楊 敏，周陳平，楊 護(hù)，鄺瑞彬，黃炳雄，魏岳榮

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510640)

番木瓜(CaricapapayaL.)是我國嶺南特色水果，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，隨著人們對其認(rèn)可程度的提高，需求量持續(xù)增加，已成為世界上第四大熱帶、亞熱帶暢銷水果[1-3]。然而，番木瓜采后果實(shí)易受炭疽菌侵染而影響貯運(yùn)和貨架期，導(dǎo)致商品果損失，損失率可高達(dá)50%[4]，極大地限制了番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。防治番木瓜炭疽病的傳統(tǒng)方法是理化處理，該方法雖有一定效果，但需投入巨大的人力、物力，且影響環(huán)境[5-6]，而通過分子育種獲得抗炭疽病番木瓜品種是防治炭疽病最根本、最有效的方法。因此準(zhǔn)確篩選抗病候選基因是番木瓜抗炭疽病分子育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子尤其是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-9]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，WRKY蛋白的共同特征是含有約60個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，包含位于N端的七肽(WRKYGQK)WRKY結(jié)構(gòu)域和位于C端的鋅指結(jié)構(gòu)，其中N端七肽序列為高度保守的核心序列，C端由C2H2型(CX4CX22-23HXH/C)或C2HC型(CX7CX23HXC)鋅指結(jié)構(gòu)組成[10-11]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域特征及聚類分析,可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3大類,其中Ⅰ類的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，含 2 個(gè) WRKY 結(jié)構(gòu)域；Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，含 1 個(gè) WRKY 結(jié)構(gòu)域，根據(jù) WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步分為Ⅱ a、Ⅱ b、 Ⅱ c、Ⅱ d 和Ⅱe等5個(gè)亞類； Ⅲ類家族鋅指結(jié)構(gòu)為 C2HC，含 1 個(gè) WRKY 結(jié)構(gòu)域[10,12-13]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可參與植物生長發(fā)育及多種生物和非生物脅迫，介導(dǎo)植物防御調(diào)節(jié)功能，尤其在真菌、細(xì)菌和病毒病原體侵染等生物脅迫防御中發(fā)揮著重要作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，WRKY33可以正調(diào)控植株對腐生型病原菌黑斑病菌(Alternariabrassicicola)引起的黑斑病和灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病的防御作用[14-15]，WRKY18和WRKY40可以負(fù)調(diào)控植株對活體營養(yǎng)型真菌白粉病菌(Golovinomycesorontii)的防御作用[16]，WRKY3和WRKY4可以正調(diào)控植株對腐生性真菌B.cinerea的抗性[17]。水稻(Oryzasativa)轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY22過量表達(dá)時(shí)可增強(qiáng)植株對半活體營養(yǎng)型病原菌稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的抗性[18]。小麥(Triticumaestivum)TaWRKY70可正向調(diào)控高溫條件下幼苗對活體營養(yǎng)型小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici,Pst)的抗性[19]。葡萄(Vitisvinifera)在受到白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)脅迫后，57%的WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量會(huì)發(fā)生變化[20]。在百合(Liliumlongiflorum)中也鑒定到多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與了百合對灰霉病病菌(B.elliptica)侵染的防御反應(yīng)[21]。煙草(Nicotianabenthamiana)NtWRKY7、NtWRKY8、NtWRKY9和NtWRKY11能夠與RBOHB基因啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合，通過ROS途徑激活免疫反應(yīng)[22]。

番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定雖有報(bào)道[23]，但分析相對簡單，到目前為止，番木瓜WRKY家族在對病原菌侵染，尤其是在半活體營養(yǎng)型真菌炭疽菌侵染響應(yīng)中的作用還未見報(bào)道。筆者前期對炭疽菌侵染易感和耐病番木瓜品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序與分析，基于這些數(shù)據(jù)，本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定番木瓜WRKY(CpWRKY)轉(zhuǎn)錄因子家族基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化、啟動(dòng)子順式作用元件及炭疽菌侵染下CpWRKYs基因表達(dá)量進(jìn)行分析，以期為CpWRKYs家族的功能研究和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

番木瓜果實(shí)，采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所標(biāo)準(zhǔn)化種植的炭疽病耐性品種‘G20’和易感品種‘Y61’2年生果樹。短孢炭疽菌(C.brevisporum)，本課題組參照Duan等[24]的方法分離和鑒定。

1.2 CpWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

CpWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白序列下載于Plant TFDB V4.0 數(shù)據(jù)庫[25]，將這些成員利用在線軟件SMART (http:// smart.embl-heidelberg.de/) 和 InterProScan工具 ( http://www.ebi.ac. uk/Tools/pfa/iprscan/) 進(jìn)行篩選和鑒定。

1.3 CpWRKY生物信息學(xué)分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用ProPAS 軟件對篩選獲得的CpWRKY家族各成員的理化性質(zhì)進(jìn)行分析[26]。從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中下載CpWRKY家族基因成員的基因組序列、ID號和編碼序列(CDS)，通過Gene Structure Display Server (GSDS) v2.0確定內(nèi)含子、外顯子數(shù)量及基因結(jié)構(gòu)[27]。

在Uniport蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中下載擬南芥和番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白，利用MAFFT v7.471進(jìn)行比對，基于鄰接法使用FastTreeFastTree v2.1.11構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并使用iTOL v6(https://itol.embl.de/)對系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行美化。對獲得的48個(gè)CpWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列利用MAFFT v7.471進(jìn)行多序列比對，用jalview對CpWRKY蛋白序列進(jìn)行展示。利用在線軟件Multiple EM for Motif Elicitation (MEME, version 5.02) (http://meme-suite.org/tools/ meme)進(jìn)行保守基序預(yù)測[28]。在植物基因組網(wǎng)站(http：//plants.ensembl.org/index.html)下載CpWRKY各成員起始密碼子上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，通過軟件PlantCARE[29](http//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件在線預(yù)測和分析。

1.4 短孢炭疽菌侵染后CpWRKY家族基因的表達(dá)分析

1.4.1 差異表達(dá)基因的篩選 從NCBI網(wǎng)站下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI登錄號：PRJNA692338)，分析番木瓜采后果實(shí)在短孢炭疽菌侵染后CpWRKY家族基因的表達(dá)情況，炭疽菌侵染后CpWRKYs基因的表達(dá)量為處理樣品的表達(dá)量減去對照樣品的表達(dá)量。以|lb差異倍數(shù)|≥1和P<0.05為表達(dá)量明顯變化的判定標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。

1.4.2 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 以真核翻譯起始因子4A(Eukaryotic initiation factor 4A，EIF4A)為內(nèi)參基因[30]，對5個(gè)在‘G20’中特異表達(dá)的CpWRKY基因(CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY25、CpWRKY33和CpWRKY2)進(jìn)行RT-qPCR檢測。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。

將采摘的無機(jī)械外傷、成熟度一致的番木瓜品種‘G20’和‘Y61’(‘G20’和‘Y61’分別為NCBI網(wǎng)站轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所用的耐炭疽病和易感炭疽病番木瓜品種)果實(shí)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精沖洗，之后再用無菌水沖洗，室溫晾干后，利用針刺法在果實(shí)相同部位接種短孢炭疽菌(接種菌液的細(xì)菌濃度為106mL-1)，在接種0(對照)，24和48 h時(shí)取接種點(diǎn)周圍半徑約2 cm圓內(nèi)果肉樣品，備檢。用RNA 提取試劑盒(TaKaRa)提取樣品總RNA，利用DNase Ⅰ (TaKaRa)去除基因組DNA，根據(jù)試劑盒說明，用反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green ProTaqHS Premix 10 μL,正向引物F(10 μmol/L) 0.4 μL，反向引物R(10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA 模板 2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，總體積20 μL。兩步法擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。試驗(yàn)重復(fù)3次，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used for RT-qPCR in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 CpWRKY家族的鑒定和理化性質(zhì)分析

從Plant TFDB V4.0數(shù)據(jù)庫下載共獲得49個(gè)CpWRKY蛋白序列，用SMART在線軟件和InterProSca工具進(jìn)一步鑒別和篩選，發(fā)現(xiàn)除基因號為evm.model.supercontig_1195.2的蛋白外，其余48個(gè)都有WRKY結(jié)構(gòu)域，即番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族共有48個(gè)成員，將其命名為CpWRKY1～CpWRKY48。理化性質(zhì)分析結(jié)果(表2)顯示，CpWRKY1～CpWRKY48蛋白的氨基酸數(shù)為97～747個(gè)，分子質(zhì)量在10 867.25～80 553.73 u，等電點(diǎn)(pI)為4.83～9.71，均為親水性蛋白，親水性平均值均為負(fù)值，為-0.54～―1.08。

表2 CpWRKYs家族成員信息Table 2 Information of CpWRKY family

表2(續(xù)) Conutined table 2

2.2 CpWRKYs家族分類與保守結(jié)構(gòu)域的序列分析

為了對48個(gè)CpWRKY 蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確分類，按照之前報(bào)道的WRKY蛋白分類方法[10,12-13]，引入擬南芥WRKY(AtWRKY)蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果表明，CpWRKY家族可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3大類，其中Ⅰ和Ⅲ類分別有9和7個(gè)成員，第Ⅱ大類成員數(shù)最多，有32個(gè)(占總數(shù)的67%)，且第Ⅱ大類CpWRKY又可分為5個(gè)亞類：Ⅱ a、Ⅱ b、Ⅱ c、Ⅱ d和Ⅱ e，分別包括3，6，12，5和6個(gè)成員(圖1，表2)。

同時(shí)，對CpWRKY的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對和分析，結(jié)果(圖2)顯示，Ⅰ類CpWRKY的9個(gè)成員中，除CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY13外，其余6個(gè)均含有2個(gè)WRKY七肽(WRKYGQK)結(jié)構(gòu)域，分別位于蛋白的N端(Ⅰ-N)和C端(Ⅰ-C)，WRKY七肽結(jié)構(gòu)域高度一致，C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的保守性稍弱。Ⅱ類CpWRKY的32個(gè)成員中，除CpWRKY9、CpWRKY41外，其余30個(gè)成員都包含1個(gè)WRKY七肽結(jié)構(gòu)域，其中Ⅱa、Ⅱ b、和Ⅱ d 3個(gè)亞類的保守結(jié)構(gòu)域(WRKY七肽結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu))較為保守，Ⅱc和Ⅱe的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域存在較多變異。Ⅲ類CpWRKY的7個(gè)成員均具有保守的WRKY七肽結(jié)構(gòu)域和C2HC鋅指結(jié)構(gòu)。

2.3 CpWRKYs基因結(jié)構(gòu)及其蛋白保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)多樣性可以反映多基因家族的演化，對48個(gè)CpWRKY基因的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，CpWRKYs由1～6個(gè)外顯子組成，其中CpWRKY13和CpWRKY39沒有內(nèi)含子，只由1個(gè)外顯子組成；CpWRKY9、CpWRKY21、CpWRKY38和CpWRKY44由1個(gè)內(nèi)含子和1個(gè)外顯子組成。同一家族/亞家族的成員也表現(xiàn)出相似的基因結(jié)構(gòu)特征，CpWRKYs Ⅱd和Ⅱe亞家族基因都含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，Ⅲ類CpWRKYs均由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成(圖3，表2)，即CpWRKYs基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)組間差異性和組內(nèi)保守性的特征。

藍(lán)色為疏水性氨基酸，紅色為正電荷氨基酸，紫色為負(fù)電荷氨基酸，綠色為極性氨基酸，粉色為半胱氨酸，橙色為甘氨酸，黃綠色為脯氨酸，藍(lán)綠色為芳香族氨基酸，無配色為非保守性氨基酸。黑色框?yàn)閃RKY七肽(WRKYGQK)結(jié)構(gòu)域，藍(lán)色框?yàn)镃2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，黃色框?yàn)镃2HC鋅指結(jié)構(gòu)域The blue font represents hydrophobic amino acids,the red font represents positively charged amino acids,the purple font represents negatively charged amino acids,the green font represents polar amino acids,the pink font represents cysteine, the orange font represents glycine,the yellow green font represents proline,and the blue-green font represents aromatic amino acids,and unmatched fonts represent non conservative amino acids.The amino acids in the black frame are WRKY heptapeptide (WRKYGQK) domain,the amino acids in the blue frame are C2H2 zinc finger domain,and the amino acids in the yellow frame are C2HC zinc finger domain

本研究利用MEME在線軟件對48個(gè)CpWRKY蛋白進(jìn)行基序分析，共預(yù)測到10個(gè)保守基序(圖3和圖4)，這些基序的長度為17～50個(gè)氨基酸，其中基序1、2和3包含WRKY保守結(jié)構(gòu)域，基序1包含七肽保守序列，基序2包含鋅指結(jié)構(gòu)，基序3既包括七肽序列又包括鋅指結(jié)構(gòu)(圖4)。如圖3所示，CpWRKYs各大類蛋白成員的基序比較一致，但各亞類之間存在一定差異。48個(gè)CpWRKY蛋白中有21個(gè)含有基序4-基序1-基序2的基序串，占總蛋白數(shù)的42.50%。除此之外，Ⅰ類蛋白多數(shù)還包含基序3，位于基序4-基序1-基序2基序串的前面，這與Ⅰ類WRKY蛋白含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的結(jié)果一致。Ⅱ類和Ⅲ類CpWRKY蛋白都含有基序1-基序2基序串，即包含1個(gè)保守七肽序列和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，這也與上文的結(jié)果一致。Ⅱ類CpWRKY蛋白除具有典型的WRKY結(jié)構(gòu)域基序外，Ⅱa亞類還含有基序5和基序7，其中CpWRKY34還包含了基序6；Ⅱb亞類還含有基序5、6、7和9；Ⅱd亞類還含有基序8和10。結(jié)果表明，Ⅱa、Ⅱb和Ⅱd亞類的基序更加豐富多樣。

圖3 CpWRKYs家族蛋白保守基序及其基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Conserved motifs of CpWRKYs and gene structure of CpWRKYs

基序1和3包含WRKY七肽保守序列，基序2和3包含鋅指結(jié)構(gòu)Motifs 1 and 3 contain conserved WRKY heptopeptides,and motifs 2 and 3 contain zinc finger domains圖4 CpWRKYs的保守基序Fig.4 Conserved motifs of CpWRKYs

2.4 CpWRKYs啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步研究CpWRKYs的功能和調(diào)控模式，利用PlantCARE對CpWRKYs起始密碼子上游2 000 bp 啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，共檢測到514個(gè)與生物和非生物脅迫相關(guān)的元件，包括33個(gè)GA響應(yīng)元件(15個(gè)P-box、13個(gè)GARE-motif、5個(gè)TATC-box)，占比6.42%；27個(gè)生長素響應(yīng)元件(3個(gè)AuxRR-core、21個(gè)TGA-element、3個(gè)TGA-box)，占比5.25%；162個(gè)MeJA響應(yīng)元件(81個(gè)CGTCA-motif 和 81個(gè)TGACG-motif)，占比31.52%；24個(gè)SA響應(yīng)元件(23個(gè)TCA-element和1個(gè)SARE)，占比4.67%；158個(gè)ABA響應(yīng)元件(ABRE)，占比30.74%；31個(gè)傷害響應(yīng)元件(WUN-motif)，占比6.03%；19個(gè)防御脅迫元件(TC-rich repeats)，占比3.70%；26個(gè)低溫及其他非生物脅迫元件(1個(gè)DRE和25個(gè)LTR)，占比5.06%。結(jié)果暗示，CpWRKYs廣泛參與番木瓜的生物脅迫與非生物脅迫過程。

2.5 短孢炭疽菌侵染后CpWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的表達(dá)分析

利用前期研究所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因表達(dá)差異性分析，結(jié)果(表3)顯示，在短孢炭疽菌侵染‘G20’和‘Y61’果實(shí)48 h內(nèi)，與0 h各自對照相比，表達(dá)差異的CpWRKY基因分別為37和36個(gè)，共同差異表達(dá)的有32個(gè)，這32個(gè)CpWRKY基因在侵染后的‘G20’采后果實(shí)中表達(dá)量均上調(diào)；在‘Y61’果實(shí)中有29個(gè)表達(dá)量上調(diào)，有3個(gè)(CpWRKY44、CpWRKY19和CpWRKY42)表達(dá)量下調(diào)。另外，短孢炭疽菌侵染后，在‘G20’和‘Y61’果實(shí)中特異表達(dá)的CpWRKY基因分別為5個(gè)(CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY2、CpWRKY33和CpWRKY25)和4個(gè)(CpWRKY1、CpWRKY39、CpWRKY32和CpWRKY46)，且‘G20’中5個(gè)CpWRKY基因的表達(dá)量全部上調(diào)；‘Y61’中的CpWRKY1和CpWRKY39表達(dá)量上調(diào)，而CpWRKY32和CpWRKY46表達(dá)量下調(diào)。可見短孢炭疽菌侵染后，‘G20’與‘Y61’之間差異表達(dá)的CpWRKY基因有12個(gè)，這些CpWRKY類型豐富，其中Ⅰ類4個(gè)(CpWRKY1、CpWRKY32、CpWRKY11、CpWRKY22)，Ⅱ b類2個(gè)(CpWRKY42、CpWRKY25)，Ⅱ c類4個(gè)(CpWRKY33、CpWRKY2、CpWRKY44、CpWRKY-39)，Ⅱ d類2個(gè)(CpWRKY46、CpWRKY19)。

表3 炭疽菌侵染48 h內(nèi)CpWRKY基因的表達(dá)量變化Table 3 Differential expression of CpWRKYs in G20 and Y61 at 48 h after C.brevisporum infection

2.6 短孢炭疽菌侵染后5個(gè)CpWRKYs在‘G20’和‘Y61’中表達(dá)量的變化

圖5顯示，在短孢炭疽菌接種‘G20’和‘Y61’果實(shí)后，CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY2、CpWRKY33和CpWRKY25表達(dá)量在‘Y61’中無明顯變化，而在‘G20’中表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中CpWRKY33上調(diào)了10倍以上，其他4個(gè)基因也均上調(diào)2倍以上。說明這5個(gè)WRKY基因可能是參與‘G20’抵抗炭疽菌侵染的重要候選基因。

與對照(0 h)相比，同一品種同一基因圖柱上標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)**表示差異極顯著(P<0.01)Compared with the control (0 h), * on the same gene column of the same cultivar indicates significant difference at 0.05 level (P<0.05),and * * indicates extremely significant difference at 0.01 level (P<0.01) 圖5 短孢炭疽菌侵染后5個(gè)重要候選CpWRKY在‘G20’和‘Y61’中表達(dá)水平的變化Fig.5 Changes in expression levels of five candidate CpWRKY genes in G20 and Y61 after C. brevisporum infection

3 討 論

番木瓜為我國嶺南特色水果，是支撐華南地區(qū)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略實(shí)施的重要特色經(jīng)濟(jì)樹種。然而，番木瓜采后果實(shí)易受炭疽菌侵染，影響果實(shí)品質(zhì)和貨架期，嚴(yán)重制約番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。炭疽菌屬于半活體生物營養(yǎng)型真菌，其中膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloesporioides)作為主要的番木瓜炭疽病致病菌已被廣泛報(bào)道，而短孢炭疽菌(Colletotrichumbrevisporum)是近年來新發(fā)現(xiàn)的炭疽病致病菌，現(xiàn)已在我國廣泛流行，能夠?qū)е路竟稀⒖喙?、豆類、辣椒等?jīng)濟(jì)作物炭疽病，嚴(yán)重影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量[24,31-33]。但目前對番木瓜炭疽病的侵染及抗性機(jī)理尚不明確，防控主要采取理化方法，挖掘番木瓜抗炭疽病關(guān)鍵候選基因，利用分子育種方法選育抗病新種質(zhì)是解決該問題最有效的手段。

在植物對抗病原體的防御反應(yīng)中，需要大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄重編程，而轉(zhuǎn)錄重編程離不開轉(zhuǎn)錄因子的作用，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子在與病原體防御相關(guān)的早期反應(yīng)中具有重要作用[34]。因此，鑒定番木瓜WRKY家族基因，并研究和篩選參與炭疽病抗性的重要基因，對于番木瓜抗炭疽病分子育種具有重要意義。本研究從番木瓜全基因組中篩選獲得了48個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與擬南芥[10](72個(gè))、水稻[35](102個(gè))、棗樹[36](54個(gè))、甘薯[37](82個(gè))、菠蘿[38](54個(gè))、高粱[39](94個(gè))、蘋果[40](116個(gè))等植物相比，CpWRKY家族較小，這可能與番木瓜的參考基因組較小(只有372 Mb)有關(guān)[41]。48個(gè)CpWRKY家族成員被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3大類，其中Ⅱ類又被分為5個(gè)亞類。從蛋白數(shù)量上來看，Ⅱ類CpWRKY成員最多，其次為Ⅱ類。Ⅱ類CpWRKY各亞類中，Ⅱc的成員最多，有12個(gè)，占家族成員總數(shù)的25.00%。這與前人對擬南芥[10]、甘薯[37]、蘋果[40]和草莓[42]的研究結(jié)果一致?；蚪Y(jié)構(gòu)及基序分析結(jié)果顯示，CpWRKY家族在基因結(jié)構(gòu)和保守基序組成上存在組間差異，但組內(nèi)具有相似性，即各類CpWRKY之間內(nèi)含子、外顯子數(shù)目及基因結(jié)構(gòu)差異較大，但同一類或同一亞類成員之間又有一定的相似性，如Ⅱd和Ⅱe亞家族都含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，Ⅲ類CpWRKY均由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成；在保守基序組成上也有類似特點(diǎn)，各類CpWRKY既具有一致的保守域，又有比較豐富的其他基序。這些特點(diǎn)與WRKY功能的多樣性相一致。順式作用元件分析結(jié)果顯示，CpWRKY啟動(dòng)子序列中有大量參與生物脅迫與非生物脅迫的相關(guān)元件，暗示CpWRKY廣泛參與這些過程,這與低溫、干旱、傷害、PRSV等脅迫可誘導(dǎo)CpWRKY基因表達(dá)的研究結(jié)果[23]一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，炭疽菌侵染后番木瓜耐性品種‘G20’和敏感品種‘Y61’中分別有37和36個(gè)CpWRKY基因表達(dá)量發(fā)生了變化，分別占CpWRKY家族總數(shù)的77.08%和75.00%，說明CpWRKY廣泛參與炭疽病脅迫過程，這與葡萄經(jīng)白腐病脅迫后，超過57%的WRKY表達(dá)量發(fā)生變化的結(jié)果[20]一致。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，‘G20’和‘Y61’中有29個(gè)相同的CpWRKY基因被炭疽菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度有差異，且這些基因中包括大量參與植物免疫反應(yīng)基因的同源基因。如CpWRKY45的同源基因WRKY51參與擬南芥茉莉酸誘導(dǎo)的防御反應(yīng)[43]；CpWRKY18的同源基因WRKY55可通過調(diào)控?cái)M南芥活性氧和水楊酸生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，正向調(diào)控?cái)M南芥葉片衰老和防御反應(yīng)[44]；CpWRKY12的同源基因WRKY72參與番茄和擬南芥的基礎(chǔ)免疫以及番茄R基因Mi-1介導(dǎo)的基因?qū)虻目剐訹45]；CpWRKY8的同源基因WRKY40參與擬南芥鐮刀菌脅迫[46]；CpWRKY40的同源基因WRKY29在擬南芥先天免疫反應(yīng)和對小麥赤霉病抗性的免疫途徑中發(fā)揮重要作用[47-48]。結(jié)果表明，這些基因應(yīng)是廣泛參與番木瓜炭疽菌侵染響應(yīng)過程的基因，其表達(dá)強(qiáng)度不同可能是導(dǎo)致‘G20’和‘Y61’抗病性不同的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，‘Y61’中有CpWRKY1、CpWRKY32、CpWRKY39和CpWRKY46等4個(gè)特異表達(dá)的基因，僅CpWRKY1的同源基因WRKY4有參與植物抗病過程的報(bào)道[49]；而‘G20’中有CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY2、CpWRKY33和CpWRKY25等5個(gè)特異表達(dá)基因，均在炭疽菌侵染后上調(diào)表達(dá)，除CpWRKY22外，其余4個(gè)的同源基因都參與植物抗病途徑[50-53]，其中CpWRKY33的同源基因AtWRKY50編碼的轉(zhuǎn)錄因子能與TGA2和TGA5相互作用，協(xié)同增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活PR1(擬南芥PR1是SA誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性SAR標(biāo)記基因)的表達(dá)，抵御病原菌侵染[50]。CpWRKY25的同源基因WRKY47過量表達(dá)可以提高水稻對半活體生物營養(yǎng)型真菌稻瘟病菌的抗性，但具體作用機(jī)制還不清楚[51]。CpWRKY11的同源基因AtWRKY20編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以與編碼病程相關(guān)蛋白的基因4PR4/AtHEL的啟動(dòng)子結(jié)合，介導(dǎo)SAR反應(yīng)，從而對多種植物病原真菌產(chǎn)生抗性[52]。CpWRKY2的同源基因AtWRKY57在擬南芥受到腐生型真菌灰霉菌侵染時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)，其與茉莉酸ZIM-DOMAIN1(JAZ1)和JAZ5的啟動(dòng)子結(jié)合，激活JAZ1和JAZ5轉(zhuǎn)錄(JAZ1和JAZ5編碼JA信號通路的2個(gè)重要抑制子)，負(fù)調(diào)控?cái)M南芥對灰霉菌的抗性[53]。本研究炭疽菌接種后，CpWRKY2的表達(dá)也上調(diào)，與擬南芥的結(jié)果一致，但其對番木瓜抗性影響的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究鑒定出了48個(gè)CpWRKY家族基因，其結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白基序具有組間多樣性和組內(nèi)保守性。CpWRKY家族成員強(qiáng)烈響應(yīng)番木瓜短胞炭疽菌的誘導(dǎo)，其中CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY2、CpWRKY33和CpWRKY25是潛在的番木瓜炭疽病抗性基因，對分子育種有潛在的應(yīng)用價(jià)值。