朱琳琳 張明明 郭格格 徐祉軒

中圖分類號(hào) R965;R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）09-1082-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.10

摘 要 目的 研究藍(lán)萼甲素（GLA）對(duì)人肝癌HCCLM3細(xì)胞自噬與凋亡的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。方法 HCCLM3細(xì)胞按不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕O(shè)對(duì)照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組。對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)基，各給藥組分別加入含GLA相應(yīng)終質(zhì)量濃度的完全培養(yǎng)基。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布與凋亡情況;采用透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)和自噬情況（僅設(shè)對(duì)照組、GLA 5 μg/mL組）;采用JC-1染色和熒光倒置顯微鏡觀察并檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Beclin1、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）蛋白的表達(dá);采用免疫共沉淀法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2與Beclin1的結(jié)合與解離（僅設(shè)GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組）。結(jié)果 與對(duì)照組相比，GLA 5、10 μg/mL能夠誘發(fā)細(xì)胞周期顯著阻滯于G2～M期、誘導(dǎo)線粒體膜電位顯著下降、增加促凋亡作用，還能顯著促進(jìn)Bax、cleaved caspase-3、Beclin1蛋白表達(dá)，顯著抑制Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.01）;GLA 5 μg/mL還可引發(fā)線粒體形態(tài)顯著改變，自噬小體增多。免疫共沉淀法結(jié)果顯示，與GLA 5 μg/mL比較，GLA 10 μg/mL能夠增強(qiáng)Bcl-2與Beclin1的結(jié)合。結(jié)論 GLA可能通過Bcl-2/Beclin1靶點(diǎn)調(diào)節(jié)HCCLM3細(xì)胞自噬與凋亡，且作用效果與劑量密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 藍(lán)萼甲素;靶點(diǎn);機(jī)制;自噬;凋亡;Bcl-2;Beclin1

Study on regulation mechanism of glaucocalyxin A on the autophagy and apoptosis of HCCLM3 hepatocellular carcinoma cells through Bcl-2/Beclin1 target

ZHU Linlin，ZHANG Mingming，GUO Gege，XU Zhixuan（School of Laboratory Medicine， Xinxiang Medical University/Henan Collaborative Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine/Henan Key Laboratory of Immunology and Targeted Therapy， Henan Xinxiang 453003， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To study the regulatory mechanism of glaucocalyxin A （GLA） on autophagy and apoptosis of HCCLM3 hepatocellular carcinoma cells. METHODS HCCLM3 cells were taken， and control group， GLA 2.5 μg/mL group， GLA 5 μg/mL group and GLA 10 μg/mL group were mainly set according to different experimental purposes. In control group， only complete medium was added; in each administration group， complete medium containing the corresponding final concentration of GLA was added. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry; mitochondrial morphology and autophagy were observed by transmission electron microscope （only control group， GLA 5 μg/mL group）; JC-1 staining and fluorescence inverted microscope were used to observe and detect the mitochondrial membrane potential of the cells; Western blot assay was used to detect the protein expression of Bcl-2， Bax， Beclin1 and cleaved caspase-3 proteins in the cells; the co-immunoprecipitation method was used to detect the binding and dissociation of Bcl-2 and Beclin1 （only GLA 5 μg/mL group， GLA 10 μg/mL group）. RESULTS Compared with control group， GLA 5 μg/mL and GLA 10 μg/mL could induce a significant arrest of the cell cycle in the G2-M phase for HCCLM3， a significant decrease in mitochondrial membrane potential， an increase in apoptosis as well as significant promotion of the protein expression of Bax， cleaved caspase-3 and Beclin1， and significant inhibition of the protein expression of Bcl-2 （P<0.01）. GLA 5 μg/mL also significantly changed mitochondrial morphology and increased autophagosomes. The results of co-immunoprecipitation showed that compared with GLA 5 μg/mL， GLA 10 μg/mL could enhance the binding of Bcl-2 and Beclin1. CONCLUSIONS GLA can regulate the autophagy and apoptosis of HCCLM3 cells by Bcl-2/Beclin1 target. The effect is closely related to the dose of GLA.

KEYWORDS ? glaucocalyxin A; target; mechanism; autophagy; apoptosis; Bcl-2; Beclin1

細(xì)胞自噬與凋亡存在諸多聯(lián)系，與一系列基因激活、表達(dá)調(diào)控相關(guān)。正常情況下，兩者處于平衡狀態(tài);藥物、環(huán)境可以打破二者平衡，引發(fā)細(xì)胞走向不同結(jié)局，從而促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)展。藍(lán)萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是從中草藥香茶菜中分離提取的活性成分。基礎(chǔ)研究表明，其具有良好的抗腫瘤作用，能夠通過線粒體活性氧調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬，也可通過線粒體Bcl-2相關(guān)信號(hào)通路引起細(xì)胞周期阻滯并誘發(fā)細(xì)胞凋亡[1-5]。可見，GLA調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、凋亡均與線粒體密切相關(guān)。

研究證實(shí)，Bcl-2通過與自噬相關(guān)蛋白Beclin1結(jié)合可抑制細(xì)胞自噬，兩者解離則促進(jìn)細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Beclin1復(fù)合體對(duì)細(xì)胞自噬與凋亡轉(zhuǎn)歸具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，GLA對(duì)Bcl-2相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)作用[7]。若能闡明GLA在細(xì)胞自噬與凋亡過程中的作用靶點(diǎn)，有效利用GLA調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡轉(zhuǎn)歸，對(duì)臨床抗腫瘤治療具有重要意義。肝癌是常見的惡性腫瘤，也是臨床治療效果欠佳的腫瘤，亟需尋找療效好、不良反應(yīng)小的藥物。因此，本研究以人肝癌HCCLM3細(xì)胞系為載體，以線粒體信號(hào)通路中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡平衡的Bcl-2/Beclin1復(fù)合體為靶點(diǎn)，探討GLA調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡轉(zhuǎn)歸的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，為深入研究GLA的抗腫瘤作用機(jī)制、開發(fā)臨床抗腫瘤新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scien- tific公司;1658033型電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;5804R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;FACS Carlibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;Axio Vert.A1型熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司;HT 7800型透射電鏡購(gòu)自日本Hitachi公司;Azure 600型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Azure公司。

1.2 藥物與試劑

GLA由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，純度為99.8%（高效液相色譜法）。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、L-谷氨酰胺、青鏈霉素混合液（批號(hào)分別為D8371、P1020、G0200、P1400）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為P0012、C1052、C2006）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)abs50001）購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;兔源性Bax抗體、Bcl-2抗體、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）抗體、Beclin1抗體（批號(hào)分別為ab32503、ab32124、ab32042、ab210498）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;鼠源性β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗與山羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)分別為3700S、7074S、7076S）購(gòu)自美國(guó)CST公司;電鏡固定液（批號(hào)G1102）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞

人肝癌HCCLM3細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

2 方法

2.1 GLA母液配制

取500 μg GLA溶于50 μL二甲基亞砜中，制備成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液，分裝保存于-20 ℃冰箱，使用時(shí)用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至不同濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HCCLM3細(xì)胞在含10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)研究目的，細(xì)胞周期、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)設(shè)對(duì)照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組;細(xì)胞自噬病理觀察設(shè)對(duì)照組、GLA 5 μg/mL組;Bcl-2與Beclin1的結(jié)合與解離實(shí)驗(yàn)設(shè)GLA 5 μg/mL組、GLA 10 ? μg/mL組。對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)基;GLA各給藥組根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)[7]，分別加入含相應(yīng)終質(zhì)量濃度GLA的完全培養(yǎng)基。

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板，每孔含1×106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞按照“2.2”項(xiàng)下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒操作說明書收集、固定細(xì)胞，染色，上機(jī)分析細(xì)胞周期分布。利用Flow Jo軟件分析G0、G1、G2、S、M期細(xì)胞占比。

2.4 線粒體膜電位檢測(cè)

采用JC-1染色和熒光倒置顯微鏡觀察并檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞接種于12孔板中，每孔含5×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞按照“2.2”項(xiàng)下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。采用JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中紅綠熒光并拍照。紅綠熒光強(qiáng)度的比值提示線粒體膜電位的變化：當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集產(chǎn)生紅色熒光;當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，JC-1主要為單體，產(chǎn)生綠色熒光。

2.5 細(xì)胞自噬病理觀察

采用透射電鏡觀察。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿含5×106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)皿。將細(xì)胞按照“2.2”項(xiàng)下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。以磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1 mL尖底離心管，以1 000 r/min離心5 min，吸棄磷酸鹽緩沖液，加10倍體積電鏡固定液固定細(xì)胞，觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)和自噬情況，并拍照。

2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板中，每孔含1×106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞按照“2.2”項(xiàng)下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，以預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸細(xì)胞，采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的Annexin Ⅴ-FITC 標(biāo)記，避光、室溫孵育15 min，以PI染色后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.7 細(xì)胞中自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板中，每孔含1×106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞按照“2.2”項(xiàng)下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞總蛋白并以BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取蛋白適量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后依次轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Beclin1、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃搖床孵育過夜;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000），室溫?fù)u床孵育1 h;洗膜后曝光，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像、掃描。以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 細(xì)胞中Bcl-2與Beclin1的結(jié)合與解離狀態(tài)檢測(cè)

采用免疫共沉淀法檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿含5×106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)皿。按照“2.2”項(xiàng)下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。取2組蛋白樣品分裝于IgG陰性對(duì)照管、檢測(cè)管中。IgG陰性對(duì)照管中加入IgG抗體，用于消除非特異性蛋白的影響，作為陰性對(duì)照;檢測(cè)管中加入Bcl-2抗體，用于收集與Bcl-2結(jié)合的Beclin1蛋白。將上述陰性對(duì)照管和檢測(cè)管于4 ℃搖床孵育過夜，每管加入瓊脂糖凝珠，篩選出與Bcl-2結(jié)合的Beclin1蛋白，變性處理后以Western blot法檢測(cè)Bcl-2與Beclin1結(jié)合的蛋白表達(dá)情況。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 GLA對(duì)HCCLM3細(xì)胞周期阻滯的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，GLA 5 ? ?μg/mL組、GLA 10 μg/mL組HCCLM3細(xì)胞周期顯著阻滯于G2～M期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），尤以GLA 10 μg/mL組作用更為明顯;而GLA 2.5 μg/mL組的細(xì)胞周期阻滯作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1、表1。

3.2 GLA對(duì)HCCLM3細(xì)胞線粒體膜電位的影響

細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果顯示，對(duì)照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組細(xì)胞中紅綠熒光強(qiáng)度比值分別為1.712±0.335、1.673±0.297、0.541±0.134、0.117±0.041。與對(duì)照組比較，GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組細(xì)胞紅綠熒光強(qiáng)度比值降低，提示線粒體膜電位降低，尤以GLA 10 μg/mL組下降更為顯著（P<0.01）。結(jié)果見圖2。

3.3 GLA對(duì)HCCLM3細(xì)胞線粒體形態(tài)和自噬的影響

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，GLA 5 μg/mL組細(xì)胞線粒體高度腫脹，嵴模糊不清甚至消失，出現(xiàn)較多自噬小體;對(duì)照組細(xì)胞線粒體形態(tài)無(wú)異常。結(jié)果見圖3。

3.4 GLA對(duì)HCCLM3細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組的細(xì)胞凋亡率分別為（3.277±0.415）%、（4.087±0.945）%、（17.625±1.433）%、（74.673±3.402）%。與對(duì)照組比較，GLA 2.5 μg/mL組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組均顯示出顯著的促凋亡作用（P<0.01），且GLA 10 μg/mL組促凋亡作用更明顯。結(jié)果見圖4。

3.5 GLA對(duì)HCCLM3細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Beclin1蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組HCCLM3細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3、 Beclin1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

3.6 GLA對(duì)HCCLM3細(xì)胞中Bcl-2與Beclin1結(jié)合與解離的影響

免疫共沉淀法檢測(cè)結(jié)果見圖6，圖中Bcl-2列、Beclin1行上的條帶代表與Bcl-2結(jié)合的Beclin1的量。圖6B中的條帶比圖6A中條帶明顯，說明GLA 10 μg/mL組Beclin1與Bcl-2的結(jié)合較多。IgG列為陰性對(duì)照，Input列為陽(yáng)性對(duì)照，兩組之間均無(wú)明顯差異。由此可見，與GLA 5 μg/mL組比較，GLA 10 μg/mL組HCCLM3細(xì)胞中Bcl-2與Beclin1的結(jié)合增強(qiáng)。

4 討論

細(xì)胞周期是細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期（G1、S、G2期）與分裂期（M期）：G2期是DNA復(fù)制結(jié)束與有絲分裂開始之間的間隙，為進(jìn)入M期提供物質(zhì)條件;G2～M期是細(xì)胞處于復(fù)雜活躍的分子水平變化時(shí)期，容易受外界條件的影響;而G0期是具有分裂能力但暫時(shí)未進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞。如果能夠人為調(diào)控細(xì)胞周期，對(duì)深入認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生及研究抗腫瘤藥物的作用機(jī)制具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，GLA能夠誘發(fā)膀胱癌細(xì)胞周期阻滯[4]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，GLA 5、10 μg/mL能夠誘發(fā)人肝癌HCCLM3細(xì)胞明顯阻滯于G2～M期。

細(xì)胞周期阻滯后通常會(huì)誘導(dǎo)線粒體膜電位改變，線粒體跨膜電位下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)[8]。本研究中熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，GLA 5、10 μg/mL作用于HCCLM3細(xì)胞24 h，均可誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，其中GLA 10 μg/mL誘導(dǎo)作用更為明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，GLA 10 μg/mL作用于HCCLM3細(xì)胞24 h，其促凋亡作用更為明顯。這提示GLA促進(jìn)細(xì)胞凋亡與其誘導(dǎo)線粒體膜電位下降相關(guān)，GLA能夠通過線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。

Bax與Bcl-2是線粒體凋亡途徑的重要因子，也是內(nèi)源性凋亡的主要調(diào)控者。研究顯示，細(xì)胞受到信號(hào)分子刺激后，Bax形成寡聚體，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與Bcl-2形成多聚體，通過在線粒體外膜上形成孔洞來增強(qiáng)線粒體膜的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，誘發(fā)caspase蛋白酶家族的酶聯(lián)激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。Bcl-2的過表達(dá)與較多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，以Bcl-2為靶點(diǎn)的藥物研究一直是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[11-13]。

香茶菜屬于傳統(tǒng)中草藥，因其活性強(qiáng)、毒性小而備受關(guān)注。GLA是從香茶菜中分離提取的活性成分，民間用于抗炎、抗腫瘤治療歷史悠久[1-3]?；A(chǔ)研究顯示，在肝癌、膀胱癌、骨肉瘤等裸鼠模型中，GLA能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)主要臟器無(wú)明顯的毒副作用[2-4，9]。本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，GLA 10 μg/mL能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，GLA 10 μg/mL能夠顯著促進(jìn)Bax、cleaved caspase-3、Beclin1蛋白表達(dá)，顯著抑制Bcl-2蛋白表達(dá)。這提示GLA可通過線粒體通路促進(jìn)HCCLM3細(xì)胞凋亡，且存在劑量效應(yīng)趨勢(shì)。

細(xì)胞自噬作為細(xì)胞程序性死亡的另一種方式，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。線粒體也是參與細(xì)胞自噬的重要細(xì)胞器。Beclin1介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路與Bax/Bcl-2線粒體凋亡通路之間存在交叉[14-15]。Beclin1通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Bax與Bcl-2的結(jié)合，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;相反，Beclin1也可與Bcl-2解離，不影響B(tài)ax與Bcl-2的結(jié)合，同時(shí)釋放游離Beclin1，促進(jìn)細(xì)胞自噬[14]。研究顯示，Beclin1過表達(dá)可以降低線粒體膜電位，并通過與Bcl-2結(jié)合增加順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15];孕酮受體拮抗劑能夠減弱Bcl-2與Beclin1結(jié)合，通過Bcl-2/Beclin1軸調(diào)節(jié)子宮肌瘤細(xì)胞自噬與凋亡[16];氧化魚油也能夠抑制Bcl-2與Beclin1結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞自噬，并導(dǎo)致線粒體功能障礙[17]。Beclin1與Bcl-2的結(jié)合在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡轉(zhuǎn)歸中意義重大。本研究通過免疫共沉淀法檢測(cè)，結(jié)果顯示Bcl-2與Beclin1在HCCLM3細(xì)胞中相互作用，且GLA 10 μg/mL作用于HCCLM3細(xì)胞 24 h，能夠促進(jìn)Bcl-2與Beclin1結(jié)合。再根據(jù)Western blot法檢測(cè)結(jié)果，筆者推測(cè)GLA 10 μg/mL在促進(jìn)Bcl-2與Beclin1結(jié)合的同時(shí)，也促進(jìn)HCCLM3細(xì)胞表達(dá)Bax蛋白，使細(xì)胞中Bax/Bcl-2比值升高，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，由于Bcl-2與Beclin1的結(jié)合抑制了Beclin1參與細(xì)胞自噬激活，所以GLA 10 ?μg/mL的作用主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相較而言，GLA 5 μg/mL作用于HCCLM3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中Bcl-2與Beclin1的結(jié)合較少，因此，該劑量GLA促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用較為明顯，透射電鏡下可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多自噬小體。以往研究也顯示，Bcl-2與細(xì)胞凋亡蛋白和細(xì)胞自噬蛋白存在交叉反應(yīng)[18-19]，提示Bcl-2極有可能在細(xì)胞自噬與凋亡之間起關(guān)鍵性調(diào)控作用。

研究顯示，多種中草藥活性成分均能夠誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡并激活細(xì)胞自噬，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)[20]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，GLA對(duì)人肝癌HCCLM3細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、侵襲能力、遷移能力具有雙向調(diào)節(jié)作用，且效果呈劑量效應(yīng)關(guān)系[7]。本研究結(jié)果顯示，GLA可通過線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞自噬與凋亡，并對(duì)Bcl-2與Beclin1的結(jié)合與解離具有雙向調(diào)節(jié)作用，提示GLA可能通過Bcl-2/Beclin1靶點(diǎn)調(diào)節(jié)HCCLM3細(xì)胞自噬與凋亡，作用效果依然可能呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，GLA可能通過Bcl-2/Beclin1靶點(diǎn)調(diào)節(jié)HCCLM3細(xì)胞自噬與凋亡，且作用效果與劑量密切相關(guān)。

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（收稿日期：2021-10-26 修回日期：2022-03-06）

（編輯：舒安琴）