吳璐瑤，張 卓，孔 曉，金德才，高丹蕾，袁 濤

(1 北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省植物保護(hù)研究所，湖南省園藝作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410125；4 青島大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島266021；5 中國(guó)科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085)

大葉黃楊(Euonymusjaponicus)為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠灌木，又名冬青衛(wèi)矛、日本衛(wèi)矛等，其分布廣、抗性強(qiáng)、耐修剪、易繁殖，是園林中常用的綠籬樹種。大葉黃楊白粉病是大葉黃楊主要真菌病害之一，近年來(lái)發(fā)生比較普遍，部分地區(qū)病葉率高達(dá)38%[1]。大葉黃楊白粉病病原菌是白粉菌科的Erysiphealphitoides[2-3]，它常寄生在枝葉表面形成白色粉末狀病斑，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致病葉卷曲、皺縮，枝梢扭曲變形，極大影響大葉黃楊的健康生長(zhǎng)及景觀效果。目前大葉黃楊白粉病的主要防治手段是采用殺菌劑及栽培管理。杜津釗等[4]評(píng)價(jià)了15種殺菌劑對(duì)大葉黃楊白粉病的藥效；劉興元[5]提出通過(guò)加強(qiáng)栽培管理，控制栽植密度增強(qiáng)樹勢(shì)，結(jié)合修剪整形及時(shí)除去病葉、病梢等提高大葉黃楊的抗病力。針對(duì)大葉黃楊白粉病生物防治的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此大葉黃楊葉內(nèi)生細(xì)菌群落對(duì)白粉病感染的響應(yīng)效應(yīng)值得深入研究。

植物內(nèi)生菌是指生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各個(gè)組織，不引起宿主植物明顯病害癥狀，與植物互利共生的真菌或細(xì)菌[6-7]。葉內(nèi)生菌與葉表附生微生物一起被稱為葉圈微生物[8-9]，其與植物光合和蒸騰作用及葉部病害息息相關(guān)，是植物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[10]。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)可以增強(qiáng)宿主植物的抗病性。Arnold等[11]發(fā)現(xiàn)，可可豆(Theobromacacao)幼苗受到疫霉屬(Phytophthorasp.)病菌侵襲時(shí)，將從自然感染的無(wú)癥狀寄主中分離的內(nèi)生菌接種無(wú)內(nèi)生菌的葉片可以顯著降低葉片死亡率。有研究發(fā)現(xiàn)，從中國(guó)南海紅樹中分離的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生抑制酵母菌和霉菌灰的黃霉素A和多種醌類抗生素[12]；從大戟(Euphorbiapekinensis)新鮮葉片中分離得到的鐮刀菌E5能使宿主對(duì)枯草桿菌(Bacillussubtilis)、輪梗霉、裂殖酵母及腐霉產(chǎn)生拮抗作用[13]。

在植物內(nèi)生菌研究中，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法受不可培養(yǎng)的內(nèi)生菌的限制，而高通量測(cè)序技術(shù)成本低廉、覆蓋度深，近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用。如Kumaresan等[14]借助高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，紅樹(Rhizophoraapiculata)隨著葉齡的增加內(nèi)生菌豐富度呈增加趨勢(shì)，且某些內(nèi)生菌在凋落物降解中有重要作用。本研究采集北京市綠化帶內(nèi)大葉黃楊健康葉片與白粉病葉片，利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)分析大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落特征及其互作關(guān)系，確定群落的關(guān)鍵種，以探究大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落對(duì)白粉病入侵的響應(yīng)情況。

1 材料與方法

1.1 葉片采集

2017年12月，從北京市海淀區(qū)林大北路中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心西門大葉黃楊綠化帶5 m×1 m區(qū)域內(nèi)分別采集大葉黃楊健康葉片(healthy leaves，HL)和感染白粉病葉片(diseased leaves,DL)各90片，每組葉片隨機(jī)分成9個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10片。DL白色病斑面積超過(guò)葉面積50%，HL無(wú)病斑。采集的葉片一部分保存于4 ℃冰箱用于葉片理化性質(zhì)的測(cè)定，另一部分保存于-80 ℃冰箱用于檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌種類。

1.2 大葉黃楊葉片理化成分的測(cè)定

采用水楊酸比色法[15]測(cè)定葉片硝酸鹽含量，采用蒽酮比色法[16]測(cè)定葉片可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[17]測(cè)定葉片可溶性蛋白質(zhì)含量，采用丙酮萃取法[18]測(cè)定葉片葉綠素含量。

1.3 大葉黃楊葉片內(nèi)生菌16S rRNA 的PCR擴(kuò)增和Illumina測(cè)序

將HL、DL用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡10 min，25 g/L NaClO溶液浸泡10 min，無(wú)菌水清洗5次，以防止葉片表面的微生物影響測(cè)量結(jié)果。使用Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedals,Santa Ana,USA)提取葉片總DNA。采用通用引物799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1115R(5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′)，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V5-V6高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以避免葉綠體DNA的擴(kuò)增[19]。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL(北京TaKaRa生物科技公司)，上下游引物各1.5 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL(20～30 ng/μL)，超純水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性20 s，57 ℃退火25 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物(電泳條件：110 V,300 mA)，使用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,USA) 試劑盒純化16S rRNA。用Qubit hs-DS-DNA kit (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)試劑盒在Tecan Infinit F200 Pro平板閱讀器上對(duì)純化的16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量。所有PCR擴(kuò)增片段等量混合(每樣品150 ng)后，用上海生物制藥科技有限公司Illumina MiSeq(2×250)測(cè)序儀(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA)測(cè)序。將16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)提交至Galaxy平臺(tái)(http://mem.rcees.ac.cn:8080)。首先，按照標(biāo)簽將原始數(shù)據(jù)中的不同樣品區(qū)分，去掉標(biāo)簽和引物序列，使用FLASH合并相同序列的上、下游引物[20]。然后用Btrim過(guò)濾序列，保留平均質(zhì)量得分大于20的序列，刪除帶有簡(jiǎn)并堿基以及長(zhǎng)度小于200 bp的序列[21]。最后用UPARSE去除序列中的嵌合體[22]，同時(shí)以97%的相似度閾值將序列聚類成可操作的分類單元(operational taxonomic units,OTU)，并利用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目16S分類器將16S rRNA基因代表性序列分類注釋[23]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

大葉黃楊葉片內(nèi)生菌細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢(shì)門、屬相對(duì)豐度與葉片理化性質(zhì)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析法和t檢驗(yàn)進(jìn)行。細(xì)菌群落豐富度(observed species richness,Sobs)和多樣性指數(shù)(香濃指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)和Chao1)用R軟件VEGAN進(jìn)行分析。

使用Jaccard、Bray-Curtis距離矩陣表示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，其不相似性分析采用ADONIS、MRPP和PERMANOVA方法進(jìn)行。使用R軟件VEGAN進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analusis,CCA)和Mantel分析。

通過(guò)在線平臺(tái)(http://ieg2.ou.edu/MENA)構(gòu)建大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)[24]，結(jié)果通過(guò)Gephi0.9.2實(shí)現(xiàn)可視化。基于隨機(jī)矩陣?yán)碚?random matrix theory,RMT)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣?、網(wǎng)絡(luò)互作和模塊節(jié)點(diǎn)拓?fù)浣巧R(shí)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉黃楊葉片的理化成分

由表1可以看出，與HL相比，DL的葉綠素和硝酸鹽含量下降，而可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量增加，其中葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著。

表1 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)的理化成分含量Table 1 Physicochemical properties content in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

2.2 大葉黃楊葉片的內(nèi)生細(xì)菌群落特征

經(jīng)質(zhì)量篩選、嵌合體檢測(cè)和非靶標(biāo)生物剔除，從大葉黃楊HL與DL的18個(gè)樣本共獲得高質(zhì)量細(xì)菌16S rRNA基因序列1 981 980條，每個(gè)樣本獲得16S rRNA基因序列介于10 257～840 990條。由于樣本間序列差異較大，將所有樣本隨機(jī)重新抽樣到相同的測(cè)序深度(10 257個(gè)序列)，重抽后所有樣本序列被聚類為1 931個(gè)OTU，每個(gè)樣本的細(xì)菌OTU數(shù)量在76～318個(gè)，平均為172個(gè)。大葉黃楊HL和DL內(nèi)生細(xì)菌群落OTU組成無(wú)顯著差異(P=0.952)。對(duì)大葉黃楊HL和DL的Sobs和Shannon、Simpson、Chao1多樣性指數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。由表2可以看出，根據(jù)Sobs值， HL的細(xì)菌群落多樣性稍低于DL；而根據(jù)Shannon、Simpson和Chao1多樣性指數(shù)，HL的細(xì)菌群落多樣性稍高于DL，但差異均不顯著。

表2 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性Table 2 Endophytic bacterial communities diversity in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

將DL和HL的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性與葉片理化性質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果(表3)表明，HL的硝酸鹽含量與葉內(nèi)生細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，而DL的硝酸鹽含量與葉內(nèi)生細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)呈顯著正相關(guān)。HL和DL的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量與葉內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的相關(guān)性均未達(dá)顯著水平。

表3 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性與葉片理化成分的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of endophytic bacterial communities diversity and physicochemical properties in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

2.3 大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

HL和DL內(nèi)生細(xì)菌群落在門水平上的分布如圖1-A所示。由圖1-A可以看出，HL的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，其相對(duì)豐度分別為70.93%，14.87%，9.55%，1.38%和2.58%；DL的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門，其相對(duì)豐度分別為74.20%，12.15%，4.82%和7.33%。兩組樣本中，變形菌門的相對(duì)豐度均最高，其次為放線菌門。HL的放線菌門、厚壁菌門與擬桿菌門占比稍高于DL，而DL細(xì)菌群落中的藍(lán)細(xì)菌門相對(duì)豐度顯著高于HL。

相對(duì)豐度≤1%的門和屬被歸類為“其他”Phylum and genus with relative abundance less than 1% were classified as “Others”圖1 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌在門(A)和屬(B)水平上的群落組成Fig.1 Community composition of endophytic bacteria of Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildes leaves (DL) at phylum (A) and genus (B) levels

由圖1-B可知，在屬水平上，HL內(nèi)生細(xì)菌群落的分布與DL差別較大。HL優(yōu)勢(shì)屬為羅爾斯通氏菌屬、無(wú)色桿菌屬、貪銅菌屬、類芽孢桿菌屬、鹽孢菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、土單胞菌屬和節(jié)桿菌屬，其相對(duì)豐度分別為8.40%，5.42%，5.06%，4.88%，3.98%，2.91%，2.12%，1.97%和1.35%；DL優(yōu)勢(shì)屬為羅爾斯通氏菌屬、鹽孢菌屬、伯克霍爾德菌屬、芽孢桿菌屬和羅河桿菌屬，其相對(duì)豐度分別為13.69%，6.09%，3.16%，1.32%，1.27%。大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落中未分類細(xì)菌占比最大，羅爾斯通氏菌屬為葉內(nèi)最常見屬。HL的無(wú)色桿菌屬、貪銅菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、土單胞菌屬、節(jié)桿菌屬的相對(duì)豐度大于DL。DL的羅爾斯通氏菌屬、鹽孢菌屬、伯克霍爾德菌屬和羅河桿菌屬的相對(duì)豐度高于HL。

HL和DL內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的不相似性結(jié)果表明，兩者的群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差別。

2.4 大葉黃楊葉片理化成分與葉片內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

用典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)來(lái)評(píng)估大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與葉片理化性質(zhì)之間的可能聯(lián)系，結(jié)果見圖2。

圖2 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌群落與葉片理化特性的CCA分析Fig.2 CCA analysis of endophytic bacterial community and physicochemical properties of Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL)

圖2表明，大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落的CCA模型是顯著的(F=1.531,P=0.032)，兩個(gè)軸(CCA1、CCA2)對(duì)大葉黃楊內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解釋率合計(jì)為23.62%。第一軸(CCA1)與大葉黃楊葉片的葉綠素含量呈顯著正相關(guān)(P=0.002)，與硝酸鹽含量、可溶性糖含量呈正相關(guān)，而與可溶性蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。CCA-VPA結(jié)果表明，大葉黃楊葉片的葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、硝酸鹽含量4個(gè)理化特性共解釋39.39%的內(nèi)生細(xì)菌群落變化，解釋量分別為20.02%，12.856%，10.37%和8.37%。Mantel分析結(jié)果(表4)進(jìn)一步證實(shí)，大葉黃楊葉片的葉綠素含量顯著影響內(nèi)生細(xì)菌群落的豐度，而硝酸鹽、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

表4 大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與葉片理化成分的Mantel分析Table 4 Mantel analysis of endophytic bacterial community structure and physicochemical properties of Euonymus japonicas leaves

相關(guān)性分析結(jié)果(表5)顯示，HL的葉綠素含量與變形菌門相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與放線菌門呈極顯著正相關(guān)，硝酸鹽含量與藍(lán)細(xì)菌門呈極顯著負(fù)相關(guān)。DL的理化性質(zhì)與細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)門的分布無(wú)顯著相關(guān)性。

表5 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌群落4個(gè)優(yōu)勢(shì)門相對(duì)豐度與葉片理化成分的相關(guān)性Table 5 Correlation analysis between relative abundance of 4 endophytic bacterial dominant phyla and physicochemical properties in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

由表6可以看出，HL的可溶性糖含量與羅爾斯通氏菌屬、鹽孢菌屬、伯克霍爾德菌屬、羅河桿菌屬相對(duì)豐度呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，可溶性蛋白質(zhì)含量與芽孢桿菌屬呈顯著正相關(guān)，葉綠素含量與貪銅菌屬、類芽孢桿菌屬、土單胞菌屬、節(jié)桿菌屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)。DL的硝酸鹽含量與芽孢桿菌屬呈極顯著正相關(guān)，其他理化指標(biāo)與細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)屬的分布無(wú)顯著相關(guān)性。

2.5 大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)能夠反映不同微生物種間的互作關(guān)系，從而可識(shí)別微生物群落中的關(guān)鍵物種，對(duì)于篩選具有抵御病菌作用的微生物具有很高的參考價(jià)值。本研究篩選并保留在50%樣本中同時(shí)出現(xiàn)的OTU，在相同的相似度閾值水平(0.94)比較HL與DL內(nèi)生細(xì)菌群落的拓?fù)湫再|(zhì)。結(jié)果(表7)顯示，HL和DL內(nèi)生細(xì)菌群落的網(wǎng)絡(luò)連接性分布符合冪律模型(power-law module)。HL與DL內(nèi)生細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)與其對(duì)應(yīng)的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)、平均距離和模塊化值差異極顯著，表明網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并非隨機(jī)無(wú)序構(gòu)建，其相互連接具有顯著的確定性意義。將兩個(gè)細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)可視化，結(jié)果(圖3)表明，DL的內(nèi)生細(xì)菌平均連接性要高于HL，且細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜。HL中厚壁菌門、變形菌門與其他細(xì)菌聯(lián)系較為密切，DL中變形菌門和放線菌門與其他細(xì)菌聯(lián)系更密切。HL、DL大部分細(xì)菌之間的互作關(guān)系是負(fù)向的，負(fù)相關(guān)關(guān)系占比分別為68.46%和71.43%，表明不同細(xì)菌之間多為相互競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，且白粉病感染加劇了細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)。

表6 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌群落10個(gè)優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度與葉片理化指標(biāo)的相關(guān)性Table 6 Correlation analysis between relative abundance of 10 endophytic bacterial dominant genera and physicochemical properties of Euonymus japonicas’s healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL)

表7 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌實(shí)證分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦耘c隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)比較Table 7 Comparison of topological characteristics between empirical molecular ecological network and random network of endophytic bacteria in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

分子網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)都具有不同的拓?fù)浣巧鶕?jù)節(jié)點(diǎn)的模塊內(nèi)連通性(Pi)和模塊間連通性值(Zi)將節(jié)點(diǎn)區(qū)分為外圍節(jié)點(diǎn)(peripherais)、連接節(jié)點(diǎn)(connectors)、模塊中心點(diǎn)(module hubs)和網(wǎng)絡(luò)中心點(diǎn)(network hubs)4類(圖4)，其中連接節(jié)點(diǎn)、模塊中心點(diǎn)、網(wǎng)絡(luò)中心點(diǎn)可作為群落關(guān)鍵種[25]。從圖4可以看出，HL和DL細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中的大多數(shù)節(jié)點(diǎn)都是外圍節(jié)點(diǎn)，且均無(wú)網(wǎng)絡(luò)中心點(diǎn)；僅DL細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)有模塊中心點(diǎn)和連接節(jié)點(diǎn)，模塊中心點(diǎn)為OTU_722(放線菌門諾卡氏菌科紅球菌屬)，連接節(jié)點(diǎn)為OTU_142(變形菌門生絲微菌科生絲微菌屬)、OTU_90(變形菌門華桿菌科)、OTU_128(放線菌門類諾卡氏菌科)、OTU_80 (放線菌門魚孢菌科)。關(guān)鍵種的變化表明，大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落對(duì)白粉病有響應(yīng)效應(yīng)。

一個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)代表一個(gè)OTU；節(jié)點(diǎn)顏色代表門水平的不同分類，節(jié)點(diǎn)大小代表其連接數(shù)；每條邊分別表示由其連接的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性，橙色線代表負(fù)相關(guān)關(guān)系，藍(lán)色線代表正相關(guān)關(guān)系A(chǔ) node represents an OTU.The color of nodes represents the different classification of gate level,and the size of nodes represents the number of connections.Each edge represents the correlation between the two nodes.The orange line represents the negative correlation, while the blue line represents the positive correlation圖3 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌群落的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Interaction of endophytic bacterial community networks in Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL)

節(jié)點(diǎn)1～4分別代表OTU_80、OTU_128、OTU_90和OTU_142Nodes 1-4 represent OTU_80,OTU_128,OTU_90,OTU_142圖4 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細(xì)菌模塊節(jié)點(diǎn)的拓?fù)浣巧植糉ig.4 Endophtic bacterial module node topology role distribution of Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildes leaves (DL)

3 討 論

內(nèi)生菌在植物根、莖、葉、花和果實(shí)的細(xì)胞或細(xì)胞間隙中普遍存在，它們與植物的關(guān)系可能比葉表面的微生物更密切。國(guó)內(nèi)外研究表明，植物體內(nèi)分離的某些微生物對(duì)病原菌有拮抗作用，可增強(qiáng)植物的抗病性[10-11,14]。因此植物內(nèi)生菌的研究有助于葉部病害的生物防治。

本研究結(jié)果顯示，大葉黃楊葉片內(nèi)生細(xì)菌群落中，變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與鄧平香等[26]、Fernando等[27]、Natacha等[28]對(duì)東南景天(Sedumalfredii)、番茄(Solanumlycopersicum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)內(nèi)生細(xì)菌的研究結(jié)果一致。人們對(duì)水稻(Oryzasativa)[29]、楊樹(PopulustremulaxPopulusalba)[30]、甜葉菊(Steviarebaudiana)[31]以及一些非栽培植物[32]內(nèi)生細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、伯克霍爾德菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)是植物葉內(nèi)生菌中的常見屬。本研究中除了假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和甲基桿菌屬未發(fā)現(xiàn)外，其余葉片內(nèi)生細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)屬均出現(xiàn)。另外，本研究在大葉黃楊葉片中檢測(cè)到的貪銅菌屬、無(wú)色桿菌屬、鹽孢菌屬、土單胞菌屬細(xì)菌在其他植物葉內(nèi)生菌研究中尚未見報(bào)道，這可能與本研究大葉黃楊葉片采集地的環(huán)境相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，北京城區(qū)交通干道附近綠化帶重金屬含量超過(guò)北京土壤背景值[33]，并且大葉黃楊葉表也具有吸附空氣中鋁、銅、鋅、砷和鎘等重金屬元素的能力[34]。因此具有重金屬耐受性與修復(fù)性的貪銅菌屬微生物[35-36]以及其他屬微生物得以在葉內(nèi)富集。

研究表明，一些病菌感染宿主植物后會(huì)降低植物內(nèi)生菌的多樣性[37-38]，但也有研究表明，病菌感染對(duì)宿主植物內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度無(wú)顯著影響[39-40]。還有研究認(rèn)為，病菌感染可能會(huì)提高宿主植物內(nèi)生菌的豐富度，如感染白葉枯病后，水稻葉片內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性增大[41]。本研究中，大葉黃楊健康葉片與染病葉片細(xì)菌群落差異很小；Shannon、Simpson及Chao1值表明，健康葉片的細(xì)菌群落多樣性稍高于白粉病感染的葉片，但差異不顯著?？梢娫诓煌瑮l件下，病菌對(duì)宿主植物內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響及兩者的互作關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

大量研究證實(shí)，葉齡[9]、CO2濃度[8]、溫度[42]等均會(huì)影響葉內(nèi)生菌群落，但關(guān)于葉綠素含量等葉片理化性質(zhì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究較少。本研究結(jié)果表明，大葉黃楊葉片葉綠素含量與葉內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)，主要影響健康葉片變形菌門與放線菌門的相對(duì)豐度，這與Martin等[43]對(duì)歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)的研究結(jié)果一致。大葉黃楊葉片是發(fā)揮園林景觀價(jià)值和生態(tài)效益的重要器官，葉綠素含量與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系有待今后深入研究。

本研究中，感染白粉病后大葉黃楊葉內(nèi)生細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，這與前人研究結(jié)果相似。Hu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康植株，青枯病侵染的煙草(Nicotianatabacum)根內(nèi)生細(xì)菌群落具有更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和更多的相互作用關(guān)系。Víctor等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中接種病原菌后甜菜根內(nèi)生菌網(wǎng)絡(luò)連接性變得更高。此外，大葉黃楊白粉病削弱了厚壁菌門與其他細(xì)菌的聯(lián)系，加強(qiáng)了放線菌門和變形菌門與其他微生物的聯(lián)系，放線菌門諾卡氏菌科紅球菌屬、類諾卡氏菌科和魚孢菌科及變形菌門生絲微菌科生絲微菌屬和華桿菌科是葉內(nèi)生細(xì)菌群落的關(guān)鍵種。關(guān)鍵種的變化表明，大葉黃楊白粉病葉片內(nèi)生細(xì)菌群落中的關(guān)鍵種與白粉病菌入侵關(guān)系密切，可能通過(guò)分泌抗菌類物質(zhì)或與病原菌爭(zhēng)奪生態(tài)位等來(lái)抵御白粉病[10-11,14]。今后可分離內(nèi)生細(xì)菌群落的關(guān)鍵種,并探究其在白粉病感染中的作用，這對(duì)大葉黃楊白粉病生物防治具有重要意義。