耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的基因組分型及耐藥性評估

鄭軍濤，胡會

（河南省西華第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 周口 466600）

肺炎克雷伯菌廣泛存在于自然界中，是最為常見的機(jī)會致病菌之一，可直接引發(fā)多種感染疾病，如菌血癥、尿路感染、肝膿腫等[1]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌是臨床中較為常見的耐藥菌，目前尚無有效對應(yīng)治療手段，直接導(dǎo)致病死率升高，引發(fā)了廣泛關(guān)注[2]。在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的傳播性調(diào)查研究中，全基因組測序技術(shù)和基于全基因組序列的分型技術(shù)被廣泛應(yīng)用，在菌株鑒別、傳播鏈識別等方面發(fā)揮了良好作用[3]。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥率逐漸提升，給臨床對癥治療、預(yù)防控制醫(yī)院感染帶來了較大困難，并且對人類健康造成了極大威脅[4]。因此，對于肺炎克雷伯菌的臨床感染分布、基因組分型，特別是耐藥性分析對臨床合理控制其傳播顯得尤為重要[5]。本研究主要探究耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌院內(nèi)分布狀況、基因組分型情況及耐藥性趨勢，為臨床中合理使用碳青霉烯類抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及分離鑒定

134株肺炎克雷伯菌株分離自2021年1月—9月本院患者的不重復(fù)送檢樣本，包括痰液、尿液、膿液、血液等，其中共分離出68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株。所有肺炎克雷伯菌的培養(yǎng)、分離和鑒定均按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）[6]進(jìn)行。

1.2 全基因組測序及分析

使用菌株ZZYF002的基因組序列作為參考序列，使用bowtie2軟件將其他菌株的基因組與之比對，使用Samtools軟件鑒定所有菌株基因組的共有SNP。將序列比對至耐藥基因數(shù)據(jù)庫中，查找耐藥性相關(guān)基因的名稱，挑選分析每株菌的耐藥基因，包括blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48，將每株菌的全基因組序列與MLST網(wǎng)站（http：//bigsdb.pasteur.fr/）公布的肺炎克雷伯菌MLST分型的7個(gè)管家基因rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB的片段序列進(jìn)行比對，獲得每個(gè)位點(diǎn)的等位基因編號以及菌株的MLST型別。

1.3 藥敏方法

采用K-B紙片法藥敏試驗(yàn)，通過細(xì)菌分析儀觀察68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、亞胺培南、美羅培南等10種抗菌藥物的耐藥性，結(jié)果根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所2015版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以（n）和（%）]進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株分布

分離的68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株大部分來源于痰液和尿液標(biāo)本，分別為69.66%和19.05%；科室分布以重癥監(jiān)護(hù)室、呼吸內(nèi)科為主，具體見表1。

表1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株分布

2.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

基于全基因組序列分析，68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌MLST分型分為4種不同的型別，其中有65株為ST11型；1株ST219型菌株攜帶blaNDM-1基因，1株ST11型菌株攜帶blaKPC-11基因，1株ST11型菌株同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因，其余63株ST11型、1株ST15型和1株ST2237型菌株均攜帶blaKPC-2基因，未檢出blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因，具體見表2。

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

2.3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對10種抗菌藥物的耐藥率分析

68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟耐藥率高達(dá)95.00%以上，具體見表3。

表3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對10種抗菌藥物的耐藥率分析[n（%）]

3 討論

ST11型是我國耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株的主要流行MLST型[7]。我國報(bào)道的第1株ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株于2007年成功分離[8]。本研究結(jié)果顯示，攜帶blaKPC-2基因是ST11型菌株產(chǎn)生碳青霉烯類抗生素耐藥性的主要機(jī)制，提示攜帶blaKPC-2基因的ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株已經(jīng)在我國流行了多年。

3.1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株分布情況

本研究結(jié)果顯示，分離的68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株大部分來源于痰液和尿液標(biāo)本，分別為69.66%和19.05%，科室分布以重癥監(jiān)護(hù)室、呼吸內(nèi)科為主。據(jù)此證實(shí)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株在院內(nèi)各科室中已廣泛分布，究其原因是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株可通過患者間交叉感染、人工呼吸機(jī)等醫(yī)療器械進(jìn)行傳播，其主要分布在重癥監(jiān)護(hù)室、呼吸內(nèi)科，是因?yàn)檫@些科室的患者病情較為嚴(yán)重，免疫力水平較低、患病時(shí)間較長、聯(lián)合使用了多種抗菌藥物等；且以痰液、尿液標(biāo)本為主，說明其常引起的癥狀為呼吸道感染、泌尿系感染，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致。

3.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

基于全基因組序列分析，68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌MLST分型分為4種不同的型別，其中有65株為ST11型；1株ST219型菌株攜帶blaNDM-1基因，1株ST11型菌株攜帶blaKPC-11基因，1株ST11型菌株同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因，其余63株ST11型、1株ST15型和1株ST2237型菌株均攜帶blaKPC-2基因，未檢出blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因，與徐慧等[10]研究類似。該結(jié)果說明耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌主要以攜帶blaKPC-2基因進(jìn)行傳播，并且已經(jīng)開始獨(dú)立流行傳播，醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以對應(yīng)發(fā)展相關(guān)基因組水平技術(shù)手段，應(yīng)用于耐藥菌的日常監(jiān)測，并結(jié)合臨床診療數(shù)據(jù)，及時(shí)采取措施加以防控。

3.3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對10種抗菌藥物的耐藥率比較

本研究中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，除慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率低于90.00%外，氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟耐藥率高達(dá)95.00%以上，高于相關(guān)報(bào)道的檢出率[11]，其原因可能與不同地區(qū)、醫(yī)院的抗菌用藥使用頻率有關(guān)，同時(shí)也說明我院在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株引起相應(yīng)感染時(shí)的控制工作較差；其次是因?yàn)樘记嗝瓜╊惪股厥蔷哂袕V譜耐藥活性的β-內(nèi)酰胺抗生素，隨著碳青霉烯酶的基因分型重合率上升，多重耐藥菌株以及泛耐藥菌株的數(shù)量也逐年上升。

綜上所述，攜帶blaKPC-2基因的ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株已在院內(nèi)各科室廣泛分布，且對各抗菌藥物的耐藥率有所增加。因此，應(yīng)引起臨床重視，合理使用抗菌藥物。