◎ 張 華，姜 慶，吳 迪，張 新

（臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276000）

引起食源性疾病的致病菌很多，金黃色葡萄球菌是其中非常重要的一個(gè)，金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧食源性病原體，能夠在7.0～48.5 ℃、pH 4.2～9.3和NaCl濃度為0%～15%的這些外在因素中廣泛存在，且金黃色葡萄球菌很容易從各種食物中分離出來(lái)，如牛奶、乳制品、肉類和雞肉等，從而嚴(yán)重威脅著人們的身體健康[1-2]。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[3]，其中九大類食品分別對(duì)金黃色葡萄球菌的限量進(jìn)行了要求，充分體現(xiàn)了金黃色葡萄球菌在食品安全檢驗(yàn)中是非常重要的一個(gè)指標(biāo)。

盲樣考核是為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，確保日常檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠而必須進(jìn)行的一項(xiàng)質(zhì)量控制活動(dòng)。2021年8月，臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心參加了由山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院組織的食品安全承檢機(jī)構(gòu)奶粉中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)的盲樣考核活動(dòng)，結(jié)果滿意，現(xiàn)將試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

盲樣考核樣品1份，編號(hào)為NFJP1606；在棕色西林瓶?jī)?nèi)有0.5 g白色球狀樣品，避光儲(chǔ)存于-20 ℃內(nèi)；樣品中的含量水平為0～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Baird-Parker瓊脂，批號(hào)：190713；亞碲酸鉀卵黃增菌液，批號(hào)：201130；腦心浸出液肉湯（BHI），批號(hào)：190419；血平板，即用型培養(yǎng)基，批號(hào)：210725；凍干兔血漿，批號(hào)：201214；磷酸鹽緩沖液（貯存液），批號(hào)：201108；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)：200526，所使用的培養(yǎng)基都從北京陸橋技術(shù)股份有限公司購(gòu)買且在保質(zhì)期內(nèi)；革蘭氏染色試劑盒；批號(hào)：6106229，從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司采購(gòu)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

陰性對(duì)照菌為表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]，從中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心采購(gòu)；陽(yáng)性對(duì)照菌為金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心采購(gòu)。

1.4 設(shè)備和耗材

ZGP-2270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海智誠(chéng)公司）；MLS3780高壓蒸汽滅菌器（日本三洋公司）；TE212-L電子天平（賽多利斯公司）；微量移液槍（Gilson公司）；AC2-4S1生物安全柜（ESCD）、顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；XH-C快速混勻器（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 樣品前處理

依據(jù)《2021年承檢機(jī)構(gòu)盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書》，從-20 ℃冰柜中取出盲樣考核樣品NFJP1606，將西林瓶在室溫下放置5 min。在生物安全柜中進(jìn)行無(wú)菌操作，樣品已按照0.5 g精確稱量后分裝，無(wú)需再稱量取樣，計(jì)算時(shí)按照0.5 g計(jì)算。加入4.5 mL滅菌PBS復(fù)溶后得到1∶10稀釋度的樣品勻液，然后進(jìn)行10倍系列稀釋，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋梯度，每個(gè)稀釋度都使用新的無(wú)菌吸頭吸取前一稀釋度的樣品勻液，且吸頭不能碰觸樣品勻液液面。

1.5.2 樣品接種

根據(jù)此次盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書，樣品需至少進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，樣品中的含量水平為0～1.0×106CFU·g-1。選擇10-1～10-6稀釋度的樣品勻液。依據(jù)GB 4789.10—2016中第二法對(duì)樣品進(jìn)行接下來(lái)的檢測(cè)。從每個(gè)稀釋度取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的樣品混勻液各加入到3塊B-P平板里，且每個(gè)稀釋度分別做3次重復(fù)，然后用無(wú)菌涂布棒涂布B-P平板，盡量在平板培養(yǎng)基中間區(qū)域涂布，避免涂布到平板邊緣。

1.5.3 培養(yǎng)

為了使涂布的樣品混勻液吸收，先把B-P平板正置，放在36 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1 h，觀察到液體吸收后，再將B-P平板倒置，培養(yǎng)直至48 h。按照GB 4789.10—2016第二法的要求，對(duì)B-P平板上的典型菌落及可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，再進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，按照陽(yáng)性比例確定最終的計(jì)數(shù)結(jié)果[4]。

2 結(jié)果與分析

按照盲樣作業(yè)指導(dǎo)書和GB 4789.10—2016的要求，從10-1～10-6稀釋度進(jìn)行取樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NFJP1606樣品中，在10-1、10-2、10-3稀釋度的平板里生長(zhǎng)出只有一種特征的典型菌落，沒(méi)有其他可疑菌落生長(zhǎng)。統(tǒng)計(jì)Baird-Parker平板上的典型菌落數(shù)見表1。

表1 Baird-Parker平板金黃色葡萄球菌典型菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表

從B-P平板上挑取典型菌落劃線接種于血平板后，血平板上均出現(xiàn)了典型的金黃色葡萄球菌可疑菌落特征，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢與血漿凝固酶試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 選擇性分離平板菌落特征與鑒定結(jié)果表

金黃色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征符合金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)的典型特征。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列成葡萄串狀，也有個(gè)別2個(gè)或3個(gè)球菌相連，無(wú)芽孢和莢膜，直徑大小為0.5～1.0 μm；接種于血平板上，是金黃色圓形菌落、光滑凸起濕潤(rùn)、周圍有溶血圈，符合金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)的典型特征。

血漿凝固酶試驗(yàn)必須設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對(duì)照，以無(wú)菌生理鹽水作為空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)3 h后凝固，陰性對(duì)照和空白對(duì)照培養(yǎng)6 h后仍未凝固[5]。盲樣考核樣品NFJP1606的典型菌落在培養(yǎng)3 h后全都凝固，判定為陽(yáng)性結(jié)果。最終確認(rèn)結(jié)果為 8.0×103CFU·g-1。

3 結(jié)論與討論

本次盲樣考核樣品，奶粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)的 B-P平板計(jì)數(shù)結(jié)果為8.0×103CFU·g-1，Z值小于2，為滿意結(jié)果。由此可見該實(shí)驗(yàn)室具備金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力。

目前，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都是定量檢驗(yàn)，金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制盲樣考核的一項(xiàng)重要項(xiàng)目，有利于實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，從而改進(jìn)工作，提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平，有效控制和判斷實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)檢測(cè)能力[6]。因此，在進(jìn)行盲樣考核等試驗(yàn)過(guò)程中，以下問(wèn)題應(yīng)該引起注意。①對(duì)接收到的樣品要認(rèn)真進(jìn)行檢查，確認(rèn)是否完整，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)溝通。②試驗(yàn)前認(rèn)真閱讀作業(yè)指導(dǎo)書，作業(yè)指導(dǎo)書往往會(huì)對(duì)本次盲樣考核的樣品、試驗(yàn)方法、結(jié)果記錄等會(huì)有特別要求，如本次盲樣考核要求樣品每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不一樣。③試驗(yàn)前做好準(zhǔn)備工作，包括儀器設(shè)備的校準(zhǔn)、試運(yùn)行，培養(yǎng)基試劑是否齊全；有條件可以購(gòu)買指控樣品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，提前發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并進(jìn)行解決。④盲樣考核試驗(yàn)要求非常精確，可以找一位經(jīng)驗(yàn)豐富的監(jiān)督員，特別是對(duì)于新手而言，參加盲樣考核活動(dòng)的機(jī)會(huì)少，防止出現(xiàn)操作失誤，影響考核結(jié)果。⑤定量檢測(cè)項(xiàng)目一般表明樣品范圍，可多做幾個(gè)稀釋度，確保結(jié)果準(zhǔn)確，特別是在制作稀釋梯度時(shí)，9 mL的稀釋液要用無(wú)菌緩沖液分裝到無(wú)菌試管里，防止梯度稀釋液多少不均勻，影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。⑥Baird-Parker瓊脂平板的狀態(tài)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，因此要使Baird-Parker平板表面保持干燥，發(fā)現(xiàn)Baird-Parker平板表面有水滴時(shí)一定要使平板表面完全干燥后，再進(jìn)行涂布。⑦要盡快涂布Baird-Parker平板上的菌液，同時(shí)涂布棒在平板中間區(qū)域涂布，不要碰觸平板邊緣，避免引起菌落蔓延生長(zhǎng)。⑧完成試驗(yàn)后，因?yàn)橥坎家汉心谭鄄蝗菀孜眨上葘⑵桨逭旁谂囵B(yǎng)箱（36±1）℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置培養(yǎng)。⑨做好對(duì)照試驗(yàn)，做血漿凝固酶試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照必須同時(shí)做好，按照標(biāo)準(zhǔn)要求每30 min觀察1次，觀察6 h。

盲樣考核能使實(shí)驗(yàn)室管理者和實(shí)驗(yàn)人員對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和人員的檢驗(yàn)?zāi)芰τ幸粋€(gè)客觀的認(rèn)識(shí)，是實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的科學(xué)有效的技術(shù)方式，有利于實(shí)驗(yàn)室自身能力的提高和檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性的提升。