉[29]。當(dāng)細(xì)菌鞭毛蛋白被受體激酶(FLS2)識別，通過胞吞作用將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活下游的絲裂原活化蛋白激酶(MEKK)MKK1/MKK2→MPK4或MKK4/MKK5→MPK3MPK6。信號傳入細(xì)胞核后，WRKY22/29激活防御基因或WRKY25/33抑制相關(guān)基因[30]。本研究中，環(huán)腺苷酸門控通道(CNGCs)基因Solyc02g086980.3在抗病番茄接種后上調(diào)表達(dá)，Solyc05g050380.4在抗感番茄中均上調(diào)，Solyc09g007840.3在感病番茄中下調(diào)表達(dá)，Ca2+濃度發(fā)生變化，激活CaM/CML基因Solyc04g058170.1在感病番茄中的表達(dá)。青枯菌侵染后，F(xiàn)LS2基因Solyc02g031790.3和Solyc02g070890.3在抗病番茄中均上調(diào)表達(dá)，Solyc02g068820.3在抗感番茄中均上調(diào)表達(dá)，激活下游WRKY25/33基因Solyc09g014990.4在抗病番茄中的表達(dá)。植物通過ETI防御機(jī)制特異的抵抗病原菌入侵，該通路中RPM1和RPS2是2個(gè)能與RIN4基因結(jié)合的R基因。當(dāng)RIN4被磷酸化時(shí)，與R基因結(jié)合，觸發(fā)HR反應(yīng)。蛋白激酶RPS5與PBS1結(jié)合，也可觸發(fā)免疫反應(yīng)[29]。本研究中，感病番茄接種青枯菌后，RPM1基因Solyc01g073985.1和PIK1基因Solyc06g075550.3上調(diào)表達(dá)。本研究初步探索了抗感番茄在接種青枯菌后的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)抗性涉及一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。

本研究轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)主要涉及AP2/ERF、bHLH、bZIP、Dof、MYB、NAC和WRKY等。這些TFs能激活下游生物脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高茄科作物青枯病抗性[31-40]。32個(gè)差異蛋白激酶主要為受體類激酶，其能通過磷酸化在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，從而提高茄科植物抗病性，如AhRLK1、CaCDPK15、CaLRR51和CaRop1等能夠與其他基因互作正/負(fù)調(diào)控植物青枯病抗性[41-43]。4個(gè)差異NBS基因分正/負(fù)調(diào)控。Deslandes等[44]克隆獲得了首個(gè)抗青枯病基因RRS1。另外，在擬南芥突變體SLH1中發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)編碼TIR-NBS-LRR-WRKY類抗病蛋白的基因RPS4。NBS類抗病基因AhRRS5通過多種信號途徑交聯(lián)參與煙草青枯病防御反應(yīng)[45]。Ben等[46]在苜蓿中發(fā)現(xiàn)青枯病抗性位點(diǎn)MtQRRS1，包括15個(gè)TIR/NBS類抗病基因。面對病原菌入侵，植物會(huì)通過激素信號分子激活抗病基因的表達(dá)。本研究植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及生長素、細(xì)胞分裂素(CTK)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)等通路，SA通路基因通過參與苯丙氨酸代謝過程正調(diào)控抗病性，而JA通路基因通過參與α-亞麻酸代謝負(fù)調(diào)控抗病性。Sánchez-Vallet等[47]和Lim等[48]報(bào)道ABA信號途徑參與植物抗病免疫，F(xiàn)rench等[10]也證明生長素信號途徑在番茄青枯病抗性上的重要性。

本研究其他次生代謝物和功能分子也能參與植物抗病過程。一些MYB可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來調(diào)控植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成，保護(hù)植物抵御生物脅迫，如AtMYB15調(diào)控?cái)M南芥防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化和基礎(chǔ)免疫[49]；AtMYB11組成表達(dá)增強(qiáng)了苯丙醇生物合成途徑中基因的表達(dá)，導(dǎo)致煙草和番茄植株中類黃酮和綠原酸的積累，AtMYB11和AtMYB12調(diào)控番茄和煙草中黃酮類化合物和咖啡?？鼘幩岬纳锖铣蒣50]；AtMYB46、AtMYB58和AtMYB63在次生壁形成過程中能夠激活木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵基因[51]。PpNAC1在苯丙氨酸生物合成和調(diào)控上發(fā)揮重要作用[52]。本研究篩選到的許多差異蛋白基因可能是構(gòu)成抗性的重要組分，有必要對其功能和作用機(jī)制進(jìn)一步解析。