高 莉, 李曉明, 楊 波, 秦 英, 程 冬, 鄭麗飛, 李 里

(1. 四川省雅安市人民醫(yī)院 血液內(nèi)科, 四川 雅安, 625000;2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 四川 瀘州, 646000; 3. 四川省南充市中心醫(yī)院, 四川 南充, 737003)

急性髓細(xì)胞白血病(AML)是一類常見(jiàn)的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，以阿糖胞苷為代表的核苷類似物是常用的治療AML的化療藥物[1-2]。和許多其他化療藥物一樣，阿糖胞苷等也不可避免地出現(xiàn)耐藥情況，導(dǎo)致AML的完全緩解率不足50%，且容易產(chǎn)生耐藥[3-4]。目前關(guān)于阿糖胞苷的耐藥機(jī)制仍不十分清楚，致使臨床上在應(yīng)對(duì)阿糖胞苷耐藥時(shí)的干預(yù)策略有限，限制了AML患者治療療效。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是指一類長(zhǎng)度200～100 000 nt的RNA分子，在包括AML在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[5-6]。lncRNA CBR3-AS1是近年來(lái)研究較熱的lncRNA家族成員，如lncRNA CBR3-AS1被報(bào)道[7]在乳腺癌中高表達(dá)，且和TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，和更低的無(wú)瘤生存率、總生存率相關(guān); lncCBR3-AS1促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，且是影響骨肉瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。研究[9-10]報(bào)道lncRNA參與了AML的阿糖胞苷耐藥過(guò)程，但lncRNA CBR3-AS1在AML中的作用及其與化療耐藥的關(guān)系的報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CBR3-AS1在阿糖胞苷耐藥的AML細(xì)胞株中表達(dá)升高，且lncRNA CBR3-AS1通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR/S6K通路調(diào)節(jié)阿糖胞苷的耐藥，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系的培養(yǎng)與耐藥株的構(gòu)建

AML細(xì)胞系K562(人髓系白血病細(xì)胞株)和HL-60(人急性早幼粒白血病細(xì)胞)均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，采用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng), 37 ℃、5% CO2于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1 次。構(gòu)建耐藥株時(shí)，以半數(shù)抑制濃度(IC50)為誘導(dǎo)的起始濃度，培養(yǎng)至細(xì)胞可穩(wěn)定增殖后，以2倍濃度的濃度梯度遞增，直至阿糖胞苷濃度超過(guò)1 000 μmol/L時(shí)細(xì)胞仍可穩(wěn)定增殖，視為阿糖胞苷耐藥。

1.2 IC50測(cè)定

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)細(xì)胞種板至96孔板中，設(shè)置8個(gè)濃度梯度，分別為5、1.5、0.45、0.135、0.040 5、0.012 15、0.003 645、0.001 093 5、0.000 328 05 mmol/L, 各設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育30 min, 在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)值。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)OD450 nm-空白OD450 nm)/(對(duì)照OD450 nm-空白OD450 nm)×100%。利用GraphPad軟件計(jì)算IC50。

1.3 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及siRNA的轉(zhuǎn)染

構(gòu)建lncRNA CBR3-AS1過(guò)表達(dá)及對(duì)照空載質(zhì)粒(吉?jiǎng)P基因公司)、靶向lncRNA CBR3-AS1的siRNA及對(duì)照無(wú)靶向siRNA。細(xì)胞種至6孔板后，利用Lipo 3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA, 轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。靶向lncRNA CBR3-AS1 的siRNA序列為5′-GTCTCCTGAGCTCAGGAAA-3′, 對(duì)照siRNA序列為5′-GATATGGGCTGAATACAAA-3′。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA CBR3-AS1表達(dá)

取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，利用Trizol提取總RNA, 利用Genecopia逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 依據(jù)定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。LncRNA CBR3-AS1的引物序列如下(5′→3′): 上游引物CTGTCGCCCAGGCTGGAGTGC; 下游引物GACGCCGTGGGTCCTTCTCATC。內(nèi)參β-actin的引物序列如下: 上游引物CATGTACGTTGCTATCCAGGC; 下游引物CTCCTTAATGTCACGCACGAT。

1.5 蛋白印跡法

利用RIPA提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總蛋白，加苯甲基磺酰氟(PMSF)和磷酸酶抑制劑防止蛋白降解與去磷酸化。一抗anti-p-PI3K、anti-p-AKT、anti-p-mTOR、anti-p-S6K、anti-GAPDH均購(gòu)自Cell Signaling Technology, 二抗anti-mouse(1∶5 000)、anti-rabbit(1∶5 000)購(gòu)自Affinity。總蛋白80 V恒壓電泳后200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h, 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h, 一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，二抗室溫?fù)u床孵育2 h后，用辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)蛋白表達(dá)。GAPDH作為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA CBR3-AS1在阿糖胞苷耐藥的細(xì)胞株中表達(dá)升高

為了研究阿糖胞苷在AML細(xì)胞株中的耐藥機(jī)制，建立了2個(gè)AML細(xì)胞株耐阿糖胞苷模型。首先檢測(cè)K562和HL-60細(xì)胞株阿糖胞苷的IC50, 結(jié)果表明K562和HL-60的阿糖胞苷IC50分別為13.65 μmol/L和4.62 μmol/L。利用小劑量梯度遞增法，建立了K562和HL-60耐阿糖胞苷的細(xì)胞株，分別命名為K562-R和HL-60-R, 2個(gè)耐藥細(xì)胞株的IC50均超1 000 μmol/L(P<0.05)(圖1A)。為了研究lncRNA CBR3-AS1在阿糖胞苷耐藥中的作用, RT-qPCR檢測(cè)lncRNA CBR3-AS1在野生及耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在K562-R和HL-60-R中, lncRNA CBR3-AS1的表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B), 提示lncRNA CBR3-AS1可能參與AML細(xì)胞阿糖胞苷耐藥。

A: K562-R和HL-60-R對(duì)阿糖胞苷的耐藥性明顯增強(qiáng); B: RT-qPCR結(jié)果提示K562-R和HL-6-R中,lncRNA CBR3-AS1的表達(dá)均升高，與野生株比較, *P<0.05。

2.2 過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1導(dǎo)致野生株繼發(fā)耐藥

為驗(yàn)證lncRNA CBR3-AS1在AML細(xì)胞阿糖胞苷耐藥中的作用，構(gòu)建lncRNA CBR3-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到K562和HL-60細(xì)胞株中(圖2A), 利用CCK-8法檢測(cè)IC50, 發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1后，阿糖胞苷在K562和HL-60細(xì)胞的IC50升高并超過(guò)1 000 μmol/L, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。

A: RT-qPCR驗(yàn)證lncRNA CBR3-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在K562和HL-60細(xì)胞株中的構(gòu)建，與對(duì)照比較, *P<0.05;B: 過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1后，阿糖胞苷在K562和HL-60細(xì)胞的IC50升高。

構(gòu)建靶向lncRNA CBR3-AS1的siRNA, 并轉(zhuǎn)染到K562-R和HL-60-R細(xì)胞系中(圖3A)。利用CCK-8法檢測(cè)IC50發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA CBR3-AS1后，阿糖胞苷在耐藥細(xì)胞株K562-R和HL-60-R中的IC50分別降低到21.27 μmol/L和12.10 μmol/L, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。這些結(jié)果表明, lncRNA CBR3-AS1可能介導(dǎo)了AML細(xì)胞株的阿糖胞苷耐藥。

A: RT-qPCR驗(yàn)證siRNA lncRNA CBR3-AS1在K562-R和HL-60-R細(xì)胞株中的構(gòu)建，與對(duì)照siCTL比較, *P<0.05;B: 敲低LncRNA CBR3-AS1后，阿糖胞苷在K562-R和HL-60-R細(xì)胞株中的IC50升高。

2.3 LncRNA CBR3-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR/S6K通路介導(dǎo)阿糖胞苷耐藥

在K562-R細(xì)胞株過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1, 蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照(control), 過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1提高了磷酸肌醇3激酶(PI3K)、AKT、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、S6K等蛋白的磷酸化水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。在K562-R細(xì)胞株中，相較于對(duì)照中(siCTL), 利用siRNA敲低lncRNA CBR3-AS1, 降低了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4B)。上述研究結(jié)果表明, lncRNA CBR3-AS1通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR/S6K通路介導(dǎo)了阿糖胞苷耐藥。

A: 相較于control, 過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1顯著提高了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平; B: 相較于siCTL, siRNA中PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平顯著降低。圖4 lncRNA CBR3-AS1激活K562-R細(xì)胞株的PI3K/AKT/mTOR/S6K通路

在HL-60細(xì)胞株過(guò)表達(dá)lnc CBR3-AS1, 蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照(control), 過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1提高了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。在HL-60細(xì)胞株中，相較于對(duì)照(siCTL), 利用siRNA敲低lncRNA CBR3-AS1, 降低了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B)。上述研究結(jié)果表明, lncRNA CBR3-AS1通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR/S6K通路介導(dǎo)了阿糖胞苷耐藥。

3 討 論

目前, AML患者化療的完全緩解率及無(wú)進(jìn)展生存率仍較低，對(duì)于AML阿糖胞苷耐藥的分子機(jī)制的研究將有助于進(jìn)一步深入理解AML化療耐藥的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于臨床開(kāi)發(fā)新的克服耐藥策略具有重要的指導(dǎo)意義。

A: 相較于control中,過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1顯著提高了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平; B: 相較于對(duì)照中(siCTL), siRNA中PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平顯著降低。圖5 lncRNA CBR3-AS1激活HL-60細(xì)胞株的PI3K/AKT/mTOR/S6K通路

lncRNA CBR3-AS1位于羰基還原酶3(CBR3)的反義區(qū)域，在乳腺癌、胃癌、膽管癌等中均觀察到lncRNA CBR3-AS1高表達(dá)[11-13]。然而, lncRNA CBR3-AS1在AML中的表達(dá)和功能報(bào)道較少。研究[14]表明, P13K/AKT/mTOR/S6K通路參與腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，在細(xì)胞的增殖、分化、代謝、生存等方面發(fā)揮重要作用。P13K/AKT/mTOR/S6K通路信號(hào)的持續(xù)激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖信號(hào)過(guò)度活化和凋亡信號(hào)抑制，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控。研究[15]表明，超過(guò)50%的AML中都存在PI3K/AKT/mTOR/S6K信號(hào)通路的異?；罨?。

在K562和HL-60細(xì)胞系中建立了一個(gè)耐藥倍數(shù)接近或超過(guò)100倍的阿糖胞苷耐藥模型，通過(guò)PCR定量的方法發(fā)現(xiàn)lncRNA CBR3-AS1在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)顯著升高。在耐藥株中利用siRNA敲低lncRNA CBR3-AS1可以極大降低阿糖胞苷的IC50, 逆轉(zhuǎn)K562和HL-60的耐藥表型。而在野生株中過(guò)表達(dá)K562和HL-60, 也可以極大提高阿糖胞苷的IC50, 誘導(dǎo)耐藥表型。這些數(shù)據(jù)表明, lncRNA CBR3-AS1介導(dǎo)了阿糖胞苷在K562和HL-60中的耐藥。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)lncRNA CBR3-AS1顯著提高了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平，敲低lncRNA CBR3-AS1顯著降低了PI3K、AKT、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平，提示lncRNA CBR3-AS1可能是通過(guò)激活P13K/AKT/mTOR/S6K通路誘導(dǎo)阿糖胞苷的耐藥。

相較于其他長(zhǎng)鏈非編碼RNA, lncRNA CBR3-AS1在腫瘤耐藥中的研究較少，且主要集中于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用[16-17]。研究[11]表明, lncRNA CBR3-AS1在乳腺癌中通過(guò)調(diào)節(jié)c-Jun氨基末端激酶-1(JNK1)/絲裂原活化蛋白激酶(MEK4)介導(dǎo)的MAPK通路導(dǎo)致了阿霉素耐藥，這提示lncRNA CBR3-AS1可能在包括阿霉素、阿糖胞苷在內(nèi)的多種化療藥物耐藥機(jī)制中具有相似的重要作用, lncRNA CBR3-AS1可能作為多重耐藥機(jī)制的共同干預(yù)靶點(diǎn)。

本研究也存在不足, lncRNA CBR3-AS1可能通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR/S6K通路介導(dǎo)了在AML阿糖胞苷耐藥的結(jié)論推導(dǎo)均基于離體的細(xì)胞學(xué)水平，在體研究中仍有必要進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步的研究有必要從動(dòng)物模型考察和分析lncRNA CBR3-AS1與PI3K/AKT/mTOR/S6K通路活性的關(guān)系。

綜上所述, lncRNA CBR3-AS1可能通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR/S6K通路介導(dǎo)了在AML阿糖胞苷耐藥，這為新藥研發(fā)及臨床治療AML阿糖胞苷耐藥提供了新的靶點(diǎn)和思路。