田俊杰，李 抗，王帥杰，譚子涵，汪曼麗，寧 楠，王 蕾,2，趙 迪,2，郭雙雙,2，侯永清,2*

（1.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

短鏈甘油三酯是指由1 個甘油和3 個短鏈脂肪酸經(jīng)過酯化形成的三酰甘油酯，在維持仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能方面有著重要的作用。一般把含有1～6 個碳原子組成碳鏈的脂肪酸稱為短鏈脂肪酸，食用后過胃而不分解，進(jìn)入腸道后在胰脂肪酶和膽汁的相互作用下形成水溶性的乳糜微粒，然后緩慢釋放出對應(yīng)的短鏈脂肪酸和甘油。在不添加外源短鏈脂肪酸的情況下，短鏈脂肪酸是單胃動物大腸細(xì)菌代謝的主要終產(chǎn)物，主要由厭氧微生物發(fā)酵難消化的碳水化合物而產(chǎn)生。短鏈脂肪酸被腸道快速吸收，既能儲存能量又能降低滲透壓。短鏈脂肪酸對維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)功能具有非常重要的作用。短鏈脂肪酸還能增強(qiáng)腸道對Na的吸收。Macia 等研究表明，短鏈脂肪酸可以調(diào)節(jié)胃腸道的pH，緩解斷奶產(chǎn)生的腸道屏障功能損傷，抑制有害菌的生長和促進(jìn)益生菌的生長，具有免疫調(diào)節(jié)作用。也有研究證明，短期靜脈注射短鏈脂肪酸可以促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖，三己酸甘油酯具有良好的水溶性，非腸道注射時也可以在小腸內(nèi)迅速水解。日糧中添加乳酸可以有效抑制致病菌的生長，促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育。三乳酸甘油酯在胃腸道中分解為乳酸和甘油，是很好的腸道乳酸來源。短鏈脂肪酸酯作為短鏈脂肪酸的供應(yīng)形式，是具有廣闊開發(fā)前景的飼料添加劑。本實驗室前期研究結(jié)果表明，日糧中添加0.5%三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯對斷奶仔豬的生長性能沒有顯著影響，但是降低了腹瀉率。本研究采用基因芯片技術(shù)和RT-qPCR 法分析了三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯對斷奶仔豬空腸黏膜基因表達(dá)的調(diào)控作用，為其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯（純度均為95%）為市售產(chǎn)品，試驗日糧購于武漢新農(nóng)翔飼料有限公司。斷奶仔豬購于武漢綠色巨農(nóng)農(nóng)牧股份有限公司黃陂分公司。

1.2 試驗設(shè)計和日糧 選取24 頭（21±2）日齡、體重（6.20±0.45）kg 的健康杜× 長× 大斷奶仔豬，按單因素試驗設(shè)計隨機(jī)分為3 組，每組8 個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，三己酸甘油酯組和三乳酸甘油酯組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%三己酸甘油酯和0.5%三乳酸甘油酯?；A(chǔ)日糧參照NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要（8～20 kg）配制，日糧的組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 進(jìn)豬前對欄舍進(jìn)行打掃、消毒和熏蒸。整個試驗期間豬舍室內(nèi)溫度保持在22～25℃，仔豬在不銹鋼代謝籠中單籠飼養(yǎng)，舍頂有通風(fēng)扇定時通風(fēng)，自由采食，鴨嘴式飲水器自動供水，養(yǎng)殖期間豬舍定期每天定時清掃，早、晚各消毒1 次。

1.4 樣品采集 在試驗第21 天，每頭豬按照80 mg/kg體重的劑量注射10% 戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。屠宰后立即取空腸中間長約10 cm 的腸段，用預(yù)冷的生理鹽水將腸黏膜輕輕沖洗，然后用無菌載玻片刮取腸黏膜，分裝在無RNA 酶的1.5 mL EP 管中，立即投入液氮速凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 空腸黏膜總RNA 的提取 將空腸黏膜在液氮中研磨，取約100 mg 樣品，按照RNAiso Plus（TaKaRa，大連）試劑的提取說明書操作，提取總RNA。用Nanodrop ND-2000 UV-VIS 核酸蛋白檢測儀在波長260 nm 下檢測RNA 的濃度，吸光值A(chǔ)/A的范圍為1.8～2.2。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA 的完整性（28S/18S rRNA ≥1.8）。

1.5.2 基因芯片分析 依照Agilent 基因表達(dá)譜芯片（單標(biāo)）操作指南，對總RNA 進(jìn)行純化，將OD/OD約為2.0 且未降解的樣本生成標(biāo)記靶標(biāo)，按照Afymetrix WT（Afymetrix,Santa Clara，CA，USA）加標(biāo)記分析方法用純化的總RNA 合成含有標(biāo)記的單鏈片段cDNA（100～500 ng）。cDNA 作為模板與豬的基因芯片在48℃下雜交20 h 后，流體工作站清洗陣列，然后在GeneAtlas 系統(tǒng)中的成像工作站掃描陣列。掃描后，利用Afymetrix 命令控制臺軟件1.4 版從圖像數(shù)據(jù)中提取豬基因芯片的強(qiáng)度數(shù)據(jù)，然后用Afymetrix 轉(zhuǎn)錄組分析控制臺軟件4.0 對基因表達(dá)譜和基因進(jìn)行歸一化分析。在差異顯著性＜0.05 的情況下，以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）≥1.5 為標(biāo)準(zhǔn)選篩選差異基因。其次，構(gòu)建韋恩圖用于比較各處理組間的差異表達(dá)基因數(shù)量。再次，用 Reactome Pathway Database（https://reactome.org/）對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，獲得被顯著影響的前10 個信號通路。

1.5.3 實時熒光定量PCR 法測定基因表達(dá) 總RNA 的提取方法如1.5.1 所述，RNA 反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）試劑盒的說明書進(jìn)行。合成cDNA 后使用實時熒光定量PCR的方法對相關(guān)的基因進(jìn)行檢測。以RPL4 為內(nèi)參基因，各基因的相對表達(dá)量通過歸一法以相對于對照組的表達(dá)量表示。檢測基因：①細(xì)胞生長相關(guān)基因為雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（）、蛋白激酶B（）、表皮生長因子（）；②炎癥和病毒相關(guān)基因為c-Jun 氨基末端激酶（）、干擾素-（-）、白細(xì)胞介素（）、干擾素誘導(dǎo)因子（）；③物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因為囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（）、鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（）、鈉離子依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（）。檢測基因所需的引物（表2）由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表2 RT-qPCR 法中基因的引物序列

1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析進(jìn)行組間分析，當(dāng)差異顯著時用Duncan's 多重比較進(jìn)行分析。以＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)譜分析 如圖1 所示，與對照組相比，三己酸甘油酯組有71 個差異表達(dá)基因，其中46 個上調(diào)基因，25 個下調(diào)基因；三乳酸甘油酯組有40 個差異基因，其中11 個基因上調(diào)，29 個基因下調(diào)。2 組共有的上調(diào)基因有3 個，下調(diào)基因有4 個。各組前10 個差異表達(dá)的基因見表3～6。三己酸甘油酯組主要上調(diào)了與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因（如等），下調(diào)了細(xì)胞氨基酸及其衍生物代謝（如等）和脂類代謝相關(guān)（如等）的基因。三乳酸甘油酯組主要上調(diào)了與細(xì)胞免疫（如等）相關(guān)的基因，下調(diào)了細(xì)胞氨基酸及其衍生物代謝（如等）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（如等）相關(guān)的基因。

表3 三己酸甘油酯組前10 個差異上調(diào)表達(dá)基因

圖1 差異表達(dá)基因的韋恩圖（A 為上調(diào)基因，B 為下調(diào)基因）

2.2 信號通路的聚類分析 如圖2 所示，三己酸甘油酯組差異表達(dá)基因參與的信號通路主要集中在脂類代謝、一氧化氮代謝、細(xì)胞氨基酸及其衍生物的代謝、細(xì)胞免疫等方面。三乳酸甘油酯組的差異表達(dá)基因未富集出信號通路。

圖2 三己酸甘油酯組差異表達(dá)基因的富集分析

2.3 利用RT-qPCR 法檢測空腸基因的表達(dá) 如表7 所示，與對照組相比，三己酸甘油上調(diào)了空腸的 mRNA 水平（＜0.05)，下調(diào)了空腸-的mRNA 水平（＜0.05）；三乳酸甘油酯組上調(diào)了空腸和的mRNA 水平（＜0.05)，下調(diào)了空腸-的mRNA 水平。

表7 三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯對空腸相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響

3 討 論

腸道不僅是消化代謝的場所，還關(guān)系著仔豬的健康，維持腸道的健康狀態(tài)對仔豬的生長發(fā)育具有重要意義。本課題組前期研究已經(jīng)證實，三乳酸甘油酯和三己酸甘油酯對仔豬腸道黏膜屏障、免疫等功能具有很好的保護(hù)作用。本次試驗在前期研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)探究三乳酸甘油酯和三己酸甘油酯對仔豬腸道的作用機(jī)制。三乳酸甘油酯通常被作為飼料酸化劑而廣泛使用，在腸道中被分解為乳酸繼續(xù)參與腸道代謝循環(huán)。乳酸有利于家畜和家禽特別是幼齡動物的生長，乳酸主要作為飼料中的酸化劑，激活消化酶，促進(jìn)腸道的消化和發(fā)育。三己酸甘油酯容易被腸道吸收，在小腸中分解為甘油和己酸，它們可以作為燃料為腸道的各種生理活動提供能量，還可以降低腸道滲透壓，促進(jìn)腸道對鈉離子的吸收。己酸具有良好的脂溶性，可以破壞腸道中有害病菌的細(xì)胞膜，發(fā)揮重要的抗菌作用。Wu 等研究表明，日糧中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯可以增加仔豬腸道吸收功能（提高了水通道蛋白8 和10 基因的表達(dá)量）、增強(qiáng)了抗氧化免疫能力（核因子E2 相關(guān)因子2、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和谷胱甘肽過氧化物酶的基因表達(dá)量上調(diào)）和上皮細(xì)胞的生長和存活能力。本試驗基因芯片結(jié)果顯示，短鏈脂肪酸甘油酯主要影響了空腸脂類代謝、細(xì)胞氨基酸及其衍生物的代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫和疾病相關(guān)的生物過程，表明三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯對仔豬的空腸脂質(zhì)代謝、免疫和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等重要功能發(fā)揮了調(diào)控作用。本試驗KEGG富集結(jié)果也顯示，差異基因主要參與脂類代謝、細(xì)胞氨基酸及其衍生物的代謝、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等生物過程，這可能是三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯對仔豬腸道健康發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵途徑。

表4 三己酸甘油酯組前10 個差異下調(diào)表達(dá)基因

表5 三乳酸甘油酯組前10 個差異上調(diào)表達(dá)基因

表6 三乳酸甘油酯組前10 個差異下調(diào)表達(dá)基因

正常情況下，與其受體結(jié)合從而激活酪蛋白激酶，發(fā)揮其生物功能，如促進(jìn)細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。Yang 等研究表明，可以促進(jìn)小豬空腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，日糧中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯，上調(diào)了空腸基因的表達(dá)，這可能會促進(jìn)腸道小肽的吸收，改善仔豬生長?；虻纳险{(diào)可以激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進(jìn)絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化來調(diào)控腸道細(xì)胞的生長、增殖和凋亡。三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯通過上調(diào)仔豬空腸基因?qū)δc道能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面有積極作用。

在調(diào)控仔豬肥胖和脂肪代謝方面具有重要作用。研究表明，會在高糖高脂和炎癥因子的刺激下提高表達(dá)量，從而影響胰島因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究結(jié)果表明，日糧中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯上調(diào)了基因的表達(dá)。的高表達(dá)可以抑制蛋白質(zhì)的合成來達(dá)到抑制病毒表達(dá)的目的，可以作為細(xì)胞防御病毒入侵的第一道防線，緩解病毒給仔豬腸道帶來的損傷。是細(xì)胞由正常狀態(tài)向病理狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中的一個重要的調(diào)節(jié)激酶，既能促進(jìn)細(xì)胞增殖也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中，三己酸甘油酯或三乳酸甘油酯的添加上調(diào)了基因的表達(dá)，這表明它們可能通過對空腸細(xì)胞生長增殖以及免疫功能的調(diào)控來維持仔豬腸道的健康。家族的主要功能是抗病毒感染，而被認(rèn)為是病毒誘發(fā)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)和細(xì)胞抗病毒應(yīng)答的主要調(diào)控基因。有研究表明，高表達(dá)的可抑制細(xì)胞的翻譯，從而抵御病毒的增殖和侵襲。和-在病毒入侵引起的感染和炎癥反應(yīng)中起重要作用?？梢蕴岣咧行粤＜?xì)胞介導(dǎo)的吞噬、殺傷活性，可以干擾病毒復(fù)制，特異性殺傷病毒感染的細(xì)胞。本研究表明，三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯上調(diào)和下調(diào)-以及三乳酸甘油酯上調(diào)可能是其提高斷奶仔豬抗病毒能力的一種作用途徑。

KEGG 富集分析和RT-qPCR 分析的結(jié)果顯示，日糧中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯調(diào)控了物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)。氨基酸作為仔豬生長必需的物質(zhì)，不管在營養(yǎng)還是生理意義上都是必不可少的。是一種廣譜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以轉(zhuǎn)運(yùn)多種中性氨基酸。越來越多的研究表明，不僅能作為氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，還可以調(diào)節(jié)許多體內(nèi)的代謝活動，如作為主要的氮轉(zhuǎn)運(yùn)載體參加氧化代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)參與合成代謝的氨基酸濃度等。本研究中，三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯上調(diào)了基因表達(dá)，這表明2 種添加劑促進(jìn)了仔豬腸道氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。李紅宇等研究表明，可以調(diào)節(jié)脂肪酸合成因子的表達(dá)，影響體內(nèi)脂質(zhì)的生成過程。葡萄糖更是機(jī)體不可或缺的重要物質(zhì)，本研究中，三己酸甘油酯上調(diào)了的表達(dá)，這表明它可促進(jìn)腸道葡萄糖的吸收，提高能量攝取水平。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、利用和吸收效率的提升可以更好地促進(jìn)仔豬生長。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，日糧中添加0.5%三己酸甘油酯或三乳酸甘油酯可調(diào)控斷奶仔豬空腸脂質(zhì)代謝、細(xì)胞免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸及其衍生物的代謝等相關(guān)基因的表達(dá)，可能通過改善空腸脂質(zhì)代謝、免疫力和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力發(fā)揮對斷奶仔豬腸道健康的保護(hù)作用。