王 蕾,陳 依,楊雅其,魯寶君,張 晶

(1吉林農業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春130118；2杭州睦山農實業(yè)投資公司，浙江 杭州310000)

藍莓(VacciniumcorymbosumL.)被譽為“漿果之王”，是聯(lián)合國糧農組織(FAO)推薦的世界五大健康水果之一[1]，富含黃酮、多酚、有機酸和花青素(anthocyanin,An)等多種植物活性成分?；ㄇ嗨厥撬{莓發(fā)揮天然功能的主要成分。藍莓花青素是一種黃酮類多酚化合物，由花青素和糖分子通過糖苷鍵結合而成[2]，作為一種水溶性色素，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖和抗糖尿病等[3-6]，但由于其對溫度、光和pH非常敏感，導致應用受到限制[7]。封裝是保護環(huán)境敏感生物活性成分的重要方法[8]。到目前為止，已經開發(fā)了許多載體系統(tǒng)用于花青素封裝，以增強其在貯存期間和胃腸道中的穩(wěn)定性，并提高其在靶點的生物利用度。

脂質體是一種以脂質為基礎的膠體給藥系統(tǒng)，由1個或多個磷脂雙層膜圍繞在1個水核周圍組成，可用于疏水性和親水性化合物的遞送，甚至用于雙重藥物遞送[9]，但在貯存過程中易發(fā)生聚集。聚乙二醇(PEG)是一種柔軟、水溶性、無毒、無生物活性的線性高分子[10]。經PEG修飾的脂質體可以延長藥物在血液中的循環(huán)半衰期，增強其理化穩(wěn)定性，增加在腫瘤、炎癥和病變部位的視向以及藥物療效[11]，在很大程度上拓寬了脂質體藥物的適用范圍。

近年來，提高花青素的穩(wěn)定性和生物利用度成為一個研究熱點。目前，對藍莓花青素脂質體(Anthocyanin liposome,An-Lip)的研究較少。本試驗采用逆向蒸發(fā)法制備An-Lip，采用單因素試驗結合響應面法確定其最佳工藝條件，同時制備PEG修飾的An-Lip(PEG-An-Lip),并探究其體外釋放、紅外光譜特性及穩(wěn)定性，旨在為花青素脂質體的開發(fā)及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

藍莓，由吉林農業(yè)大學果園提供。大豆卵磷脂(SY-SI-180801)，上海艾偉拓醫(yī)藥科技公司；膽固醇(160612)，北京生物科技有限公司；透析袋(8 000～14 000 ku)，鼎國昌盛生物技術公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，西格瑪奧爾德里奇化學公司；大孔吸附樹脂D3520，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。其他試劑均為分析純級試劑。

PL303電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器公司；PB-10酸度計，德國賽多利斯公司；Thermo Fisher ST 16R高速冷凍離心機，北京昊諾斯科技公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；冷凍干燥機，Telstar LyoQuest公司；EYELA DPE-1250旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；KQ5200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；THZ-92B氣浴恒溫震蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；激光粒度儀(DLS)，NanoBrook 90Plus Zeta，Malvem，UK；傅里葉變換紅外光譜儀，上海鉑金埃爾默有限公司；H-7650掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.2 藍莓花青素的提取純化

采用吉林農業(yè)大學中藥材實驗室建立的方法[12]提取并純化藍莓花青素。取藍莓鮮果50.0 g，勻漿后加500 mL pH 3.0的酸化乙醇提取劑(乙醇最終體積分數(shù)為70%)，超聲提取3次，30 min/次，合并提取液，離心，收集上清液，40 ℃下濃縮至無醇味，濃縮液過D3520大孔樹脂，依次用pH為2的酸水及體積分數(shù)30%，50%，70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，低溫濃縮，冷凍干燥即得花青素凍干粉。該花青素凍干粉純度為90%。

1.3 An-Lip的最佳制備工藝

1.3.1 單因素試驗 采用逆向蒸發(fā)法制備An-Lip，考察大豆卵磷脂與膽固醇質量比、有機相(乙醚)與水相(花青素)體積比和溫度對An-Lip包封率的影響。

1)大豆卵磷脂與膽固醇質量比。分別按1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1的比例準確稱取大豆卵磷脂和膽固醇共0.168 g，加入20 mL乙醚，待膽固醇和大豆卵磷脂完全溶解后，加5 mL質量濃度為0.253 mg/mL的藍莓花青素溶液，超聲30 min，得到水包油(W/O)型乳劑，將其在40 ℃減壓除去乙醚，達到膠態(tài)后，滴加30 mL pH為7的PBS緩沖液，減壓蒸發(fā)得到水性混懸液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得淡粉色澄清透明的An-Lip混懸液，檢測其包封率，確定最佳大豆卵磷脂與膽固醇質量比。

2)有機相與水相體積比。按最佳比例準確稱取大豆卵磷脂和膽固醇0.168 g，分別按2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1加乙醚和0.253 mg/mL的藍莓花青素溶液共40 mL，按上述方法制備An-Lip，檢測其包封率，確定最佳有機相與水相體積比。

3)溫度。在最佳大豆卵磷脂與膽固醇質量比及有機相與水相體積比條件下制備W/O型乳劑，分別在30，35，40，45，50 ℃下減壓除去乙醚后，按上述方法制備An-Lip，檢測其包封率，確定最佳溫度。

1.3.2 Box-Behnken響應曲面試驗 以包封率為響應值，基于 Box-Behnken響應曲面設計試驗方案(表1)，對影響An-Lip包封率的3個因素在3個水平上進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。基于最佳工藝條件制備An-Lip，重復3次，測算包封率的平均值。

表1 An-Lip的響應面試驗設計因素與水平Table 1 Design factors and levels for An-Lip response surface test

1.3.3 An-Lip包封率的測定 將花青素凍干粉用1 mol/L鹽酸和甲醇配制成0.05 mg/mL的儲備液，然后將其稀釋成系列濃度的標準溶液，于530 nm波長下檢測吸光度(OD530)，對花青素質量濃度(x)與OD530(y)進行線性回歸分析，得方程為：y=28.405x+0.005(R2=0.999 6)。該方程在花青素質量濃度為0.001～0.05 mg/mL時線性關系良好。

采用超濾離心法[13]測定An-Lip的包封率。準確量取An-Lip 0.5 mL至超濾離心管中，于4 ℃下10 000 r/min離心30 min,取30 μL上清液，加3 mL甲醇，用分光光度計測OD530，根據(jù)標準曲線計算花青素質量濃度，即An-Lip中游離花青素質量濃度。取等體積(30 μL)An-Lip，加3 mL甲醇破乳后測定藥物質量濃度，即An-Lip中花青素的總質量濃度。計算包封率：包封率=An-Lip中游離花青素質量濃度/An-Lip中花青素的總質量濃度×100%。

1.3.4 An-Lip的表征 取An-Lip 1 mL，稀釋至3 mL，于倒置顯微鏡下觀察An-Lip的形態(tài)，并在激光粒度儀中測定其粒徑、電位、多分散系數(shù)(PDI)。

1.4 PEG修飾的An-Lip的制備

用PEG對An-Lip進行修飾，制備PEG-An-Lip。將含質量分數(shù)3% PEG 2000的PBS溶液與等體積的An-Lip渦旋混合后，于4 ℃下靜置60 min，即得PEG-An-Lip。

1.5 花青素脂質體的體外釋放及紅外光譜掃描

1.5.1 體外釋放 采用透析法對花青素脂質體的體外釋放進行考察[14]。吸取An、An-Lip和PEG-An-Lip各2 mL置于透析袋中，將透析袋置于200 mL pH 7.0 PBS釋放介質中，37 ℃恒溫氣浴振蕩(100 r/min)，分別于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，48 h取2 mL釋放介質備測，并補足同溫2 mL PBS。測定釋放介質樣品的OD530，通過標準曲線確定其游離花青素質量濃度，計算累積釋放率(Q)。

式中：C0為初始花青素質量濃度(mg/mL)，V0為釋放介質總體積(mL)，Ci為第i次取樣樣品中的花青素質量濃度(mg/mL)，Vi為第i次取樣樣品體積(mL)，m表示樣品中花青素的總質量(mg)，n為取樣次數(shù)。

1.5.2 紅外光譜(FT-IR)掃描 分別取5 mg空白脂質體(B-Lip)、An、An-Lip、PEG-An-Lip凍干品，在4 000～450 cm-1進行FT-IR掃描。

1.6 花青素脂質體的穩(wěn)定性

pH穩(wěn)定性：分別配制不同pH (1.0，2.0，5.0，7.0，9.0)的HCl溶液，將其與B-Lip、An-Lip和PEG-An-Lip按體積比1∶1混合，室溫下培養(yǎng)30 min后，在激光粒度儀中表征。所有數(shù)據(jù)均為3次測量的平均值。

熱穩(wěn)定性：將An、An-Lip和PEG-An-Lip在80 ℃水浴1 h，在0(水浴前)，15，30，45，60 min時取樣，將樣品在4 ℃下15 000 r/min離心20 min，收集上清液，立即放入冰浴中，測量OD530，計算花青素保留率[15]。

式中：A0為水浴前花青素的OD530；A為水浴不同時間花青素的OD530。

UV穩(wěn)定性：將An、An-Lip和PEG-An-Lip置于6孔細胞培養(yǎng)板中，室溫下用紫外線照射3 h，在0，15，30，45，60，90，120和180 min取樣，樣品于4 ℃下15 000 r/min離心20 min，測量各時間點的OD530，計算花青素保留率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次，結果用“平均值±標準差”表示，采用Graphpad prism 6對單因素及穩(wěn)定性試驗結果進行分析，采用Design expert軟件對響應面試驗進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 An-Lip制備的單因素試驗結果

2.1.1 大豆卵磷脂與膽固醇的質量比 如圖1所示，當大豆卵磷脂與膽固醇質量比為2∶1時，An-Lip包封率最高，為79.98%。膽固醇比例提高時，由于大豆卵磷脂量太少，脂質體膜形成困難且不牢固，包封率降低。而當大豆卵磷脂比例逐漸增大時，水化比較困難，脂質體重新聚集，導致包封率下降。

2.1.2 有機相與水相的體積比 如圖1所示，當有機相與水相體積比為4∶1時，An-Lip包封率最高,達82.12%。水相比例提高，有機相與水相不能很好地形成穩(wěn)定的W/O型乳液；有機相比例提高，脂質體中包入藥量太少，致使包封率降低。

2.1.3 溫 度 脂質體制備過程中，水浴溫度是大豆卵磷脂溶解、成膜的關鍵因素，影響脂質體的穩(wěn)定性。如圖1所示，當溫度為40 ℃時，An-Lip包封率最高,為82.88%。溫度過低，脂質體成凝膠時間長且不均勻；溫度過高，會使花青素降解，影響包封率。

圖1 花青素脂質體制備的單因素試驗結果Fig.1 Single factor test of anthocyanin liposomes

2.2 An-Lip最佳制備工藝

2.2.1 Box-Behnken響應面試驗設計優(yōu)化結果 基于單因素試驗結果，設計Box-Behnken試驗，結果見表2。

表2 花青素脂質體制備的響應面試驗結果Table 2 Results for anthocyanin liposomes response surface test

表3 花青素脂質體包封的響應面設計方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface test of anthocyanin liposomes

2.2.2 交互作用分析 一般來說，交互作用的強弱用等高線的形狀來反映，圓形說明兩因素交互不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[16]。圖2中,因素A(大豆卵磷脂與膽固醇質量比)與因素C(溫度)的等高線最圓，可知A與C之間的交互作用對包封率影響最小；A與B(有機相與水相比例)、B與C的等高線扁平，表明A與B、B與C的交互作用對包封率的影響較大。

A、B、C分別代表大豆卵磷脂與膽固醇質量比、有機相與水相體積比和溫度A,B and C represent mass ratio of phospholipid to cholesterol,volume ratio of organic phase to aqueous phase,and temperature，respectively圖2 因素交互作用對花青素脂質體包封率的影響Fig.2 Effect of factor interaction on encapsulation efficiency of anthocyanin liposomes

2.2.3 驗證試驗 通過Design expert軟件，得到響應面法優(yōu)化An-Lip制備的工藝條件為：大豆卵磷脂與膽固醇質量比1.98∶1，有機相與水相體積比4.29∶1，溫度為38.77 ℃。但考慮到實際操作的方便性，將試驗條件調整為：大豆卵磷脂與膽固醇質量比2∶1，有機相與水相體積比4∶1，溫度40 ℃。按照上述最佳工藝條件制備An-Lip,重復3次，平均包封率為82.16%，說明該方法具有良好的可靠性。

2.2.4 An-Lip的表征 實驗結果顯示，An-Lip粒徑呈正態(tài)分布，平均粒徑為(221.52±10.3) nm(圖3-A)；體系分散均勻，PDI為(0.230±0.21)；Zeta電位為(-31.05±2.23) mV(圖3-B)，說明脂質體表面帶負電荷，且體系穩(wěn)定。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，脂質體為球形或橢球形。

2.3 花青素脂質體的體外釋放

體外釋放試驗結果(圖4)表明，An 8 h的累積釋放率可達95%以上，之后基本保持不變，說明通過透析袋的藥物釋放不是一個限制性釋放過程[17]。藥物制成脂質體后，可分為快速釋放和緩慢釋放2個階段。8 h時，An-Lip和PEG-An-Lip的累積釋放率分別為50.05%和36.98%，可知PEG-An-Lip的釋放較An和An-Lip明顯變緩。8 h后An-Lip和PEG-An-Lip繼續(xù)釋放，在12 h時其累積釋放率分別為63.33%和47.78%，24 h時分別為67.99%和50.62%，48 h時分別為73.77%和53.33%。結果表明，12 h后An-Lip和PEG-An-Lip的釋放速度變緩，其中PEG-An-Lip的緩釋效果更優(yōu)。

圖3 花青素脂質體的粒徑(A)和電位(B)Fig.3 Particle size (A) and Zeta (B) of anthocyanin liposomes

圖4 花青素脂質體的體外釋放曲線Fig.4 In vitro release curve of anthocyanin liposomes

2.4 花青素脂質體的FT-IR光譜

FT-IR掃描結果(圖5)表明，樣品的特征吸收覆蓋了4 000～450 cm-1整個區(qū)域。FT-IR光譜中，An譜線在3 650～3 200 cm-1處是氫鍵締合的-OH伸縮振動吸收峰與C-H的伸縮振動吸收峰，在1 596.60 cm-1處是苯環(huán)的伸縮振動吸收峰。B-Lip譜線在3 447 cm-1處為-OH的伸縮振動峰，在1 735.95 cm-1處為C=O的吸收振動峰，在1 176.95 cm-1和969.61 cm-1處是大豆卵磷脂的對稱和非對稱拉伸振動峰。An-Lip的光譜與B-Lip相似，這可能是由于An能很好地包裹在脂質體的水核中，故不存在An的特征吸收峰，表明脂質體的包覆方式為物理包覆。PEG-An-Lip譜線在2 853.11 cm-1處的吸收峰為PEG的C-H伸縮振動引起的；在1 735.95 cm-1和1 176.95 cm-1處的吸收峰分別由C=O和C-O-C的拉伸振動形成。FT-IR的分析結果進一步證實花青素包覆成功。

圖5 花青素脂質體的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of anthocyanin liposomes

2.5 花青素脂質體的穩(wěn)定性

2.5.1 pH穩(wěn)定性 由圖6可知，在酸性(pH為1～5)條件下，B-Lip、An-Lip和PEG-An-Lip的Zeta電位大幅度下降，極不穩(wěn)定；在pH為7時，其Zeta電位絕對值增大，分別為32.13，30.56和34.34 mV；PEG-An-Lip的Zeta電位較An-Lip大。An-Lip的粒徑在pH為5.0～7.0時比較穩(wěn)定，在pH為1.0時增大為500.33 nm，這種現(xiàn)象歸因于脂質體在酸性介質中溶脹能力較強，導致囊泡增大[18]；PEG-An-Lip粒徑在pH≤5.0時明顯增大；PEG-An-Lip的粒徑較An-Lip大，這是由于PEG靜電吸引導致脂質體形成更松散的層狀結構，導致顆粒尺寸增大[19]。一般而言，PDI<0.3說明體系分散均勻。由圖6可知，在pH 1.0～9.0條件下，B-Lip、An-Lip、PEG-An-Lip的PDI均小于0.3，說明pH對PDI影響較小?？芍狟-Lip、An-Lip和PEG-An-Lip在低pH下穩(wěn)定性相對較差，在pH 7的條件下較穩(wěn)定。

圖6 花青素脂質體的pH穩(wěn)定性Fig.6 PH stability of anthocyanin liposomes

2.5.2 熱穩(wěn)定性 由圖7可知，隨著水浴時間的延長，An、An-Lip、PEG-An-Lip的花青素保留率均逐漸降低，至水浴60 min時其花青素的保留率分別為79.01%，85.33%和93.79%，表明PEG修飾明顯提高了An的保留率，改善了其熱穩(wěn)定性。

2.5.3 UV穩(wěn)定性 由圖8可知，隨著UV照射時間的延長，An、An-Lip、PEG-An-Lip的花青素保留率均逐漸降低，至180 min時其花青素的保留率分別為79.01%，88.01%和93.79%，表明PEG修飾改善了An的UV穩(wěn)定性。

3 討 論

近年來，利用脂質體包封技術提高黃酮類化合物的穩(wěn)定性及活性成為科研人員研究的熱點[20]，很多研究采用普通的薄膜分散法制備花青素脂質體[21-22]，這種方法需先將花青素溶解在pH為7.4的PBS緩沖溶液中，而在此條件下花青素的穩(wěn)定性很差，包封率也不理想。由于花青素極易溶于水，因此本試驗用逆向蒸發(fā)法制備花青素脂質體，將花青素溶于pH為2的酸水中，使有機相與水相結合，形成穩(wěn)定的乳劑。采用響應面法優(yōu)化An-Lip的制備工藝，測得An-Lip的平均包封率為82.16%，符合預期效果。本研究發(fā)現(xiàn)，乳劑的形成是逆向蒸發(fā)法制備脂質體的關鍵步驟之一，若有機相比例過低，則很難形成穩(wěn)定的W/O體系，包封率較低；若有機相比例過高，則需要較長時間超聲才可形成W/O體系，而超聲時間過長勢必會破壞脂質體，影響脂質體的包封率和粒徑。本試驗中，當有機相與水相的體積比為4∶1時，An-Lip的包封率較高，但所制備的脂質體粒徑較大，因此用逆向蒸發(fā)法制備An-Lip混懸液后，再用超聲細胞粉碎儀超聲30 min，可使粒徑減小，顆粒分散均勻，能一定程度提高包封率。一般來說,脂質體的粒徑<500 nm，可用于細胞輸送，具有較高的透膜性[23]；PDI在0～0.3,表明粒子分散均勻[24]；Zeta電位絕對值大于30 mV，表明脂質體具有較好的穩(wěn)定性[25]。本試驗測得的An-Lip粒徑為221.52 nm，PDI為0.230，Zeta電位為-31.05 mV,可見試驗所制備的脂質體符合預期要求。

圖7 花青素脂質體的熱穩(wěn)定性Fig.7 Heating stability of anthocyanin liposomes

脂質體容易發(fā)生融合、聚集和氧化，使藥物泄露，進而使穩(wěn)定性降低。用聚乙二醇修飾不僅可以提高脂質體的穩(wěn)定性，還可延長緩釋時間，避免因藥物過量釋放所引起的劑量依賴細胞毒性[26]。Firozian等[27]研究表明，PEG修飾的N-乙酰半胱氨酸的穩(wěn)定性較N-乙酰半胱氨酸增強。本試驗發(fā)現(xiàn)，經PEG修飾后花青素脂質體的穩(wěn)定性得以提高。

綜上，本試驗采用響應面法優(yōu)化An-Lip的制備工藝，在此基礎上加入PEG對花青素脂質體進行修飾，提高了其穩(wěn)定性。經PEG修飾后的An-Lip能明顯延緩花青素的釋放，提高其pH、UV和熱穩(wěn)定性，能更好地保護花青素免受降解和損失。說明PEG修飾是一種較好的保護花青素免受理化損傷的方法，在花青素類功能性食品的開發(fā)和應用等方面具有應用潛力。