韓曉勇，蔣 璐，殷劍美，金 林，張培通

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

炭疽病是為害山藥最為嚴(yán)重的病害之一，如果未及時(shí)有效控制，其損失可達(dá)80%以上，甚至絕收，嚴(yán)重制約著山藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。山藥炭疽病主要為害山藥葉片，也可為害莖蔓，其病癥狀復(fù)雜，一般先從植株下部開始發(fā)病?；瘜W(xué)藥劑是防治山藥炭疽病的主要手段，但易帶來(lái)環(huán)境污染、生態(tài)失衡及食品安全等問(wèn)題，而且頻繁使用農(nóng)藥可能會(huì)導(dǎo)致致病菌株變異，出現(xiàn)致病性更強(qiáng)的毒株[1]。培育抗炭疽病的山藥品種是控制田間山藥病害最有效和理想的方法，但山藥以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主，存在生理限制。盡管通過(guò)常規(guī)育種在培育抗炭疽病雜交種方面取得了一些進(jìn)展[2]，但進(jìn)展仍然緩慢。傳統(tǒng)技術(shù)和分子技術(shù)的結(jié)合將是開發(fā)具有穩(wěn)定抗性山藥品種的更好方法，以保護(hù)山藥免受廣譜真菌病原體的侵害，從而改善山藥品質(zhì)。近年來(lái)，基因組學(xué)輔助育種(GAB，Genome-assisted breeding)已成為一種強(qiáng)有力的植物育種策略，它將基因組學(xué)與高通量表型分析相結(jié)合，以改良作物[3]。

炭疽病抗性基因的挖掘及分子標(biāo)記輔助選擇，是培育山藥廣譜、高效和穩(wěn)定的抗病品種的重要途徑。通過(guò)對(duì)易感基因型(TDa95/0310)和2種炭疽病抗性山藥基因型(TDa87/01091和TDa95/0328)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，TDa95/0328和TDa87/01091分別有115，180個(gè)高表達(dá)的EST，它們與碳水化合物代謝、細(xì)胞壁生物合成、脂質(zhì)和氨基酸代謝、次生和激素代謝、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)合成以及多種病程相關(guān)信號(hào)蛋白和宿主防御相關(guān)基因有關(guān)[4-5]。Upadhyaya等[6]利用14 739個(gè)SNP標(biāo)記定位到了8個(gè)與高粱抗炭疽病有關(guān)的位點(diǎn)。Yang等[7]通過(guò)圖位克隆的方法從苜蓿中克隆獲得RCT1基因，該基因?qū)儆赥IR-NBS-LRR類基因，將RCT1轉(zhuǎn)化到對(duì)炭疽病敏感的苜蓿植株中后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)炭疽病的廣譜抗性。采用同源克隆和RT-PCR方法，從草莓久香克隆到FaNBS20全長(zhǎng)cDNA序列，草莓抗炭疽病品種甜查理接種草莓炭疽病菌后，F(xiàn)aNBS20的表達(dá)水平顯著提高，而在感病品種久香FaNBS20的表達(dá)則一直處于較低水平，表明該基因可能與炭疽病的抗性相關(guān)[8]。編碼ABA-響應(yīng)蛋白、亮氨酸富集蛋白、黃酮-3-羥化酶及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的基因在抗炭疽病高粱植株內(nèi)被明顯誘導(dǎo)表達(dá)但在易感植株內(nèi)幾乎檢測(cè)不到，表明這些基因在植株抗炭疽病方面可能發(fā)揮著非常重要的作用[9]。目前，利用RNA-seq技術(shù)挖掘山藥炭疽病抗性基因尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)利用RNA-seq技術(shù)分析不同時(shí)期高抗和高感品種的山藥葉片受炭疽菌侵染后的基因表達(dá)變化，挖掘山藥參與炭疽病抗性相關(guān)基因，對(duì)關(guān)鍵抗性基因進(jìn)行表達(dá)分析，構(gòu)建山藥響應(yīng)炭疽病侵染的分子途徑，旨在為揭示山藥抗炭疽病的分子機(jī)制，培育山藥廣譜、高效和穩(wěn)定的抗病品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

試驗(yàn)于2019—2021年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料及處理

1.1.1 試驗(yàn)材料 膠孢炭疽菌菌株4-2由筆者保存于本實(shí)驗(yàn)室。山藥品種蘇蕷8號(hào)，是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用浙江省臺(tái)州市地方紫山藥品種臺(tái)州紫山藥經(jīng)系統(tǒng)選育的高感炭疽病品系024，組培誘變所形成的品種，其薯形好，產(chǎn)量高，高抗炭疽病。用于差異基因表達(dá)分析的高感品系024和江西短紫山藥、高抗品種蘇蕷8號(hào)和蘇蕷6號(hào)、中抗品種紅河山藥均種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京市六合試驗(yàn)基地。當(dāng)年繁殖的蘇蕷8號(hào)和品系024的種薯，次年用作接種材料。

1.1.2 試驗(yàn)處理 選取蘇蕷8號(hào)和品系024的健康、無(wú)病、大小一致的種薯，播種于鋪滿基質(zhì)的花盆中，置于恒溫恒濕的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。待植株長(zhǎng)至5～6葉期，用2 mm左右接種針針刺展開葉葉片，將PDA平板培養(yǎng)7 d后的菌株用無(wú)菌水配制成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，均勻噴霧于植株葉片并遮防護(hù)罩保濕，24 h后摘罩。為防止誤差，每片葉針刺2孔，葉片正面和背面分別噴霧2次孢子懸浮液。收集蘇蕷8號(hào)接種0，24，48，72，96 h(R0h、R24h、R48h、R72h、R96h)，品系024接種24，48，72，96 h(S24h、S48h、S72h、S96h)的葉片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。每個(gè)樣品為3～5片葉的混合樣，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 RNA-seq測(cè)序及原始數(shù)據(jù)處理、分析

基于Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Raw Data或Raw Reads)，用Sanger質(zhì)量值Q來(lái)評(píng)估原始數(shù)據(jù)的測(cè)序質(zhì)量，獲得Clean data。經(jīng)De novo組裝后，獲得山藥的Unigene庫(kù)。

1.3 差異基因的篩選和功能注釋

采用Bowtie 2將測(cè)序得到的Reads與Unigene庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，結(jié)合RSEM進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM值計(jì)算各樣品中每個(gè)基因的表達(dá)量。采用DESeq 2軟件進(jìn)行2組樣品間的差異表達(dá)分析，將|Fold Change|≥4且 FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。篩選獲得的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析，以P<0.05為閾值。

1.4 Q-PCR驗(yàn)證

選取3個(gè)差異表達(dá)基因，利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參(表1)，用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同批次采集樣品的cDNA為模板進(jìn)行Q-PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，按照2-ΔΔCt算法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 差異基因表達(dá)分析

在炭疽病發(fā)病盛期，分別取品系024、江西短紫山藥、蘇蕷8號(hào)、蘇蕷6號(hào)和紅河山藥的3～5片展開葉，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。每個(gè)品種3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，其中，品系024和江西短紫山藥的感病葉和健康葉分別進(jìn)行取樣保存。

表1 Q-PCR基因及引物Tab.1 The genes and primers used for Q-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

去除含有接頭的、重復(fù)的、質(zhì)量低的片段，9個(gè)樣品獲得Clean reads 在18 538 496～20 504 603條(表2)。各樣品Clean data均達(dá)到5 561 548 900 bp及以上，GC含量均高于44%，N堿基含量均為0，Q30堿基百分比均在90%以上，表明各樣品測(cè)序所得Clean data的堿基組成基本平衡且大部分reads的堿基質(zhì)量值大于30，符合質(zhì)量錯(cuò)誤率低于1%的要求。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好，數(shù)據(jù)可靠。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 The statistics of transcriptome sequencing data

2.2 差異表達(dá)基因分析

建立抗病品種接種不同時(shí)間差異基因集，同時(shí)建立接種相同時(shí)間的抗感病品種差異基因集，選擇共同差異表達(dá)的基因，結(jié)果表明(圖1)：抗感品種間與抗病品種內(nèi)接種72，96 h差異表達(dá)的基因數(shù)最多，分別為3 814，1 630個(gè)。差異表達(dá)基因韋恩圖結(jié)果表明(圖2)，接種24，48，72，96 h差異表達(dá)的基因個(gè)數(shù)分別為197，132，187，313個(gè)，去除各接種時(shí)間點(diǎn)共同差異表達(dá)的基因數(shù)，共獲得711個(gè)差異表達(dá)的基因。

圖1 各樣本間差異表達(dá)基因數(shù)Fig.1 The statistics of differentially expressed genes between samples

A—D.分別為接種24,48,72,96 h差異表達(dá)基因韋恩圖；E.接種24，48，72，96 h共同差異表達(dá)基因韋恩圖。A—D.Venn map of differentially expressed genes after inoculation 24,48,72,96 h,respectively；E.Venn map of common differentially expressed genes after inoculation 24,48,72,96 h.

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

差異表達(dá)的基因GO功能分類結(jié)果表明：有666個(gè)基因被注釋，分為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類和50個(gè)亞類(圖3)，其中生物過(guò)程包含20個(gè)亞類，基因數(shù)最多的5個(gè)亞類依次是細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、單組織過(guò)程、刺激響應(yīng)和生物調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分包含15個(gè)亞類，基因數(shù)最多的2個(gè)亞類是細(xì)胞和細(xì)胞部分；分子功能包含15個(gè)亞類，基因數(shù)最多的2個(gè)亞類是結(jié)合和催化活性。差異表達(dá)基因GO功能分類基因數(shù)占比與背景基因GO功能分類基因數(shù)占比趨勢(shì)基本一致。

BP.生物過(guò)程：BP1.細(xì)胞過(guò)程；BP2.代謝過(guò)程；BP3.單組織過(guò)程；BP4.刺激響應(yīng)；BP5.生物調(diào)節(jié)；BP6.定位；BP7.細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生；BP8.發(fā)展過(guò)程；BP9.信號(hào)；BP10.多細(xì)胞生物過(guò)程；BP11.生殖；BP12.生殖過(guò)程；BP13.多組織過(guò)程；BP14.免疫系統(tǒng)過(guò)程；BP15.生長(zhǎng)；BP16.脫毒；BP17.節(jié)律過(guò)程；BP18.運(yùn)動(dòng)；BP19.細(xì)胞殺傷；BP20.生物附著。CC.細(xì)胞組分：CC1.細(xì)胞；CC2.細(xì)胞部分；CC3.細(xì)胞器；CC4.膜；CC5.細(xì)胞器部分；CC6.膜部分；CC7.大分子復(fù)合物；CC8.胞外區(qū)；CC9.膜包圍腔；CC10.細(xì)胞連接；CC11.超分子復(fù)合物；CC12.胞外區(qū)部分；CC13.擬核；CC14.其他生物體；CC15.其他生物體部分。MF.分子功能：MF1.結(jié)合；MF2.催化活性；MF3.轉(zhuǎn)運(yùn)活性；MF4.結(jié)構(gòu)分子活性；MF5.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；MF6.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；MF7.分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；MF8.分子功能調(diào)節(jié)器；MF9.電子載體活性；MF10.抗氧化活性；MF11.營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性；MF12.轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合；MF13.金屬伴侶蛋白活性；MF14.翻譯調(diào)節(jié)活；MF15.蛋白標(biāo)簽。

GO功能顯著性富集分析表明(圖4)，富集于生物過(guò)程途徑的基因數(shù)最多，為116個(gè)，其中顯著富集于響應(yīng)生物刺激(GO：0050896)和應(yīng)激反應(yīng)(GO：00006950)terms的基因數(shù)分別為63，44個(gè)；其次是富集于分子功能途徑的基因，為79個(gè)；富集于細(xì)胞組分的基因數(shù)最少，為31個(gè)。前20條顯著富集的terms中(圖5)，4個(gè)差異基因富集于生物刺激響應(yīng)term，且富集程度最高；防衛(wèi)反應(yīng)term富集基因數(shù)最多，為13個(gè)；此外，有些基因富集于細(xì)胞壁修飾、氧化還原過(guò)程和催化酶活性，這些基因可能均與植物抗病有關(guān)。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行了功能富集分類和Pathway注釋(圖6)：有40個(gè)基因富集于31條信號(hào)通路，其中23條參與代謝途徑，3條參與遺傳信息處理，分別有2條參與環(huán)境信息處理和細(xì)胞進(jìn)程，1條參與有機(jī)體系統(tǒng)。糖酵解/糖異生代謝途徑富集的基因數(shù)最多，為6個(gè)，其次是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化途徑，均為5個(gè)。

圖6 差異表達(dá)基因KEGG富集分類Fig.6 KEGG enrichment classification of the differentially expressed genes

對(duì)所有富集的KEGG Pathway進(jìn)行篩選，共獲得10條顯著富集的 Pathway(表3)。其中5條涉及糖代謝途徑，分別是戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生、半乳糖代謝、淀粉與蔗糖代謝和磷酸戊糖途徑；2條涉及次生代謝產(chǎn)物途徑，分別是類固醇生物合成途徑和托烷、哌啶、吡啶生物堿合成途徑；分別有1條涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、甘油酯代謝和生物素代謝途徑。

2.5 山藥響應(yīng)炭疽菌侵染差異表達(dá)基因分類

結(jié)合KEGG富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)一步按功能進(jìn)行分類，主要集中在糖代謝、植物與病原互作、激素代謝、次生代謝等途徑。

2.5.1 淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因表達(dá)分析 在炭疽菌侵染24 h，與蔗糖分解有關(guān)的β-呋喃果糖苷酶(INV)和α-磷酸海藻糖合酶(TPS)、與淀粉合成有關(guān)的果糖1，6-二磷酸醛縮酶(FBA-Ⅱ)和磷酸葡糖變位酶(PGM)均上調(diào)表達(dá)；與淀粉分解有關(guān)的α-淀粉酶(Ams)下調(diào)表達(dá)(圖7-A)。

2.5.2 植物與病原互作途徑相關(guān)基因表達(dá)分析 在炭疽菌侵染24 h，多個(gè)病程相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)(圖7-B)，包括PR1(AOPR1、ACPR1)、PR2(β-1-3-葡聚糖酶，ACPR2、MCPR2、SIPR2)、PR4(幾丁質(zhì)酶，DBPR4)、PR6(蛋白酶抑制劑，PARR-6、CCPR-6)和PDPR10(海棗核糖核酸酶)，而PR5(甜味蛋白)和ACPR-10(菠蘿核糖核酸酶)上調(diào)表達(dá)；NB-ARC類抗病基因(At1g61310)和NBS-LRR類抗病基因(At4g27220、TW65_03605、TW65_04322、BRADI_1g47610v3、At4g36180、FLS2、EIX2)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá)，其中EIX2在炭疽菌侵染96 h時(shí)，表達(dá)量最高。參與植物防衛(wèi)反應(yīng)的4個(gè)熱擊蛋白(HSP12、HSP88、HSP90、HSP70)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá)，其中HSP12和HSP88在炭疽菌侵染24 h表達(dá)量最高，而HSP90和HSP70在炭疽菌侵染48 h表達(dá)量最高；過(guò)氧化氫酶(CAT2)和線粒體超氧物歧化酶(MSD1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(AOGST)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)。

表3 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路Tab.3 KEGG pathways significantly enriched of differentially expressed genes

A.植物與病原互作；B.淀粉和蔗糖代謝；C.激素類；D.轉(zhuǎn)錄因子；E.次生代謝。A.Plant-phytopathogen interaction；B.Starch and sucrose metabolism；C.Hormones；D.Transcription factors；E.Secondary metabolism.

富含脯氨酸的伸展素類受體蛋白激酶(AtPERK2、SIPERK2、PERK8、PERK14)，LRR類受體蛋白激酶(At1g53430、LRK10)，凝集素受體激酶(HSL1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高，受體相互作用蛋白激酶(RIPK)，溶解素基序型激酶(LYK5)，凝集素受體激酶(B120)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)；細(xì)胞壁蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP19)和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(SHA1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞壁修飾的擴(kuò)展蛋白(EXLB1)、細(xì)胞壁降解相關(guān)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XTH22)，超敏相關(guān)蛋白(HSR4)和植物Remorin蛋白(REM)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)。

2.5.3 激素相關(guān)基因的表達(dá)分析 在炭疽菌侵染過(guò)程中，多個(gè)與防御相關(guān)的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中基因表現(xiàn)出差異，其中生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起主導(dǎo)作用。1個(gè)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸載體(LAX4)、4個(gè)生長(zhǎng)素早期響應(yīng)蛋白(IAA4、IAA21、SAUR36、SAUR71)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高；赤霉素調(diào)節(jié)蛋白(GAGA14、GASA2)在炭疽菌侵染24 h分別上調(diào)或下調(diào)表達(dá)；茉莉酸合成關(guān)鍵酶基因12-氧代植二烯酸還原酶(OPR1)和脫落酸合成關(guān)鍵酶基因9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá)，乙烯響應(yīng)因子(ERF036)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)(圖7-C)。

2.5.4 轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子在抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要調(diào)控作用。在炭疽菌侵染24 h，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子(WRKY48)、GATA類轉(zhuǎn)錄因子(GATA12)、HD-ZIP類轉(zhuǎn)錄因子(HOX11)、bHLH-MYC(RSS3)和鋅指蛋白基因(ZFP7)均上調(diào)表達(dá)，DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB1C)在炭疽菌侵染48 h上調(diào)表達(dá)。DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB1G)、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子(WRKY75)、MYB類轉(zhuǎn)錄因子(MYB108)和TIFY類轉(zhuǎn)錄因子(TIFY10C)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)(圖7-D)。

2.5.5 次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的表達(dá)分析 次生代謝產(chǎn)物作為生活壁壘可以直接參與植物的防御反應(yīng)，也可以作為信號(hào)物質(zhì)參與植物抗病反應(yīng)。細(xì)胞色素P450基因(CYP94A1-like、CYP78A3、CYP51)、泛素化連接酶(UBE2、UBE3)、防御素(SD2)、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素(CBL1)、木菠蘿凝集素(JRL5)、甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(BRADI_1g76020v3)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)，其中，CYP94A1-like、CYP78A3分別在炭疽菌侵染72，96 h表達(dá)量最高，細(xì)胞色素P450基因(CYP78A5-like)在炭疽菌侵染72 h上調(diào)表達(dá)；參與木質(zhì)素合成的導(dǎo)體蛋白(DIR4)和咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)受炭疽菌侵染后下調(diào)表達(dá)(圖7-E)。

2.6 差異表達(dá)基因的Q-PCR驗(yàn)證

根據(jù)差異基因富集情況，選擇了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中與生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)的基因，通過(guò)Q-PCR檢測(cè)其表達(dá)水平。結(jié)果表明(圖8)：LAX4、IAA4、IAA21在接種24 h上調(diào)表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因表達(dá)變化趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是可靠的。

圖8 差異表達(dá)基因Q-PCR驗(yàn)證Fig.8 Q-PCR verification of differentially expressed genes

2.7 差異表達(dá)基因的Q-PCR表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證差異基因炭疽病抗性，選擇炭疽病高感品系024和江西短紫山藥、高抗品種蘇蕷8號(hào)和蘇蕷6號(hào)、中抗品種紅河山藥，進(jìn)行Q-PCR分析，其中品系024和江西短紫山藥分別對(duì)感病葉和健康葉進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明(圖9)：IAA4、LAX4和IAA21抗病品種表達(dá)量顯著高于感病品種，其中，LAX4和IAA21在蘇蕷8號(hào)的表達(dá)量顯著高于蘇蕷6號(hào)和紅河山藥；IAA4在蘇蕷6號(hào)的表達(dá)量顯著高于其他品種，在蘇蕷8號(hào)和紅河山藥表達(dá)量無(wú)顯著差異。除IAA21江西短紫山藥健康葉表達(dá)量顯著高于感病葉外，IAA4和LAX4在感病葉和健康葉表達(dá)量無(wú)顯著差異，即健康葉不一定健康。

024-S、 024-R、 JXD-S、JXD-R、Su8-R、Su6-R、HH-R分別表示品系024感病葉、健康葉，江西短紫山藥感病葉、健康葉，蘇蕷8號(hào)、蘇蕷6號(hào)和紅河山藥。024-S, 024-R, JXD-S, JXD-R, Su8-R, Su6-R, HH-R show strain 024 susceptible leaf and healthy leaf,Jiangxi yam susceptible leaf and healthy leaf, Suyu 8, Suyu 6 and Honghe yam.

3 結(jié)論與討論

3.1 淀粉代謝參與山藥炭疽病抗性

淀粉代謝異常是植物染病后的主要生理變化之一，通常與淀粉合成有關(guān)的酶基因上調(diào)表達(dá)，地上部出現(xiàn)淀粉積累，地下部發(fā)生淀粉欠缺問(wèn)題[10-11]。蔗糖合酶催化蔗糖降解，是蔗糖向淀粉轉(zhuǎn)化的第一步[12]。炭疽菌侵染24 h，蘇蕷8號(hào)葉片與蔗糖分解有關(guān)的β-呋喃果糖苷酶(INV)和α-磷酸海藻糖合酶(TPS)、與淀粉合成有關(guān)的果糖1，6-二磷酸醛縮酶(FBA-Ⅱ)和磷酸葡糖變位酶(PGM)均上調(diào)表達(dá)，而與淀粉分解有關(guān)的α-淀粉酶下調(diào)表達(dá)(Ams)，即山藥受炭疽菌侵染后，蘇蕷8號(hào)葉片較品系024出現(xiàn)更多的淀粉積累可能。

3.2 防衛(wèi)基因介導(dǎo)山藥炭疽病抗性

植物在受到病原物侵染時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生的防衛(wèi)基因表達(dá)來(lái)拮抗，防衛(wèi)基因按功能劃分，主要分為4類[13]：①病程相關(guān)蛋白基因，編碼PR蛋白；②細(xì)胞壁修飾有關(guān)基因，編碼細(xì)胞壁中富含羥脯氨酸的糖蛋白，過(guò)氧化物酶及硫堇等；③清除活性氧(ROS)的防衛(wèi)酶基因，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等；④次生物質(zhì)合成基因，編碼植保素及木質(zhì)素等生物合成所需的酶。不同類別的病程相關(guān)蛋白在炭疽病侵染后表達(dá)情況不同。NB-ARC類抗病基因、NBS-LRR類抗病基因和熱擊蛋白在炭疽菌侵染24 h全部上調(diào)表達(dá)，而在11個(gè)病程蛋白中，只有PR5和ACPR10上調(diào)表達(dá)、9個(gè)受體蛋白激酶中，6個(gè)上調(diào)表達(dá)，3個(gè)下調(diào)表達(dá)、1個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因下調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果表明，病程相關(guān)蛋白僅是山藥抵抗炭疽菌侵染的部分因子，它們與其他諸多因子共同起作用，且在不同程度或種類的抗病品種(系)中他們的生物學(xué)功能也有差異[14]。同樣，6個(gè)細(xì)胞壁修飾蛋白中，阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP19)和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(SHA1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)，而導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛的擴(kuò)展蛋白(EXLB1)和細(xì)胞壁降解相關(guān)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XTH22)下調(diào)表達(dá)，可阻止細(xì)胞壁的松弛，增強(qiáng)蘇蕷8號(hào)對(duì)炭疽菌的免疫功能。

正常條件下活性氧(ROS)的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)植物在遭受逆境或脅迫時(shí)，植物體內(nèi)ROS平衡會(huì)被打破，誘導(dǎo)體內(nèi)積累ROS使植物發(fā)生抗病反應(yīng)，過(guò)多的ROS積累會(huì)使膜脂過(guò)氧化而使膜系統(tǒng)受損，對(duì)植物產(chǎn)生傷害[15]。為了維持平衡，一方面植物通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT等)將活性氧分解；另一方面依靠抗氧化次生代謝產(chǎn)物，直接將ROS清除，例如抗壞血酸、類胡蘿卜素、谷胱甘肽、多酚和類黃酮等[16]。蘇蕷8號(hào)受炭疽菌侵染后，過(guò)氧化氫酶(CAT2)和線粒體超氧物歧化酶(MSD1)上調(diào)表達(dá)，MSD1可以將O2-歧化為 H2O2，CAT2通過(guò)直接將H2O2分解生成無(wú)毒害H2O和O2[17]。

CYP450s是一種廣譜性生物催化酶，參與多種代謝反應(yīng)，如脂肪酸代謝、植物激素的生物合成與降解、次生代謝產(chǎn)物的合成[18]。CYP94A1-like參與葉片角質(zhì)的合成[19]、CYP51編碼甾醇14α-去甲基化酶[20]，與甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(BRADI_1g76020v3)共同參與生物甾醇的合成[21]，葉片角質(zhì)和作為質(zhì)膜組分的生物甾醇合成相關(guān)基因在蘇蕷8號(hào)的上調(diào)表達(dá)能有效防止病原物侵染植物組織。CYP78A家族成員(CYP78A3、CYP78A5-like)可能成為一類應(yīng)用于作物改良的基因，參與種子和器官的發(fā)育[22]，它們上調(diào)表達(dá)是否與抗病有關(guān)，尚未見報(bào)道。防御素(SD2)、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素(CBL1)和木菠蘿凝集素(JRL5)基因在蘇蕷8號(hào)的上調(diào)表達(dá)，可與真菌細(xì)胞表面的不同單糖，多糖支鏈或異源多糖結(jié)合，從而干擾真菌細(xì)胞壁的合成，抑制其生長(zhǎng)[23-24]。

植物泛素化系統(tǒng)是在一系列酶的催化作用下，泛素共價(jià)結(jié)合靶標(biāo)蛋白對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾，其泛素化靶標(biāo)蛋白可介導(dǎo)抗病信號(hào)，甚至一些病原物效應(yīng)蛋白也在其宿主細(xì)胞中起泛素連接酶的作用，并以此來(lái)干擾植物抗病反應(yīng)[25]。在水稻中，E2受稻瘟病菌和植物激素誘導(dǎo)表達(dá)，在激素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[26]。同樣，受稻瘟菌侵染時(shí)，編碼RING型的E3連接OsBBI1，過(guò)表達(dá)后植株的細(xì)胞壁明顯增厚，而且感染部位的H2O2和酚類化合物大量積累，即OsBBI1參與由細(xì)胞壁介導(dǎo)的水稻抗病機(jī)制[27]。蘇蕷8號(hào)受炭疽菌后，泛素化連接酶(UBE2、UBE3)上調(diào)表達(dá)，可能有利于增強(qiáng)蘇蕷8號(hào)的抗性。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控山藥炭疽病抗性

轉(zhuǎn)錄因子可作為防御基因表達(dá)中的正或負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過(guò)其保守結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動(dòng)子上的特異結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，來(lái)實(shí)現(xiàn)抗逆調(diào)控功能[28]。WRKY48參與擬南芥丁香假單胞菌侵染后的防衛(wèi)反應(yīng)，過(guò)表達(dá)WRKY48，丁香假單胞菌的生長(zhǎng)的敏感性增強(qiáng)與防御相關(guān)PR基因表達(dá)減少有關(guān)，WRKY48負(fù)調(diào)節(jié)PR基因的表達(dá)[29]。棉花GhWRKY48基因?qū)γ藁菸?、黃萎病、水楊酸、茉莉酸均有一定的響應(yīng)，GhWRKY48基因正向調(diào)節(jié)棉花抗枯萎病反應(yīng)，負(fù)向調(diào)節(jié)棉花對(duì)黃萎病的抗性[30-31]，WRKY75正向調(diào)節(jié)茉莉酸鹽介導(dǎo)的植物對(duì)壞死型真菌病原菌的防御[32]。本試驗(yàn)中WRKY48上調(diào)表達(dá)，WRKY75下調(diào)表達(dá)，可能分別正向和負(fù)向調(diào)控山藥對(duì)炭疽病的響應(yīng)。表明，WRKY家族同一個(gè)基因不僅在不同的作物調(diào)控功能不盡相同，即使在同一作物的調(diào)控功能也不同。棉花中MYB108通過(guò)與鈣離子和鈣調(diào)素樣蛋白GhCML11協(xié)同作用正向調(diào)節(jié)棉花黃萎病響應(yīng)[33]。TIFY10C是水稻中一個(gè)茉莉酸信號(hào)途徑的抑制子，通過(guò)與OsCOI1形成復(fù)合體或與其他蛋白質(zhì)形成異源二聚體抑制茉莉酸信號(hào)途徑，JA處理導(dǎo)致TIFY10C降解，從而對(duì)白葉枯病信號(hào)作出響應(yīng)[34]。蘇蕷8號(hào)下調(diào)表達(dá)MYB108和TIFY10C，可能負(fù)向調(diào)節(jié)山藥對(duì)炭疽病的響應(yīng)。GATA12、HOX11、RSS3、ZFP7、DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育，激素信號(hào)途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、抗逆反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[35-40]，在植物病害調(diào)控方面未見相關(guān)報(bào)道。

3.4 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與山藥炭疽病抗性

生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程涉及了2類轉(zhuǎn)錄因子，一類是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子AFR家族，另一類是Aux/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族，AFR能和生長(zhǎng)素早期誘導(dǎo)基因如 Aux/IAA，SAUR，GH3等家族的啟動(dòng)子響應(yīng)元件特異結(jié)合形成二聚體，激活或者抑制基因表達(dá)。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度較高時(shí)，生長(zhǎng)素與泛素連接酶復(fù)合體SCFTIR1結(jié)合后，會(huì)促使Aux/IAA抑制因子的泛素化與降解，產(chǎn)生眾多ARF蛋白并激活生長(zhǎng)素信號(hào)途徑[41]。病原菌侵染導(dǎo)致生長(zhǎng)素水平失衡，進(jìn)而改變其信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)。水稻GH3-2過(guò)量表達(dá)后能增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病菌、細(xì)菌性條斑病菌和稻瘟病的抗性[42]。擬南芥生長(zhǎng)素信號(hào)缺失突變體axr2(Auxin resistant 2) 對(duì)丁香假單胞桿菌的抗性增強(qiáng)，表明生長(zhǎng)素信號(hào)途徑不利于擬南芥對(duì)丁香假單胞桿菌的免疫反應(yīng)[43]。本研究中，LAX4、IAA4、IAA21、SAUR36、SAUR71在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá)，且LAX4和IAA21在抗病品種表達(dá)量顯著高于感病品種，推測(cè)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑有利于山藥對(duì)炭疽病的免疫反應(yīng)。

茉莉酸信號(hào)途徑中茉莉酸合成關(guān)鍵酶基因OPR1和脫落酸合成關(guān)鍵酶基因NCED上調(diào)表達(dá)，有利于增強(qiáng)蘇蕷8號(hào)炭疽病抗性。JA在馬鈴薯晚疫病菌侵染期間，會(huì)識(shí)別Pep-13致病因子，激活茉莉酸信號(hào)途徑，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生、PR基因的表達(dá)及細(xì)胞超敏死亡，增強(qiáng)對(duì)馬鈴薯晚疫病的抗性[44]。ABA可以破壞煙草中由水楊酸介導(dǎo)的對(duì)煙草花葉病毒(TMV)和葉斑病的抵抗[45]，亦可控制植物氣孔關(guān)閉，促進(jìn)胼胝質(zhì)沉積阻止病菌侵染，正向調(diào)控植物的抗病性[46]。油桐在尖孢鐮孢菌侵染后，VmAP2/ERF036和其同源基因VfAP2/ERF036表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，VmAP2/ERF036的表達(dá)受到抑制，表明二者的抗病調(diào)節(jié)模式不同[47]。ERF036在蘇蕷8號(hào)下調(diào)表達(dá)，可能負(fù)向調(diào)控山藥炭疽菌的侵染。GASA(Gibberellic Acid-stimulated Arabidopsis)蛋白是一類CRP蛋白，大多數(shù)成員受赤霉素調(diào)控。目前只在馬鈴薯、辣椒和法國(guó)菜豆中發(fā)現(xiàn)GASA蛋白參與植物防御反應(yīng)[48-50]。但已有證據(jù)表明，GASA蛋白可通過(guò)促進(jìn)水楊酸SA合成基因的表達(dá)和植物體內(nèi)SA的水平來(lái)抵抗非生物脅迫[51]。本研究中GASA14在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)，GASA2下調(diào)表達(dá)，它們?nèi)绾螀⑴c蘇蕷8號(hào)抗病性還需要進(jìn)一步研究。