王 璐，張 強(qiáng)，王艷萍，郭旭川，張文倩，朱春灝，曾維斌

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

新疆驢作為小型驢品種，其性情溫順、耐粗飼、抗病性好，深受牧區(qū)群眾喜愛(ài)，曾在農(nóng)耕和運(yùn)輸方面發(fā)揮重要作用。目前，新疆驢主要分布在新疆南疆地區(qū)，已被列入國(guó)家畜禽遺傳資源保護(hù)目錄。在精液保存處理過(guò)程中，精液的離心、降溫、代謝、復(fù)溫等過(guò)程都會(huì)給精子造成氧化應(yīng)激損傷，降低精子活力，破壞膜功能完整性，影響活性氧（ROS）的代謝平衡，擾亂細(xì)胞正常的生理生化水平，降低母畜受胎率，因此需要補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)保護(hù)精子。

白藜蘆醇、綠原酸作為普遍存在于植物中的天然多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌消炎等多重功能。目前的研究表明，白藜蘆醇、綠原酸對(duì)提高家畜精子質(zhì)量效果顯著。馬精液冷凍保存前添加白藜蘆醇可以改善精液質(zhì)量，降低DNA 損傷；白藜蘆醇可以減少氧化應(yīng)激，提高水牛精液的體外受精能力；15℃保存公豬精液時(shí)添加不同濃度綠原酸均能夠改善精液質(zhì)量；何濤等研究表明，添加50 μg/mL 的綠原酸對(duì)公豬精液的冷凍保護(hù)效果最好。添加適宜的抗氧化劑對(duì)精液的保存是有益的，但在驢精液保存時(shí)使用抗氧化劑的研究較少，可以有效改善驢精液低溫保存效果的抗氧化劑濃度需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)旨在探究在自配稀釋液基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的白藜蘆醇、綠原酸對(duì)新疆驢精液低溫保存效果的影響，最終獲得白藜蘆醇、綠原酸在新疆驢精液低溫保存時(shí)的適宜添加量，為提高種公驢精液利用率、加強(qiáng)品種保護(hù)提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、葡萄糖、果糖、乳糖均為分析純級(jí)別；白藜蘆醇、綠原酸：純度≥98%，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.2 主要儀器 恒溫水浴鍋（PK-80 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)），純水儀（Direct-Q8UV-R Merck，德國(guó)），蒸汽滅菌鍋（HVE-50 HIRAYAMA，日本），電子分析天平（ME204 METTLER TOLEDO，瑞士），冰箱（BCD-272AY 容聲，中國(guó)），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（1510 Thermo，美國(guó)），熒光倒置顯微鏡（DMI8 Leica，德國(guó)），恒溫臺(tái)（E5CC OMRON，日本）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 頭優(yōu)秀新疆驢種公驢由石河子市九昌驢業(yè)有限公司提供，年齡為3～5 歲，體況良好，無(wú)生殖系統(tǒng)疾病，按照種公驢培育管理技術(shù)規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 稀釋液的配置 自配稀釋液：準(zhǔn)確稱取HEPES 0.953 g、檸檬酸鈉 0.825 g、檸檬酸鉀 0.128 g、葡萄糖 2.9 g、乳糖 2.9 g、溶于100 mL 雙蒸水，濾紙過(guò)濾，高壓滅菌10 min，冷卻至室溫備用。新鮮雞蛋敲開外殼，無(wú)菌濾紙滾動(dòng)去除卵黃表面的蛋清，注射器針頭輕輕挑破卵黃，無(wú)針頭注射器緩慢吸取卵黃液，按照8%的比例注入冷卻后的溶液中，最后加入青鏈霉素各10 萬(wàn)IU，磁力攪拌器攪拌30 min。

在自配稀釋液基礎(chǔ)上分別添加白藜蘆醇（0、25、50、100、200 μmol/L）、綠原酸（0、0.03、0.06、0.09、0.12 g/L），混勻，所有稀釋液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 精液的采集與處理 發(fā)情母驢作為臺(tái)畜并保定，清潔公母驢生殖器官，以溫和的生理鹽水沖洗并擦凈。采精員站立在臺(tái)畜右方，待公驢陰莖充分勃起并爬跨時(shí)，采精者順勢(shì)將陰莖托入事先準(zhǔn)備好的假陰道，公驢完成射精動(dòng)作后，打開氣閥，陰莖疲軟順勢(shì)抽出，對(duì)采集的精液色澤、氣味、精液量等進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用品質(zhì)較好的精液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

采集的精液經(jīng)4～6 層紗布過(guò)濾后，按照1:1 體積比以37℃預(yù)熱的自配稀釋液緩慢稀釋精液，室溫平衡30 min后，1 800 r/min 離心10 min，棄上清，加入含有抗氧化劑的稀釋液，等溫稀釋至原精液的3 倍。將裝有精液的離心管以10 層紗布包裹，置于5℃冰箱保存，間隔12 h 翻動(dòng)一次離心管，以免精子沉積。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在低溫保存的各時(shí)間點(diǎn)取樣，檢測(cè)各組精子質(zhì)量。

第4、5、6、7 天分別檢測(cè)精子活率、質(zhì)膜完整性及頂體完整性，第1、3、5、7 天檢測(cè)SOD 活性。

1.4.1 精子活率 取適量待檢精液于1.5mL 離心管，37℃水浴5min，使用顯微鏡隨機(jī)觀察5 個(gè)視野下精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，每次計(jì)數(shù)不少于200 個(gè)精子，重復(fù)3 次，觀察精子活率并記錄。

1.4.2 質(zhì)膜完整性 取1 mL HOST 液（果糖0.9 g，檸檬酸鈉0.49 g，雙蒸水100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配），37℃預(yù)熱5 min，加入100 μL 精液，輕輕混勻，37℃水浴45 min。倒置顯微鏡下觀察精子形態(tài)，轉(zhuǎn)換視野記錄至少200 個(gè)精子，重復(fù)3 次。質(zhì)膜完整的精子由于質(zhì)膜膨脹而使尾部彎曲、形成環(huán)狀，膜功能不完整的精子則不發(fā)生彎尾現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)所含的彎尾、環(huán)狀精子數(shù)所占比例。

質(zhì)膜完整性=質(zhì)膜完整精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

1.4.3 頂體完整性 取待測(cè)精液20 μL，制成抹片，經(jīng)固定后，用過(guò)濾的吉姆薩染液（母液：PBS 緩沖液=1:9，現(xiàn)用現(xiàn)配）染片80 min，水洗風(fēng)干后鏡檢。頂體分為4 種類型，I 型：頂體完整，邊緣光滑，著色均勻，有時(shí)可見(jiàn)清晰的赤道板；II 型：頂體輕微膨脹，頂體膜膨大；III 型：頂體嚴(yán)重膨脹，著色淡，頂體邊緣不整齊；IV 型：頂體完全脫落。II、III、IV 型為頂體不完整精子，隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，每次計(jì)數(shù)不少于200 個(gè)精子，重復(fù)3 次，計(jì)算I 型精子所占比例。

頂體完整性=頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

1.4.4 SOD 活性 使用超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒（A001-3）測(cè)定SOD 活性，按照試劑盒說(shuō)明書配置檢測(cè)液，正式測(cè)定前，挑取2 例正常樣本稀釋成不同濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取抑制率在40%～60% 的樣本濃度，按說(shuō)明書將檢測(cè)液與樣本加至96 孔板，37℃孵育20 min，450 nm 處酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，＜0.05 表示差異顯著，＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)精液低溫保存效果的影響

2.1.1 白藜蘆醇對(duì)精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性的影響 由表1 可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性均表現(xiàn)下降趨勢(shì)。第5～7天，100 μmol/L 白藜蘆醇組的精子活率顯著高于其他組。保存第4、6 天，各組間的質(zhì)膜完整性差異不顯著；第7天時(shí)，100 μmol/L 白藜蘆醇組的質(zhì)膜完整性顯著高于0、25 μmol/L 白藜蘆醇組。低溫保存第4～7 天，100 μmol/L白藜蘆醇組的頂體完整性均顯著高于0 μmol/L 組。

表1 白藜蘆醇對(duì)精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性的影響

2.1.2 白藜蘆醇對(duì)低溫保存精液SOD 活性的影響 由圖1 可知，在第3、5、7 天，各組的SOD 活性隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。保存第1 天時(shí)，添加白藜蘆醇試驗(yàn)組的SOD 活性均顯著低于0 μmol/L 組，100、200 μmol/L 組SOD 活性顯著高于25、50 μmol/L 組。保存第3 天時(shí)，添加組SOD 活性均顯著高于0 μmol/L 組，各添加組間無(wú)顯著差異。保存第5、7 天時(shí)，100 μmol/L組SOD 活性均為最高。

圖1 白藜蘆醇對(duì)低溫保存精液SOD 活性的影響

2.2 綠原酸對(duì)精液低溫保存效果的影響

2.2.1 綠原酸對(duì)精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性的影響 由表2 可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性均表現(xiàn)下降趨勢(shì)。保存第6 天時(shí)，0.06 g/L 綠原酸組的精子活率顯著高于0、0.03、0.12 g/L 綠原酸組；第7 天時(shí)，0.06 g/L 組的精子活率顯著高于其他試驗(yàn)組。保存第4、5 天，各組間的質(zhì)膜完整性差異不顯著；保存第7 天時(shí)，0.06 g/L 綠原酸組的質(zhì)膜完整性顯著高于0、0.09、0.12 g/L 綠原酸組。保存第4、5 天，各組間的頂體完整性差異不顯著；第6、7 天時(shí)，0.06 g/L 綠原酸組的頂體完整性顯著高于0 g/L 綠原酸組。

表2 綠原酸對(duì)精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性的影響

2.2.2 綠原酸對(duì)低溫保存精液SOD 活性的影響 由圖2可知，各組精液中的SOD 活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷變化，在第7 天時(shí)明顯下降。精液保存第1 天，0.09 g/L 綠原酸組的SOD 活性顯著高于其他組，0.03、0.06、0.12 g/L綠原酸組顯著低于0 g/L 綠原酸組。第3 天時(shí)，0.06 g/L綠原酸組的SOD 活性顯著高于其他試驗(yàn)組。在第5 天，0.03、0.06、0.09、0.12 g/L 綠原酸組SOD 活性均顯著高于0 g/L 綠原酸組，0.09、0.12 g/L 組SOD 活性無(wú)顯著差異。第7 天時(shí)，0.06 g/L 綠原酸組的SOD 活性顯著高于其他試驗(yàn)組。

圖2 綠原酸對(duì)低溫保存精液SOD 活性的影響

3 討 論

3.1 白藜蘆醇、綠原酸對(duì)精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率的影響 精液在長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存中，會(huì)積累一定的活性氧。過(guò)量的活性氧會(huì)對(duì)精子結(jié)構(gòu)造成傷害，從而降低精子活率、破壞膜功能。而完整的質(zhì)膜是精子能夠正常運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)，檢測(cè)頂體完整性則是判斷精子授精能力的重要方法。因此，許多研究者通過(guò)在精液稀釋液中嘗試添加一些具有抗氧化功能的物質(zhì)來(lái)提高精液保存質(zhì)量。

冷凍保存時(shí)，白藜蘆醇對(duì)馬精子質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)與功能具有顯著的保護(hù)作用，白藜蘆醇也可以改善山羊凍精質(zhì)量，本研究在驢精液低溫稀釋液中添加白藜蘆醇，同樣能到達(dá)提升精液保存質(zhì)量的效果。在豬常溫保存的精液中，添加50 μmol/L 白藜蘆醇后精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性均較好，而添加高濃度白藜蘆醇反而降低了精液品質(zhì)，對(duì)精子表現(xiàn)出了一定的毒副作用，但本研究結(jié)果表明，盡管在添加200 μmol/L高濃度的白藜蘆醇時(shí)，精液質(zhì)量低于100 μmol/L 白藜蘆醇組，但其精液質(zhì)量仍然高于未添加組，造成這一差異的原因可能是不同動(dòng)物精子受白藜蘆醇的影響程度不同。

在豬精液稀釋液中添加0.06～0.08 g/L 綠原酸的精子活率和質(zhì)膜完整性最佳，且顯著高于未添加組，本研究同樣發(fā)現(xiàn)在驢精液低溫稀釋液中添加0.06 g/L 綠原酸，其保存的效果最好。綠原酸能夠調(diào)控氧化還原電位，進(jìn)而影響整個(gè)細(xì)胞代謝，而不恰當(dāng)?shù)木G原酸濃度會(huì)打破這種生理平衡，從而影響精子運(yùn)動(dòng)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，第7 天時(shí)，0.12 g/L 綠原酸組精液質(zhì)量明顯低于0.06 g/L 綠原酸組，且與0 g/L 綠原酸組相比精液質(zhì)量相差不大，說(shuō)明高濃度的綠原酸削弱了其對(duì)精液質(zhì)量的改善作用，對(duì)精子可能有一定的毒害作用。

3.2 白藜蘆醇、綠原酸對(duì)精液SOD 活性的影響 在精子的抗氧化系統(tǒng)中，SOD 是清除ROS 的首要物質(zhì)，SOD 活性在一定程度上反映精液的抗氧化能力水平。精液中添加適宜的抗氧化劑能夠改善SOD 活性，維持正常的精子功能。本研究結(jié)果表明，驢精液低溫稀釋液中添加白藜蘆醇，保存第5、7 天時(shí)，100 μmol/L 白藜蘆醇組SOD 活性均高于其他組，這與該濃度下精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性最高的結(jié)果一致。在保存第1、3、5 天，添加綠原酸組的SOD 活性表現(xiàn)出一定波動(dòng)，但第7 天時(shí)SOD 活性明顯下降，這表明在保存早期綠原酸可能對(duì)維持精液SOD 活性的效果更好。

植物多酚發(fā)揮抗氧化功能的途徑多樣，不僅能夠通過(guò)激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路進(jìn)行，調(diào)控下游抗氧化基因的表達(dá)及SOD、CAT、GSH-Px 等酶的合成水平，還可以通過(guò)提高抗氧化酶活性、增加非酶抗氧化物含量來(lái)完成。另外抗氧化劑可以和周圍的氧結(jié)合發(fā)生還原反應(yīng)，降低精液中的氧含量，與氧化過(guò)程的中間產(chǎn)物結(jié)合吸附自由基、阻止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，阻斷氧化反應(yīng)。研究證實(shí)，白藜蘆醇對(duì)ROS 的生成具有一定的抑制作用，可通過(guò)親電反應(yīng)元件激活Nrf2 或直接中和ROS 來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)。綠原酸含有活性羥基與羧基，不僅可以通過(guò)提供氫自由基來(lái)有效消除活性氧和羥基自由基，降低對(duì)精子的氧化損傷，保持精子結(jié)構(gòu)、功能完整性，也能夠通過(guò)谷胱甘肽等途徑上調(diào)抗氧化酶活性。晁婭梅等研究表明，茶多酚添加到豬日糧中，肝臟的GSH-Px 活性及總抗氧化能力提高，但等基因表達(dá)降低。本試驗(yàn)中，分別添加不同劑量的白藜蘆醇、綠原酸后，在精液低溫保存第1 天，與不添加抗氧化劑組相比，稀釋液中添加抗氧化劑均會(huì)不同程度地降低SOD 活性，說(shuō)明在添加抗氧化劑的早期，抗氧化作用可能主要通過(guò)影響SOD 活性以外的方式進(jìn)行，因此對(duì)抗氧化劑在精液低溫保存時(shí)的抗氧化能力需要更為系統(tǒng)的研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新疆驢精液稀釋液中添加白藜蘆醇、綠原酸可提高精子低溫保存活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和精液SOD 活性。在精液稀釋液中分別添加100 μmol/L 白藜蘆醇、0.06 g/L 綠原酸對(duì)新疆驢精子的低溫保存效果最好。