白血病與骨髓增生異常綜合征患者Th17、白細(xì)胞介素21及白細(xì)胞介素1β水平變化研究

馬 兵，張麗紅，趙 丹，李月賢，尹婉宜，沈 揚

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 血液內(nèi)科，河北 石家莊 050031

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)為臨床常見的血液系統(tǒng)疾病，盡管疾病的性質(zhì)不盡相同，但均可引發(fā)骨髓造血衰竭[1]。MDS是一組起源于骨髓造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，環(huán)孢素和抗胸腺細(xì)胞球蛋白等免疫抑制劑對30%～60%患者治療有效[2]。AML也屬于造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞惡性克隆性疾病，但其僅可通過放療/化療產(chǎn)生療效[3]。目前，臨床對于AML、MDS的免疫系統(tǒng)變化，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是否具有差異，以及AML與MDS為不同分期還是同一種疾病仍缺乏權(quán)威性的說明。Th17是一群在白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6等細(xì)胞因子和TCR通路刺激下分化的細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞是一種細(xì)胞群，可以對機體細(xì)胞免疫進(jìn)行調(diào)控，維持免疫系統(tǒng)對自身成分的耐受，使機體維持良好的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。有研究報道，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的平衡在同種異體胎兒免疫、器官移植、腫瘤及感染等疾病方面對各種途徑的病理生理免疫應(yīng)答具有一定的抑制作用[5]。本研究旨在探討AML、MDS患者Th17、IL-21及IL-1β水平變化及臨床意義?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將自2016年1月至2020年12月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的20例AML患者納入AML組，30例MDS患者納入MDS組。將MDS組中難治性貧血原始細(xì)胞增多(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia with excessblasts，MDS-RAEB)患者納入MDS-RAEB亞組(n=15)，難治性貧血(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia，MDS-RA)患者納入MDS-RA亞組(n=15)?；颊呔舷嚓P(guān)血液病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，且排除心肝腎功能障礙者，排除惡性腫瘤及嚴(yán)重器質(zhì)性消耗性疾病者。另選取同期于我院體檢的20例健康者納入對照組。AML組中，男性13例，女性7例；年齡40～71歲，平均年齡(58.69±3.18)歲；平均病程(2.39±0.32)個月。MDS組中，男性17例，女性13例；年齡41～72歲，平均年齡(58.73±3.25)歲；平均病程(2.42±0.28)個月。對照組中，男性15例，女性5例；年齡39～70歲，平均年齡(58.65±3.21)歲。各組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血及骨髓單個核細(xì)胞提取 抽取研究對象3 ml骨髓及外周血樣本，抗凝使用肝素，1 500 r/min條件下離心10 min，取上清。在含有淋巴細(xì)胞分離液的尖底離心管中沿壁將無菌管緩慢加入，保持兩個界面相對清晰，離心后，將離心管取出。將界面層細(xì)胞(單個核細(xì)胞)使用吸管吸出，使用無菌生理鹽水清洗2遍，離心收集單個核細(xì)胞，使用加有10%滅活胎牛血清、谷氨酞胺、即用型鏈霉素/青霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/ml。

1.2.2 外周血及骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞檢測 將2×106的骨髓單個核細(xì)胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每個孔中加入1 ml，再向其中加入2 nmol/ml的莫能菌素、1 ng/ml的離子霉素、20 ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯，置于培養(yǎng)箱中，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)4 h。細(xì)胞收集后，將其分為實驗管和對照管，加入CD4-FITC、CD3-APC抗體，避光孵育30 min。棄上清液，加入4%的多聚甲醛固定，室溫條件下處理20 min，0.1%皂素穿膜10 min，棄上清液，每個管道留置200 μl的穿膜液重懸細(xì)胞。加入10 μl的IL-17PE抗體，同行對照中加入相應(yīng)對照抗體，室溫條件下孵育1 h。洗滌后，上流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞百分比。將1 ml含有2×106個/ml的骨髓單個核細(xì)胞懸液分為實驗管和對照管。洗滌后細(xì)胞重懸于200 μl洗液中，加入CD127 Perep-cy5.5、CD25-FITC、CD4-PE，室溫條件下孵育15 min，PBS洗液洗滌，對照管中加入相應(yīng)對照抗體，4℃條件下孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞。

1.2.3 外周血IL-17、IL-21、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子-β水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法對血清IL-17、IL-21、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平進(jìn)行測定，試劑盒購于武漢賽培生物，操作方法按照說明書執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較 與對照組比較，AML組和MDS組外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例明顯升高，且MDS組高于AML組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS-RA亞組外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例高于MDS-RAEB亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組研究對象外周血單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較

2.2 各組研究對象骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較 與對照組比較，AML組和MDS組骨髓單個核細(xì)胞Treg、Th17細(xì)胞細(xì)胞比例明顯升高，且MDS組高于AML組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS-RA亞組骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例高于MDS-RAEB亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組研究對象骨髓單個核細(xì)胞Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例比較

2.3 AML、MDS患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，AML、MDS患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均呈現(xiàn)一定正相關(guān)(r=0.467、0.539，P<0.05)。

2.4 各組研究對象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平變化 與對照組比較，AML組和MDS組外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明顯升高，且MDS組高于AML組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS-RA亞組外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明顯高于MDS-RAEB亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組研究對象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平變化

3 討論

人體正常機體活動需要各種免疫細(xì)胞(尤其是T淋巴細(xì)胞)平衡的維持，這種平衡一旦被打破，免疫功能抑制或者亢進(jìn)，進(jìn)而造成機體免疫疾病的發(fā)生[8]。CD4+T細(xì)胞亞群包括Th17、Th2、Th1及Treg細(xì)胞，其中Th17和Th1細(xì)胞具有明顯的增加細(xì)胞凋亡和抗腫瘤的作用，而Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞的主要功能為免疫制劑[9]。Th17細(xì)胞可表達(dá)CCR6、CCR4、IL-12，孤獨性受體γt也是Th17細(xì)胞的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3相互協(xié)同，對IL-17的產(chǎn)生和Th17的分化產(chǎn)生刺激作用[10]。Treg細(xì)胞是一類具有獨特負(fù)性調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，可表達(dá)生成Foxp3、CD3+、CD4+細(xì)胞，其中Foxp3對Treg細(xì)胞的功能維持及分化具有重要的作用[11]。正常生理條件下，TGF-β對初始的CD4+細(xì)胞產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)其分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，同時在TGF-β和IL-6的共同刺激下，可分化生成Th17細(xì)胞[12]。在激活的神經(jīng)突觸細(xì)胞或者IL-6的存在下，Treg細(xì)胞可自身分化為Th17細(xì)胞，通過免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對Th17/Treg細(xì)胞的動態(tài)平衡產(chǎn)生維持作用[13]。有研究報道，在自身免疫性疾病中，IL-17R與促炎因子IL-17特異性結(jié)合，從而對相關(guān)信號通路進(jìn)行激活，對相關(guān)炎癥因子及趨化因子的釋放產(chǎn)生促進(jìn)作用，擴(kuò)大自身免疫性反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，使Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞平衡向Th17細(xì)胞偏移[14]，但其在AML及MDS疾病發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用尚無定論。Owattanapanich等[15]研究報道，與正常人相比，進(jìn)展期胃癌患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量明顯較高，且與臨床病理分期存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，MDS組患者Th17細(xì)胞明顯高于對照組及AML組，且隨著病情的進(jìn)展，其Th17細(xì)胞數(shù)量逐漸增加；相關(guān)性分析表明，AML、MDS患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均呈現(xiàn)一定正相關(guān)(P<0.05)。Yuan等[16]研究報道，在MDS骨髓環(huán)境中，Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例及相應(yīng)絕對數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢，與本研究結(jié)果一致。Dostalova等[17]研究報道，肺癌中Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞均顯著提高，且兩者呈現(xiàn)一定相關(guān)性。Tsutsumi等[18]研究報道，宮頸癌患者中Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞均一定程度增加，兩種細(xì)胞平衡被打破。上述研究證實，在外周血及骨髓微環(huán)境中，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。

AML與MDS之間的關(guān)系傾向于量變引發(fā)的疾病發(fā)展，而非質(zhì)變引發(fā)的疾病轉(zhuǎn)化。Britt等[19]研究報道，晚期MDS患者體內(nèi)骨髓組織中IL-22、IL-21、IL-17呈現(xiàn)高水平表達(dá)，提示體內(nèi)的Treg細(xì)胞逐漸向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化。而本研究結(jié)果顯示，MDS患者血清IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21水平明顯高于對照組及AML組，且隨著MDS病情的發(fā)展，上述指標(biāo)水平越高。其中，Treg細(xì)胞分泌的IL-1β、TGF-β呈現(xiàn)高水平表達(dá)，提示患者機體免疫耐受性相對增加。此外，IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21均可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的不斷分化及擴(kuò)增。在卵巢癌、宮頸癌等腫瘤研究中已經(jīng)證實，IL-17可以通過對新生血管形成產(chǎn)生刺激作用，從而誘導(dǎo)這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。因此，AML到MDS可能是疾病量化而導(dǎo)致的疾病進(jìn)展，而MDS骨髓組織中擴(kuò)增的Th17、Treg細(xì)胞通過分泌大量細(xì)胞因子一方面對新生血管增生產(chǎn)生促進(jìn)效果，利于細(xì)胞增殖和疾病進(jìn)展，另一方面對機體免疫系統(tǒng)活性有效抑制，增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫耐受性。

綜上所述，AML和MDS患者外周血及骨髓組織Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞均升高，外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平均明顯升高，其可以誘導(dǎo)新生血管增生，抑制機體免疫活性，促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展。