烏日娜，徐 舶，石鳳翎

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院,草地資源教育部重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

扁蓿豆(Medicagoruthenica)別名花苜蓿、野苜蓿等，是豆科(Leguminosae)苜蓿屬(Medicago)多年生草本植物[1]，主要分布于我國北方的高山及典型和荒漠化草原[2]，在草地改良、生態(tài)治理及草產(chǎn)業(yè)開發(fā)等多個領(lǐng)域都極具應(yīng)用潛力，具有重要的生態(tài)意義。扁蓿豆?fàn)I養(yǎng)價值較高，是一種比紫花苜蓿營養(yǎng)利用效率更高的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料，還具有較好的抗寒性、抗旱性、耐鹽堿性[3]，能夠在惡劣環(huán)境(寒冷、干旱、石質(zhì)化環(huán)境等)中生存[4]，因此可以作為改良苜蓿屬牧草及其他牧草抗逆性的優(yōu)質(zhì)基因資源。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于扁蓿豆的研究多集中在其對鹽堿、干旱、重金屬等非生物脅迫的響應(yīng)[2]、種質(zhì)遺傳多樣性評價與分析[5]及抗性基因挖掘、克隆和功能驗證[6]等方面，對其新型分子標(biāo)記的研究相對較少[7]。當(dāng)前，在扁蓿豆中應(yīng)用的簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記多來自紫花苜蓿基因組文庫[8]，但不同屬或族的物種間轉(zhuǎn)錄區(qū)存在一定程度的變異[9]，能夠在不同屬或族通用的標(biāo)記數(shù)量有限[5]，因而為滿足扁蓿豆種質(zhì)資源鑒定及改良的需求，有必要開發(fā)針對其的新型分子標(biāo)記。

SSR又稱微衛(wèi)星，是由1～6個核苷酸組成的短串聯(lián)DNA重復(fù)序列，具有高度保守的側(cè)翼區(qū)域和高度可變的重復(fù)次數(shù)[10]，是一種具有豐富多態(tài)性和多等位性的共顯性標(biāo)記，已經(jīng)被廣泛用于種質(zhì)遺傳多樣性分析和標(biāo)記輔助選擇育種[11]。利用高通量測序技術(shù)開發(fā)SSR引物在紫花苜蓿[12]、蘇丹草[13]、高加索三葉草[14]、紅三葉[15]、老芒麥[16]、鴨茅[17]等牧草中均有報道，但在扁蓿豆上尚未見相關(guān)的研究。本研究基于直立型扁蓿豆(Medicagoruthenica‘Zhilixing’)的轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果，對分布于轉(zhuǎn)錄組上的SSR位點信息組成及其序列特征進(jìn)行分析，以期為扁蓿豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、SSR 引物設(shè)計與篩選、系統(tǒng)親緣關(guān)系及分子輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

直立型扁蓿豆，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)利用多次混合選擇法培育而成，試驗所用種子采集于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)新區(qū)牧草地。將扁蓿豆種子用濃H2SO4浸泡5～8 min破除硬實，在育苗盤中萌發(fā)，放置于溫室中，統(tǒng)一進(jìn)行精細(xì)管理。待幼苗生長到6～8葉期時，每株取第4或5片完全展開葉片混合后放入液氮速凍，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建、測序與拼接 利用天根提取試劑盒提取直立型扁蓿豆葉片總RNA，用TruSeqTM RNA sample preparation Kit試劑盒建立RNA文庫。文庫質(zhì)量檢測合格后，用北京諾禾致源生物信息科技有限公司Illumina HiSeq X Ten測序平臺進(jìn)行高通量測序。對測序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過濾后得到干凈讀數(shù)(clean reads)。因直立型扁蓿豆無參考基因組，需先對干凈讀數(shù)進(jìn)行拼接，獲得參考序列后進(jìn)行下一步分析。用拼接軟件Trinity[18]依次對大量的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行高效穩(wěn)定地拼接，對得到的直立型扁蓿豆葉片轉(zhuǎn)錄本序列用Corset方法進(jìn)行層次聚類，將獲得的最長Cluster序列(Unigene)作為后續(xù)分析的參考序列。

1.2.2 SSR的篩選和統(tǒng)計分析 使用軟件MISA 1.0版(http://pgrc.ipk- gatersleben.de/misa/misa.html)對直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組的非冗余Unigene進(jìn)行SSR位點搜索。其中，單、二、三、四、五、六核苷酸基序(motif unit size)至少重復(fù)次數(shù)分別為10，6，5，5，5，5；復(fù)合型(compound)核苷酸兩個位點間距離小于150 bp[19]。將生成的數(shù)據(jù)MISA文本用Microsoft Excel 2021進(jìn)行整理，對序列特征進(jìn)行分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR分析

表1顯示，直立型扁蓿豆經(jīng)高通量測序后，共得到308 449條非冗余Unigene，平均長度為922.20 bp，總長度為284 452 737 bp。按照搜索標(biāo)準(zhǔn)對308 449條Unigene進(jìn)行篩選，共搜索到89 688個SSR位點，SSR位點的出現(xiàn)頻率為29.08%；含SSR位點的序列數(shù)目有67 012條，SSR位點的發(fā)生頻率為21.73%。同時，搜索到包含復(fù)合型SSR位點的Unigene序列9 527條，占Unigenes 序列總數(shù)的3.09%；搜索到包含1個以上SSR位點的Unigene序列有16 270條，占Unigenes 序列總數(shù)的5.27%。

表1 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組中SSR搜索分析結(jié)果Table 1 Analysis of SSR in transcriptome of M. ruthenica ‘Zhilixing’

2.2 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型分析

由表2可知，直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點重復(fù)類型豐富，且各重復(fù)類型的SSR 數(shù)量、所占比例和出現(xiàn)頻率相差較大。單核苷酸重復(fù)所占比例和出現(xiàn)頻率最高，分別為59.89%和17.41%；三核苷酸重復(fù)次之，所占比例和出現(xiàn)頻率分別為20.72%和6.03%；四、五、六核苷酸的SSR數(shù)量相對較少，其中六核苷酸重復(fù)最少，其所占比例和出現(xiàn)頻率分別為0.22%和0.06%。單核苷酸重復(fù)的SSR數(shù)量約是三核苷酸重復(fù)的3倍，約是六核苷酸重復(fù)的271倍。從SSR位點的總體分布情況來看，6種重復(fù)類型的分布距離具有明顯差異，每5.30 kb出現(xiàn)1個單核苷酸SSR位點，每1 436.63 kb出現(xiàn)1個六核苷酸SSR位點，平均每3.17 kb就出現(xiàn)1個SSR位點。

表2 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型的數(shù)量和分布特點Table 2 Number and distribution characteristics of SSR repeat types in transcriptome of M. ruthenica ‘Zhilixing’

2.3 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元類型和比例

由表3可知，在直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組中檢測到由159種重復(fù)基元構(gòu)成的89 688條SSR，出現(xiàn)總頻率為29.08%，單、二、三、四、五、六等6種核苷酸重復(fù)類型數(shù)逐漸增加，分別為2，4，10，29，49，65，出現(xiàn)頻率為0.01%～17.01%，而SSR位點數(shù)量呈下降趨勢。在各核苷酸重復(fù)基元類型中，單核苷酸中的主要重復(fù)基元為A/T(52 466個)，占比高達(dá)58.50%，出現(xiàn)頻率17.01%；二核苷酸中的AG/CT數(shù)量最多(7 432個，占比8.29%)，其次為AT/AT(5.33%)、AC/GT(3.51%)； 三核苷酸中的優(yōu)勢基元為AAG/CTT(4.82%)、AAT/ATT(3.90%)、AAC/GTT(3.77%)、ATC/ATG(2.94%)；四核苷酸中的優(yōu)勢基元為AAAT/ATTT(0.33%)和AAAG/CTTT(0.18%)；五核苷酸中的優(yōu)勢基元為AAGAG/CTCTT(0.06%)；六核苷酸數(shù)量較少，其各類型重復(fù)基元所占比例均不高于0.01%。總體而言，四、五、六核苷酸重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率均較低(≤0.10%)，6種重復(fù)基元類型中以六核苷酸重復(fù)基元種類最多(65種)，而單核苷酸重復(fù)基元數(shù)量最多(53 710個)。

2.4 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)和分布

從直立型扁蓿豆6種核苷酸的SSR位點重復(fù)次數(shù)分布結(jié)果(表4)可以看出，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，重復(fù)基元數(shù)量總體呈下降趨勢。其中單核苷酸基元重復(fù)次數(shù)主要集中在10～15次，主要重復(fù)基元占比為84.81%；二核苷酸基元重復(fù)次數(shù)主要集中在6～12次，主要重復(fù)基元占比為73.93%；三核苷酸基元重復(fù)次數(shù)主要集中在5～8次，主要重復(fù)基元占比為90.21%。單、二、三核苷酸主要重復(fù)基元數(shù)量共占總SSR位點數(shù)的82.21%；四、五、六核苷酸的基元重復(fù)次數(shù)主要集中在低重復(fù)水平(≤6次)，其主要重復(fù)基元數(shù)量分別為1 183，402和181，占總SSR的比例分別為1.32%，0.45%和0.20%。

表3 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組中SSR的重復(fù)基元類型及數(shù)量Table 3 Type and number of SSRs repeat motifs of M. ruthenica ‘Zhilixing’

表4 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR不同基元的重復(fù)次數(shù)Table 4 Repeat times of different SSR motifs of M. ruthenica ‘Zhilixing’

由表4可見，直立型扁蓿豆SSR整體重復(fù)次數(shù)主要集中在6～15次(重復(fù)次數(shù)為15次的SSR位點為2 814個)，共68 514個SSR位點(占比76.39%)；1～5次低重復(fù)次數(shù)的SSR位點為10 198個(占比11.37%)；重復(fù)次數(shù)>15次的SSR位點有10 976個(占比12.24%)?？傮w來看，直立型扁蓿豆SSR重復(fù)以中度重復(fù)為主，較高重復(fù)次數(shù)次之，低重復(fù)次數(shù)相對較少。

2.5 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR長度分布

過濾掉長度<12 bp的片段后，對直立型扁蓿豆不同基序的SSR長度進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)類型的SSR長度分布Table 5 Length distribution of SSR different repeat types in transcriptome of M. ruthenica ‘Zhilixing’

由表5可知，直立型扁蓿豆SSR長度為12～482 bp。二核苷酸SSR長度主要集中在12～24 bp，此長度范圍SSR數(shù)占二核苷酸SSR總數(shù)的73.79%，平均長度為45 bp；三核苷酸SSR長度為15～90 bp，平均長度49 bp,其中長15 bp的核苷酸數(shù)量高達(dá)6 988個，占三核苷酸總數(shù)的47.52%；四、五、六核苷酸重復(fù)中SSR長度分別為20～84，25～70和30～72 bp，平均長度分別為36，43和51 bp，其占比最大的SSR長度分別為20 bp(826個，65.30%)，25 bp(347個，86.75%)，30 bp(131個，83.29%)。此外，直立型扁蓿豆中檢測到的復(fù)合型SSR核苷酸長度主要集中在20～120 bp，其數(shù)量占復(fù)合型SSR總數(shù)的87.94%。

圖1顯示，過濾掉小片段后，直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組的SSR長度主要集中在12～120 bp，其數(shù)量為37 327條，占SSR總數(shù)(89 688條)的41.62%，其中數(shù)量最多的是長度為15 bp的三核苷酸重復(fù)(共6 988條，占比7.79%)。在搜索到的這些SSR位點中，長度在12～20 bp 的SSR有17 919條，占SSR總數(shù)的 44.99%；長度在21～40 bp的SSR數(shù)量次之，為11 690條，占SSR總數(shù)的10.57%；長度在200 bp以上的SSR有145條，占SSR總數(shù)的0.16%。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，長度在20 bp以上的SSR共有20 557條，占SSR總數(shù)的22.92%，推測這部分長度較大的序列可能具有較高的多態(tài)性潛能。

圖1 直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組中SSR基序長度分布Fig.1 SSR motif length distribution in transcriptome of M. ruthenica ‘Zhilixing’

3 討論與結(jié)論

高通量測序技術(shù)的發(fā)展為新基因發(fā)掘、功能基因鑒定和分子標(biāo)記的開發(fā)提供了一條快速途徑[20 ]。本研究通過對直立型扁蓿豆葉片的高通量測序，共計得到非冗余序列Unigene 308 449條，總長度為284 452 737 bp。從所有Unigene中共搜索到SSR位點89 688個，SSR出現(xiàn)頻率為29.08%，低于瞿麥(48.05%)[21]和橡膠草(35.2%)[22]，高于草原1號雜花苜蓿(20.03%)[23]、蒙農(nóng)紅豆草(15.42%)[24]、蘇丹草(16.82%)[13]、夏枯草(27.5%)[25]。直立型扁蓿豆SSR平均分布距離為3.17 kb，低于夏枯草(5.93 kb)[25]、蒙農(nóng)紅豆草(5.86 kb)[24]、草原1號雜花苜蓿(5.84 kb)[23]，高于瞿麥(2.96 kb)[21]和橡膠草(1.86 kb)[22]。此外，直立型扁蓿豆的SSR平均分布距離與同為豆科屬植物的高加索三葉草的SSR平均分布距離(3.47 kb)[14]極為接近，與草原1號雜花苜蓿(5.84 kb)[23]、蒙農(nóng)紅豆草的平均分布距離(5.86 kb)[24]差異相對較大，利用這些數(shù)據(jù)可以開發(fā)豆科牧草相關(guān)的新分子標(biāo)記。

大多數(shù)基于植物轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的SSR以單、二、三核苷酸重復(fù)基元為主，但是主導(dǎo)重復(fù)基元類型無明顯的規(guī)律，這主要是因為SSR搜索的結(jié)果受物種差異和搜索標(biāo)準(zhǔn)等因素的影響[26]。本研究中，單核苷酸(59.89%)是直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR的主要重復(fù)基元類型，其次為三核苷酸(20.72%)和二核苷酸(17.22%)，這與在高加索三葉草[11]、雜花苜蓿[23]、紫花苜蓿[27]、瞿麥[21]上的研究結(jié)果一致，而與在火焰蘭[28](以二和三核苷酸為主)，蒙農(nóng)紅豆草[24]、青藏扁蓿豆[5](均以三核苷酸為主)，夏枯草[25]、溪黃草[29](均以二核苷酸為主)上的研究結(jié)果不一致。在本研究搜索到的SSR位點中，單、二核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢基元分別為A/T和AG/CT，這與對草原1號雜花苜蓿[23]的研究結(jié)果一致，但三核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢基元(AAG/CTT)有所不同，利用這一差異可以開發(fā)出具有扁蓿豆特異性的SSR新位點。

高度豐富的多態(tài)性是SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用價值所在，而這取決于基元重復(fù)次數(shù)和≥20 bp片段的多少[25]。本研究中，SSR整體重復(fù)次數(shù)主要集中在6～15次，共68 514條，占SSR總數(shù)的76.39%，重復(fù)次數(shù)>15的SSR 10 976條，占SSR總數(shù)的12.24%。其中，三核苷酸重復(fù)次數(shù)類型和跨度相對較多，推測這些SSR具有更豐富的多態(tài)性。在基元長度方面，直立型扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組SSR長度主要集中在12～120 bp，長度在20 bp以上的SSR位點有20 557條，占22.92%，這些SSR位點可能更適合作為扁蓿豆的分子標(biāo)記。

本研究基于直立型扁蓿豆葉片轉(zhuǎn)錄組的高通量測序數(shù)據(jù)，檢索到89 688個SSR位點，對其序列特征、基元重復(fù)次數(shù)和類型、基元長度等進(jìn)行了分析，獲得了具有高度多態(tài)性的SSR位點，這對扁蓿豆SSR新型實用標(biāo)記的開發(fā)及扁蓿豆的遺傳多樣性、種質(zhì)資源收集與評價、品種鑒定和育種等有重要意義。