史建磊,熊自立,蘇世聞,王克磊,宰文珊
(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院,浙江 溫州 325006;2.福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,福建 福州 350002)
青枯病是一種毀滅性的土傳維管束病害,又稱細(xì)菌性枯萎病,病原為青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum,Rs),具有明顯的生理分化和寄主多樣性。作為世界上最重要的植物病原細(xì)菌之一,青枯菌可從植物傷口或次生根的根冠侵入,一定條件下大量繁殖并快速傳播,破壞并阻塞維管束,影響水分運(yùn)輸,從而導(dǎo)致植株萎蔫死亡。該病主要發(fā)生在熱帶亞熱帶氣候濕潤、土壤呈酸性的地區(qū),在我國主要發(fā)生在長江流域及以南的廣大地區(qū),但受全球氣候變暖等的影響,有向北蔓延的趨勢,是造成多種作物減產(chǎn)、甚至絕收的主要原因,特別是對茄科作物番茄的危害尤為嚴(yán)重。番茄(Solanumlycopersicum)是全球重要蔬菜,但遺傳基礎(chǔ)狹窄,經(jīng)常受到各種病害的影響。由于連作重茬、土壤富集病菌和高溫高濕氣候,我國番茄產(chǎn)區(qū)青枯病日趨嚴(yán)重,已成為番茄生產(chǎn)的主要障礙。
隨著二代測序技術(shù)(Next generation sequencing,NGS)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)已成為研究基因表達(dá)變化和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效手段,為抗病候選基因的鑒定和分子標(biāo)記開發(fā)提供了基礎(chǔ)。目前,RNA-seq技術(shù)已在番茄多種生物或非生物脅迫研究中得到廣泛應(yīng)用[1-8]。關(guān)于青枯病響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄組鑒定,Ishihara等[9]利用基因芯片技術(shù)對莖刺法接種Rs的番茄莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)致病、激素信號和木質(zhì)素生物合成相關(guān)的140個(gè)基因在抗病番茄LS-89中上調(diào)表達(dá),β-1,3-葡聚糖酶基因尤為明顯;French等[10]對傷根法接種Rs的番茄根進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)抗病番茄Hawaii7996根部防御基因更早更強(qiáng)被激活,同時(shí)生長素信號途徑被抑制;Zuluaga等[11]對傷根法接種Rs的野生馬鈴薯根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,在抗感材料中分別發(fā)現(xiàn)221,644個(gè)差異表達(dá)基因,前者誘導(dǎo)產(chǎn)生大量新的轉(zhuǎn)錄本,后者激素相關(guān)基因更突出;Chen等[12]對傷根法接種Rs的茄子莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)抗病材料分別有1 137,9 048個(gè)基因上調(diào)或下調(diào)表達(dá),而感病材料對應(yīng)數(shù)目是6 087,5 832個(gè);謝冰等[13]葉轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),Y87作為砧木能夠提高接穗HD PAL活性和木質(zhì)素、多酚及病程相關(guān)蛋白等多種抗性基因表達(dá)量,從而提高煙草青枯病抗性。
面對各種病原微生物傷害,植物在漫長的進(jìn)化過程中形成了完善的自我保護(hù)機(jī)制,抗病基因(R基因)在識別和抵御病原菌入侵方面具有重要作用。盡管前人已在番茄青枯病響應(yīng)方面進(jìn)行了相關(guān)研究,但不同材料、不同接種方法、不同取樣部位等獲得的研究結(jié)果不盡一致,有必要拓展和豐富這一課題。
本研究利用高通量測序技術(shù)對傷根法接種Rs后的抗感番茄自交系地上部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)合基因功能注釋,挖掘青枯病響應(yīng)相關(guān)基因并進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,以期為候選基因抗源的有效利用提供理論指導(dǎo)。
番茄AH13112111為溫州農(nóng)業(yè)科學(xué)院番茄課題組2013年春從荷蘭瑞克斯旺公司引進(jìn)品種愛好與自育AH1雜交選育的高代自交系,黃色小果型,苗期人工接種鑒定為高抗青枯病;G149351121為以色列海澤拉公司同步引進(jìn)的品種3951與自育G14雜交選育的高代自交系,紅色普通型,對青枯病表現(xiàn)為高感。青枯菌株(生理小種1生化變種Ⅲ)從田間發(fā)病番茄植株上自行分離。
1.2.1 建庫與測序 番茄幼苗長到4~6片真葉時(shí)用傷根法接種青枯菌,接后48 h植株萎蔫前分別取幼嫩組織,錫箔紙包裹,立即置于液氮中,再放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆肹14]。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。參照植物TRIzol總RNA提取試劑盒(Sangon Biotech)說明書提取RNA。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA;加入Fragmentation Buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷;以mRNA為模板,用六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈,然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase Ⅰ合成第2條cDNA鏈,利用AMPure XP beads純化cDNA;純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭,然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇;最后通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫質(zhì)控合格后進(jìn)行Illumina轉(zhuǎn)錄組測序(Biomarker Technologies)。
1.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 去除原始數(shù)據(jù)中帶有接頭序列和低質(zhì)量的reads,得到Clean reads。計(jì)算Clean reads的Q30值和GC含量。從茄科基因組數(shù)據(jù)庫(Solanaceae Genomics Network,https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome)下載番茄參考基因組(ITAG4.0)的序列文件和注釋文件。使用HISAT2[15]進(jìn)行測序序列的比對。比對分析完成后利用StringTie[16]對符合要求的reads進(jìn)行組裝和定量?;谒x參考基因組序列,使用StringTie對mapped reads進(jìn)行拼接,并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較,尋找原來未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū),發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因。
1.2.3 差異基因篩選 以差異倍數(shù)(Fold Change,F(xiàn)C)≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,F(xiàn)DR)<0.01作為標(biāo)準(zhǔn),利用DESeq2[17]進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析,篩選差異表達(dá)基因。通過Blast比對工具,將測序基因與蛋白相鄰類聚簇?cái)?shù)據(jù)庫(Cluster of orthologous groups of proteins,COG)[18]、基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene ontology consortium,GO)[19]、東京基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)[20]、蛋白質(zhì)真核同源數(shù)據(jù)庫(Eukaryotic orthologous groups,KOG)[21]、非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-redundant protein datebase,NR)[22]、Pfam[23]和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss prot protein datebase,Swiss-Prot)[24]進(jìn)行序列比對,獲得基因的注釋信息。
1.2.4 基因定量驗(yàn)證 以SlRPL2為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物(表1)。RT-qPCR反應(yīng)體系包括2 μL cDNA,0.4 μL PCR primer,10 μL SYBR,7.2 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán),整體反應(yīng)在StepOne Plus型熒光定量PCR儀(ABI,F(xiàn)oster,CA,美國)中進(jìn)行,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,用最小顯著極差法(LSD)進(jìn)行多重比較和差異顯著性分析。
表1 部分RT-qPCR引物Tab.1 Part of the primers used for RT-qPCR
經(jīng)檢測,樣本RNA的OD260/280均為2.2,OD260/230≥1.8,28S/18S ≥2.0,RIN≥8,表明所提RNA滿足后續(xù)分析需求??垢蟹呀臃N前后12個(gè)樣本原始測序數(shù)據(jù)去除接頭序列和低質(zhì)量序列,共獲得75.02 Gb Clean reads,各樣本凈堿基數(shù)均不小于5.73 Gb,GC含量在43.27%~44.17%,Q30堿基百分比均超過了94%(表2)。將各樣本的Clean reads與指定參考基因組進(jìn)行序列比對,比對效率為95.00%~96.31%,且比對到唯一位置的reads均超過了90%(表3)?;诨虮磉_(dá)量,重復(fù)樣本間相關(guān)系數(shù)在0.947~0.993(表4),生物學(xué)重復(fù)良好。
表2 番茄各樣本RNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 RNA sequencing data statistics of tomato libraries
表3 番茄各樣本Clean reads與參考基因組比對Tab.3 Comparing Clean reads onto the reference genome in each tomato library
表4 生物學(xué)重復(fù)樣本的相關(guān)性Tab.4 Correlation between biological replicates
本研究測序共獲得35 371個(gè)基因,其中新基因1 296個(gè)。經(jīng)log2FC和FDR過濾,在抗感番茄中分別獲得970,695個(gè)DEGs,二者重復(fù)基因353個(gè),DEG總數(shù)1 312個(gè)(新基因32個(gè)),占基因總數(shù)的3.71%。其中,上調(diào)基因分別為457,450個(gè),重復(fù)214個(gè),總計(jì)693個(gè);下調(diào)基因分別為513,245個(gè),重復(fù)137個(gè),總計(jì)621個(gè)(表5)。2種材料接種后均上調(diào)或下調(diào)的基因分別為214,137個(gè);抗病材料上調(diào)而感病材料下調(diào)的基因數(shù)目是0,反之是2(Solyc04g074440.1和Solyc12g096780.2);抗病材料上調(diào)且感病材料不變的基因是198個(gè),反之是216個(gè);抗病材料下調(diào)且感病材料不變的基因是316個(gè),反之是104個(gè),后6種表達(dá)模式基因總數(shù)為836個(gè)(新基因18個(gè))(表6)。
表5 差異表達(dá)基因數(shù)目Tab.5 Number of differentially expressed genes
本研究注釋基因共31 903個(gè),注釋率為90.20%。其中,抗感番茄DEG在GO和KEGG等八大數(shù)據(jù)庫的注釋數(shù)目分別為951,687個(gè),注釋率均超過了98%;總注釋DEG是1 290個(gè),注釋率是98.32%。這些注釋基因包括4個(gè)NBS類抗病基因、6個(gè)植物-病原互作基因、11個(gè)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、22個(gè)防御反應(yīng)基因、32個(gè)蛋白激酶、65個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其他多個(gè)重要功能因子。
表6 差異表達(dá)基因的模式分布Tab.6 Pattern distribution of differentially expressed genes
1 312個(gè)DEGs GO注釋基因?yàn)?73個(gè),注釋率74.16%。將這些基因劃分成47個(gè)功能組,根據(jù)功能組的不同,又分為生物過程(Biological process,BP,19個(gè)亞類)、細(xì)胞組分(Cellular component,CC,15個(gè)亞類)和分子功能(Molecular function,MF,13個(gè)亞類)三大類(圖1)。在生物過程中,主要涉及代謝過程、細(xì)胞過程、單生物體過程、生物調(diào)控和刺激響應(yīng)等亞類;對于細(xì)胞組分,主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器、膜部分、細(xì)胞器部分和大分子復(fù)合物等亞類;結(jié)合催化活性在分子功能中非常顯著,其次是轉(zhuǎn)運(yùn)活性和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性,再次是電子載體活動(dòng)、抗氧化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和信號傳導(dǎo)活性。
1.代謝過程;2.細(xì)胞過程;3.單生物體過程;4.生物調(diào)控;5.刺激響應(yīng);6.定位;7.細(xì)胞組成與發(fā)生;8.信號;9.發(fā)育過程 ;10.多細(xì)胞生物體過程;11.生殖過程;12.生物群體過程;13.生長;14.繁殖;15.免疫系統(tǒng)過程;16.細(xì)胞死亡;17.節(jié)律過程;18.移動(dòng);19.生物粘附;20.細(xì)胞;21.細(xì)胞部分;22.膜;23.細(xì)胞器;24.膜部分;25.細(xì)胞器部分;26.大分子復(fù)合物;27.膜內(nèi)腔;28.胞間區(qū);29.細(xì)胞連接;30.共質(zhì)體;31.胞間區(qū)部分;32.顆粒;33.顆粒部分;34.類核;35.結(jié)合;36.催化活性;37.轉(zhuǎn)運(yùn)活性;38.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;39.結(jié)構(gòu)分子活性;40.電子載體活性;41.分子傳導(dǎo)活性;42.信號傳導(dǎo)活性;43.抗氧化活性;44.轉(zhuǎn)錄因子活性-蛋白結(jié)合;45.養(yǎng)分存儲活性;46.蛋白質(zhì)標(biāo)簽;47.金屬伴侶活性。
本研究209個(gè)(15.93%)DEGs被注釋到88個(gè)代謝通路中,分為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和生物系統(tǒng)五大類代謝途徑(圖2-A)。其中,植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成相關(guān)基因分別為16個(gè),淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因13個(gè),植病互作相關(guān)基因11個(gè),同時(shí)注釋還包括核酸、糖、脂肪、蛋白、萜類和黃酮類等的生物合成與代謝相關(guān)基因。依據(jù)q-value和富集因子大小,取前20個(gè)最顯著富集的代謝途徑(圖2-B),主要包括DNA復(fù)制(9個(gè)DEGs)、二萜合成(7個(gè)DEGs)、組氨酸代謝(6個(gè)DEGs)、苯丙烷生物合成(16個(gè)DEGs)、類固醇生物合成(5個(gè)DEGs)、類黃酮生物合成(6個(gè)DEGs)、萜類骨架合成(5個(gè)DEGs)、谷胱甘肽代謝(9個(gè)DEGs)。另外,植病互作(rank 38)、淀粉和蔗糖代謝(rank 46)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(rank 47)相關(guān)基因分別為11,13和16個(gè)。
圖2 差異表達(dá)基因KEGG注釋(A)與富集(B)Fig.2 KEGG annotation(A)and enrichment(B)of differentially expressed genes
植病互作通路在抗感番茄接種后顯著富集,抗病番茄KEGG分析該通路中有7個(gè)基因差異表達(dá),感病番茄該通路中有6個(gè)基因差異表達(dá),2個(gè)材料中共有差異表達(dá)基因11個(gè)(圖3)。該通路中抗病番茄接種后CNGCs(Solyc02g086980.3和Solyc05g050380.4)、EIX1/2(Solyc07g008620.1)、FLS2(Solyc02g031790.3、Solyc02g068820.3和Solyc02g070890.3)和WRKY25/33(Solyc09g014990.4)上調(diào)表達(dá);感病番茄接種后CaM/CML(Solyc04g058170.1)、FLS2(Solyc02g068820.3)、PIK1(Solyc06g075550.3)和RPM1(Solyc01g073985.1)上調(diào)表達(dá),CNGCs(Solyc05g050380.4和Solyc09g007840.3)既有上調(diào)表達(dá)又有下調(diào)表達(dá)。
圖3 植病互作通路差異表達(dá)基因KEGG富集Fig.3 KEGG enrichment of differentially expressed genes in the plant-pathogen interaction pathway
基于基因功能注釋,選取74個(gè)DEGs進(jìn)行啟動(dòng)子分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因啟動(dòng)子主要包括轉(zhuǎn)錄起始(TATA-box和CAAT-box)、防御與脅迫(W box、TC-rich repeats和AT-rich sequence)、干旱(MBS)和低溫(LTR)、MeJA(CGTCA-motif和TGACG-motif)、ABA(ABRE)、SA(TCA-element)、GA(TATC-box、Pbox和GARE-motif)和AUX(TGA-element、TGA-box、AuxRR-core和AuxRE)、光響應(yīng)及厭氧誘導(dǎo)等元件(圖4)。其中,29個(gè)DEGs含42個(gè)防御與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。
選取上述50個(gè)DEGs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。與轉(zhuǎn)錄組測序相比,28個(gè)基因青枯菌接種前后的表達(dá)變化趨勢一致,結(jié)合差異顯著性分析,11個(gè)基因表達(dá)調(diào)控模式一致,其中6個(gè)基因完全一致(圖5)。番茄接種青枯菌后,Solyc02g086980.3和Solyc04g011670.3在不同材料中相對表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01),抗病材料中分別提高2.62,2.36倍,感病材料分別提高1.06,1.34倍,為正調(diào)控基因;其他4個(gè)基因(Solyc01g073985.1、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1)表達(dá)量在感病材料中極顯著上調(diào)(P<0.01),分別提高1.16,1.19,1.63,0.87倍,但在抗病材料中變化不顯著(P>0.05),為負(fù)調(diào)控基因。推測Solyc02g086980.3和Solyc04g011670.3可能參與抗病反應(yīng),Solyc01g073985.1、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1可能參與感病反應(yīng)。
A.已知基因;B.新基因。A.Known genes;B.New genes.
番茄青枯病是由青枯菌引起的一種土傳維管束病害,獲得抗病相關(guān)基因并理解其作用機(jī)制非常重要,而RNA-seq技術(shù)為這一問題的解決提供了有效途徑。本研究測序共獲得35 371個(gè)基因,其中1 296個(gè)新基因,1 312個(gè)DEGs,836個(gè)材料特異DEGs,并對其進(jìn)行了功能注釋和RT-qPCR驗(yàn)證,這為目的基因篩選、功能驗(yàn)證和相關(guān)機(jī)制解析提供了基礎(chǔ)。
本研究測序共獲得75.02 Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù),各樣本均達(dá)到5.73 Gb,Q30堿基占比均大于94%,過濾數(shù)據(jù)與番茄參考基因組比對率均不小于95%,說明樣品不存在污染且參考基因組選擇合適,所有樣本測序質(zhì)量良好,數(shù)據(jù)可靠,可用于后續(xù)分析。獲得的35 371個(gè)基因中注釋基因數(shù)目是31 903個(gè),略多于Heinz 1706的測序基因數(shù)30 855個(gè)[25],可能源自材料的不同和技術(shù)手段的改進(jìn)?;谒x參考基因組序列,共發(fā)掘到1 296個(gè)新基因,說明RNA-seq技術(shù)在新基因挖掘上的可行性。生物學(xué)重復(fù)可有效消除基因表達(dá)在不同個(gè)體間的可變性,本研究重復(fù)樣本皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.9,表明生物學(xué)重復(fù)良好??垢蟹呀臃N前后DEG數(shù)目多于Ishihara等[9]的鑒定結(jié)果,但少于French等[10]的鑒定結(jié)果,主要?dú)w因于接種方法、取樣部位和基因表達(dá)計(jì)算的不同。有研究表明,地上部早期對青枯病的防御反應(yīng)遠(yuǎn)沒有地下部強(qiáng)烈,但萎蔫病癥出現(xiàn)后卻有大量基因差異表達(dá)[26]??共》袲EG要多于感病番茄,尤其是下調(diào)基因,說明抗病性主要與病菌侵染后某些基因下調(diào)表達(dá)有關(guān)。不同材料間DEG數(shù)目少于接種前后的1 312個(gè),說明差異表達(dá)主要來自接種。感病番茄接種前后DEG少于接種前抗感材料間的DEG,且不同材料接種后DEG變少,說明感病番茄對青枯菌侵染的響應(yīng)不如抗病番茄劇烈,這和前人研究結(jié)果一致[9-10]??垢胁牧咸禺惐磉_(dá)的836個(gè)DEGs可作為病害響應(yīng)基因和候選目的基因的篩選基礎(chǔ)。
R和S分別表示抗病和感病番茄。不同大小寫字母分別表示0.01和0.05水平下的差異顯著性。R and S represent resistant and susceptible tomato lines,respectively.Different upper and lowercase letters indicate statistically significant differences at the 0.01 and 0.05 level,respectively.
本研究通過抗感材料轉(zhuǎn)錄組分析表明,病菌侵染會(huì)啟動(dòng)植物相關(guān)基因的表達(dá)及多條代謝通路。對這些DEG進(jìn)行GO富集分析,抗病反應(yīng)主要發(fā)生在膜和細(xì)胞內(nèi)部,同時(shí)也發(fā)生在細(xì)胞連接和細(xì)胞外部區(qū)域等部位,通過調(diào)節(jié)催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性以及抗氧化活性等分子功能,引起以細(xì)胞過程、代謝過程、單生物體過程和生物調(diào)控為主,定位、刺激響應(yīng)、細(xì)胞成分組成、信號、免疫系統(tǒng)過程等一系列生物過程的協(xié)同變化,抵抗病原菌的入侵。通過KEGG分析表明,DEG在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、DNA復(fù)制、嘧啶代謝、嘌呤代謝、植病互作、谷胱甘肽代謝、苯丙烷生物合成、氨基酸合成代謝、玉米素生物合成、泛素化蛋白水解、類黃酮生物合成、萜類物質(zhì)合成、異喹啉生物堿生物合成、芪類化合物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、內(nèi)吞作用、角質(zhì)蠟質(zhì)生物合成、油菜素甾醇生物合成、VB1/6和VC代謝和生理節(jié)律等多個(gè)代謝通路富集,說明這些代謝基因可能參與了抗病調(diào)控。本研究選取番茄幼苗地上部進(jìn)行分析,其對青枯病的防御反應(yīng)既與地下部部分重疊,又具有自身獨(dú)特的代謝途徑[10]。
基于基因功能注釋,50個(gè)DEGs用來RT-qPCR驗(yàn)證(這些基因普遍具有轉(zhuǎn)錄起始和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件),結(jié)果發(fā)現(xiàn),28個(gè)基因在番茄接種青枯菌前后表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。推測Solyc02g086980.3和Solyc04g011670.3可能參與抗病反應(yīng),Solyc01g073985.1、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1可能參與感病反應(yīng)。2種策略的相關(guān)性不強(qiáng),基因表達(dá)結(jié)果不完全一致,主要?dú)w因于計(jì)算原理和表示方法的不同。本研究結(jié)合2種方法和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),篩選到6個(gè)病害響應(yīng)基因?;虮磉_(dá)受植物生長發(fā)育與環(huán)境脅迫響應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控,一方面通過R基因的過量表達(dá)抵御外界不良刺激,另一方面通過非編碼RNA調(diào)控和可變剪接等降低基因表達(dá)量[27]。然而,本研究也發(fā)現(xiàn)多個(gè)感病基因(S基因),與R基因堆疊相比,破壞單個(gè)S基因是實(shí)現(xiàn)作物廣譜和持久抗性的更有效策略[28]。
上述這些物質(zhì)有些可能對抗性有直接影響,有些則可能進(jìn)一步形成抗性物質(zhì)。其中植物-病原互作代謝通路包括PTI(Pattern-triggered immunity)和ETI(Effector-triggered immunity),當(dāng)植物受到胞外病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)刺激時(shí),Ca2+濃度增加,激活鈣離子蛋白激酶(CDPK)和鈣調(diào)蛋白(CaM/CML),將信號傳導(dǎo)至NADPH氧化酶活性氧中間體(RBOH)和一氧化氮合成酶(NOS),激活活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生,誘導(dǎo)超敏反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)、細(xì)胞壁加固和氣孔關(guān)閉[29]。當(dāng)細(xì)菌鞭毛蛋白被受體激酶(FLS2)識別,通過胞吞作用將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi),激活下游的絲裂原活化蛋白激酶(MEKK)MKK1/MKK2→MPK4或MKK4/MKK5→MPK3MPK6。信號傳入細(xì)胞核后,WRKY22/29激活防御基因或WRKY25/33抑制相關(guān)基因[30]。本研究中,環(huán)腺苷酸門控通道(CNGCs)基因Solyc02g086980.3在抗病番茄接種后上調(diào)表達(dá),Solyc05g050380.4在抗感番茄中均上調(diào),Solyc09g007840.3在感病番茄中下調(diào)表達(dá),Ca2+濃度發(fā)生變化,激活CaM/CML基因Solyc04g058170.1在感病番茄中的表達(dá)。青枯菌侵染后,F(xiàn)LS2基因Solyc02g031790.3和Solyc02g070890.3在抗病番茄中均上調(diào)表達(dá),Solyc02g068820.3在抗感番茄中均上調(diào)表達(dá),激活下游WRKY25/33基因Solyc09g014990.4在抗病番茄中的表達(dá)。植物通過ETI防御機(jī)制特異的抵抗病原菌入侵,該通路中RPM1和RPS2是2個(gè)能與RIN4基因結(jié)合的R基因。當(dāng)RIN4被磷酸化時(shí),與R基因結(jié)合,觸發(fā)HR反應(yīng)。蛋白激酶RPS5與PBS1結(jié)合,也可觸發(fā)免疫反應(yīng)[29]。本研究中,感病番茄接種青枯菌后,RPM1基因Solyc01g073985.1和PIK1基因Solyc06g075550.3上調(diào)表達(dá)。本研究初步探索了抗感番茄在接種青枯菌后的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)相關(guān)抗性涉及一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。
本研究轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)主要涉及AP2/ERF、bHLH、bZIP、Dof、MYB、NAC和WRKY等。這些TFs能激活下游生物脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá),從而提高茄科作物青枯病抗性[31-40]。32個(gè)差異蛋白激酶主要為受體類激酶,其能通過磷酸化在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用,從而提高茄科植物抗病性,如AhRLK1、CaCDPK15、CaLRR51和CaRop1等能夠與其他基因互作正/負(fù)調(diào)控植物青枯病抗性[41-43]。4個(gè)差異NBS基因分正/負(fù)調(diào)控。Deslandes等[44]克隆獲得了首個(gè)抗青枯病基因RRS1。另外,在擬南芥突變體SLH1中發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)編碼TIR-NBS-LRR-WRKY類抗病蛋白的基因RPS4。NBS類抗病基因AhRRS5通過多種信號途徑交聯(lián)參與煙草青枯病防御反應(yīng)[45]。Ben等[46]在苜蓿中發(fā)現(xiàn)青枯病抗性位點(diǎn)MtQRRS1,包括15個(gè)TIR/NBS類抗病基因。面對病原菌入侵,植物會(huì)通過激素信號分子激活抗病基因的表達(dá)。本研究植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及生長素、細(xì)胞分裂素(CTK)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)等通路,SA通路基因通過參與苯丙氨酸代謝過程正調(diào)控抗病性,而JA通路基因通過參與α-亞麻酸代謝負(fù)調(diào)控抗病性。Sánchez-Vallet等[47]和Lim等[48]報(bào)道ABA信號途徑參與植物抗病免疫,F(xiàn)rench等[10]也證明生長素信號途徑在番茄青枯病抗性上的重要性。
本研究其他次生代謝物和功能分子也能參與植物抗病過程。一些MYB可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來調(diào)控植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成,保護(hù)植物抵御生物脅迫,如AtMYB15調(diào)控?cái)M南芥防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化和基礎(chǔ)免疫[49];AtMYB11組成表達(dá)增強(qiáng)了苯丙醇生物合成途徑中基因的表達(dá),導(dǎo)致煙草和番茄植株中類黃酮和綠原酸的積累,AtMYB11和AtMYB12調(diào)控番茄和煙草中黃酮類化合物和咖啡??鼘幩岬纳锖铣蒣50];AtMYB46、AtMYB58和AtMYB63在次生壁形成過程中能夠激活木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵基因[51]。PpNAC1在苯丙氨酸生物合成和調(diào)控上發(fā)揮重要作用[52]。本研究篩選到的許多差異蛋白基因可能是構(gòu)成抗性的重要組分,有必要對其功能和作用機(jī)制進(jìn)一步解析。