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      白血病與骨髓增生異常綜合征患者Th17、白細(xì)胞介素21及白細(xì)胞介素1β水平變化研究

      2022-05-14 07:16:20張麗紅李月賢尹婉宜
      臨床軍醫(yī)雜志 2022年4期
      關(guān)鍵詞:亞組骨髓外周血

      馬 兵,張麗紅,趙 丹,李月賢,尹婉宜,沈 揚

      河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 血液內(nèi)科,河北 石家莊 050031

      急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)為臨床常見的血液系統(tǒng)疾病,盡管疾病的性質(zhì)不盡相同,但均可引發(fā)骨髓造血衰竭[1]。MDS是一組起源于骨髓造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病,環(huán)孢素和抗胸腺細(xì)胞球蛋白等免疫抑制劑對30%~60%患者治療有效[2]。AML也屬于造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞惡性克隆性疾病,但其僅可通過放療/化療產(chǎn)生療效[3]。目前,臨床對于AML、MDS的免疫系統(tǒng)變化,T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是否具有差異,以及AML與MDS為不同分期還是同一種疾病仍缺乏權(quán)威性的說明。Th17是一群在白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6等細(xì)胞因子和TCR通路刺激下分化的細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞是一種細(xì)胞群,可以對機體細(xì)胞免疫進(jìn)行調(diào)控,維持免疫系統(tǒng)對自身成分的耐受,使機體維持良好的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。有研究報道,Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的平衡在同種異體胎兒免疫、器官移植、腫瘤及感染等疾病方面對各種途徑的病理生理免疫應(yīng)答具有一定的抑制作用[5]。本研究旨在探討AML、MDS患者Th17、IL-21及IL-1β水平變化及臨床意義?,F(xiàn)報道如下。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料 將自2016年1月至2020年12月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的20例AML患者納入AML組,30例MDS患者納入MDS組。將MDS組中難治性貧血原始細(xì)胞增多(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia with excessblasts,MDS-RAEB)患者納入MDS-RAEB亞組(n=15),難治性貧血(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia,MDS-RA)患者納入MDS-RA亞組(n=15)?;颊呔舷嚓P(guān)血液病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7],且排除心肝腎功能障礙者,排除惡性腫瘤及嚴(yán)重器質(zhì)性消耗性疾病者。另選取同期于我院體檢的20例健康者納入對照組。AML組中,男性13例,女性7例;年齡40~71歲,平均年齡(58.69±3.18)歲;平均病程(2.39±0.32)個月。MDS組中,男性17例,女性13例;年齡41~72歲,平均年齡(58.73±3.25)歲;平均病程(2.42±0.28)個月。對照組中,男性15例,女性5例;年齡39~70歲,平均年齡(58.65±3.21)歲。各組研究對象年齡、性別比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

      1.2 研究方法

      1.2.1 外周血及骨髓單個核細(xì)胞提取 抽取研究對象3 ml骨髓及外周血樣本,抗凝使用肝素,1 500 r/min條件下離心10 min,取上清。在含有淋巴細(xì)胞分離液的尖底離心管中沿壁將無菌管緩慢加入,保持兩個界面相對清晰,離心后,將離心管取出。將界面層細(xì)胞(單個核細(xì)胞)使用吸管吸出,使用無菌生理鹽水清洗2遍,離心收集單個核細(xì)胞,使用加有10%滅活胎牛血清、谷氨酞胺、即用型鏈霉素/青霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/ml。

      1.2.2 外周血及骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞檢測 將2×106的骨髓單個核細(xì)胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中,每個孔中加入1 ml,再向其中加入2 nmol/ml的莫能菌素、1 ng/ml的離子霉素、20 ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯,置于培養(yǎng)箱中,在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)4 h。細(xì)胞收集后,將其分為實驗管和對照管,加入CD4-FITC、CD3-APC抗體,避光孵育30 min。棄上清液,加入4%的多聚甲醛固定,室溫條件下處理20 min,0.1%皂素穿膜10 min,棄上清液,每個管道留置200 μl的穿膜液重懸細(xì)胞。加入10 μl的IL-17PE抗體,同行對照中加入相應(yīng)對照抗體,室溫條件下孵育1 h。洗滌后,上流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞百分比。將1 ml含有2×106個/ml的骨髓單個核細(xì)胞懸液分為實驗管和對照管。洗滌后細(xì)胞重懸于200 μl洗液中,加入CD127 Perep-cy5.5、CD25-FITC、CD4-PE,室溫條件下孵育15 min,PBS洗液洗滌,對照管中加入相應(yīng)對照抗體,4℃條件下孵育15 min,上流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞。

      1.2.3 外周血IL-17、IL-21、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子-β水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法對血清IL-17、IL-21、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)水平進(jìn)行測定,試劑盒購于武漢賽培生物,操作方法按照說明書執(zhí)行。

      2 結(jié)果

      2.1 各組研究對象外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較 與對照組比較,AML組和MDS組外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例明顯升高,且MDS組高于AML組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS-RA亞組外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例高于MDS-RAEB亞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

      表1 各組研究對象外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較

      2.2 各組研究對象骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較 與對照組比較,AML組和MDS組骨髓單個核細(xì)胞Treg、Th17細(xì)胞細(xì)胞比例明顯升高,且MDS組高于AML組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS-RA亞組骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例高于MDS-RAEB亞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

      表2 各組研究對象骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較

      2.3 AML、MDS患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示,AML、MDS患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均呈現(xiàn)一定正相關(guān)(r=0.467、0.539,P<0.05)。

      2.4 各組研究對象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平變化 與對照組比較,AML組和MDS組外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明顯升高,且MDS組高于AML組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS-RA亞組外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明顯高于MDS-RAEB亞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

      表3 各組研究對象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平變化

      3 討論

      人體正常機體活動需要各種免疫細(xì)胞(尤其是T淋巴細(xì)胞)平衡的維持,這種平衡一旦被打破,免疫功能抑制或者亢進(jìn),進(jìn)而造成機體免疫疾病的發(fā)生[8]。CD4+T細(xì)胞亞群包括Th17、Th2、Th1及Treg細(xì)胞,其中Th17和Th1細(xì)胞具有明顯的增加細(xì)胞凋亡和抗腫瘤的作用,而Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞的主要功能為免疫制劑[9]。Th17細(xì)胞可表達(dá)CCR6、CCR4、IL-12,孤獨性受體γt也是Th17細(xì)胞的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子,與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3相互協(xié)同,對IL-17的產(chǎn)生和Th17的分化產(chǎn)生刺激作用[10]。Treg細(xì)胞是一類具有獨特負(fù)性調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞,可表達(dá)生成Foxp3、CD3+、CD4+細(xì)胞,其中Foxp3對Treg細(xì)胞的功能維持及分化具有重要的作用[11]。正常生理條件下,TGF-β對初始的CD4+細(xì)胞產(chǎn)生影響,誘導(dǎo)其分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,同時在TGF-β和IL-6的共同刺激下,可分化生成Th17細(xì)胞[12]。在激活的神經(jīng)突觸細(xì)胞或者IL-6的存在下,Treg細(xì)胞可自身分化為Th17細(xì)胞,通過免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對Th17/Treg細(xì)胞的動態(tài)平衡產(chǎn)生維持作用[13]。有研究報道,在自身免疫性疾病中,IL-17R與促炎因子IL-17特異性結(jié)合,從而對相關(guān)信號通路進(jìn)行激活,對相關(guān)炎癥因子及趨化因子的釋放產(chǎn)生促進(jìn)作用,擴(kuò)大自身免疫性反應(yīng)及炎癥反應(yīng),使Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞平衡向Th17細(xì)胞偏移[14],但其在AML及MDS疾病發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用尚無定論。Owattanapanich等[15]研究報道,與正常人相比,進(jìn)展期胃癌患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量明顯較高,且與臨床病理分期存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示,MDS組患者Th17細(xì)胞明顯高于對照組及AML組,且隨著病情的進(jìn)展,其Th17細(xì)胞數(shù)量逐漸增加;相關(guān)性分析表明,AML、MDS患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均呈現(xiàn)一定正相關(guān)(P<0.05)。Yuan等[16]研究報道,在MDS骨髓環(huán)境中,Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例及相應(yīng)絕對數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢,與本研究結(jié)果一致。Dostalova等[17]研究報道,肺癌中Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞均顯著提高,且兩者呈現(xiàn)一定相關(guān)性。Tsutsumi等[18]研究報道,宮頸癌患者中Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞均一定程度增加,兩種細(xì)胞平衡被打破。上述研究證實,在外周血及骨髓微環(huán)境中,Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。

      AML與MDS之間的關(guān)系傾向于量變引發(fā)的疾病發(fā)展,而非質(zhì)變引發(fā)的疾病轉(zhuǎn)化。Britt等[19]研究報道,晚期MDS患者體內(nèi)骨髓組織中IL-22、IL-21、IL-17呈現(xiàn)高水平表達(dá),提示體內(nèi)的Treg細(xì)胞逐漸向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化。而本研究結(jié)果顯示,MDS患者血清IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21水平明顯高于對照組及AML組,且隨著MDS病情的發(fā)展,上述指標(biāo)水平越高。其中,Treg細(xì)胞分泌的IL-1β、TGF-β呈現(xiàn)高水平表達(dá),提示患者機體免疫耐受性相對增加。此外,IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21均可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的不斷分化及擴(kuò)增。在卵巢癌、宮頸癌等腫瘤研究中已經(jīng)證實,IL-17可以通過對新生血管形成產(chǎn)生刺激作用,從而誘導(dǎo)這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。因此,AML到MDS可能是疾病量化而導(dǎo)致的疾病進(jìn)展,而MDS骨髓組織中擴(kuò)增的Th17、Treg細(xì)胞通過分泌大量細(xì)胞因子一方面對新生血管增生產(chǎn)生促進(jìn)效果,利于細(xì)胞增殖和疾病進(jìn)展,另一方面對機體免疫系統(tǒng)活性有效抑制,增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫耐受性。

      綜上所述,AML和MDS患者外周血及骨髓組織Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞均升高,外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平均明顯升高,其可以誘導(dǎo)新生血管增生,抑制機體免疫活性,促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展。

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