■王 妍 鄭猛虎 崔欣雨 韋子海 吳冠中 徐春城*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083；2.寧波寧興涌優(yōu)飼料有限公司，浙江 寧波 315311）

紅薯是世界上的主要糧食作物之一，紅薯淀粉渣（以下簡稱紅薯渣）為紅薯淀粉加工業(yè)的主要副產(chǎn)物。由于紅薯渣含有單寧、胰蛋白酶抑制劑等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，不適合直接飼喂動物。且紅薯渣含水量極高，不便儲存和運(yùn)輸，大量廢棄紅薯渣的堆積，極易發(fā)生腐敗，造成環(huán)境的污染以及資源的浪費(fèi)等問題[1]。如果能對其進(jìn)行合理利用，不僅具有良好的經(jīng)濟(jì)與社會效益，因生產(chǎn)淀粉產(chǎn)生的環(huán)境污染問題也可以得到有效解決。

紅薯渣富含水分、淀粉、纖維素等物質(zhì)[2]，從而可以作為許多微生物產(chǎn)品的發(fā)酵基質(zhì)。許多學(xué)者利用紅薯渣發(fā)酵生產(chǎn)乳酸[3]、檸檬酸[4]、酶制劑[5]、青貯飼料[6]、微生物蛋白飼料[7]等。其中，發(fā)酵紅薯渣生產(chǎn)蛋白飼料不僅具有成本較低、工藝簡單的優(yōu)點(diǎn)，還可以緩解我國畜牧業(yè)高蛋白飼料短缺的壓力。歐榮娣等[7]以紅薯渣為原料，采用固態(tài)混菌二次發(fā)酵工藝生產(chǎn)菌體蛋白飼料，一階段厭氧發(fā)酵，二階段好氧發(fā)酵，產(chǎn)物粗蛋白含量達(dá)到了15.11%，較對照組提高了45.33%。Zhao 等[8]研究了多種微生物對紅薯渣固態(tài)發(fā)酵的影響，通過復(fù)合微生物發(fā)酵使其粗蛋白含量從6.37%提高到9.75%。Zuo 等[9]利用米曲霉和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵紅薯飲料渣，使發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量達(dá)到15.58%。但目前為止，這些研究大都是以粗蛋白含量作為指標(biāo)，由于在發(fā)酵底物中添加了尿素等無機(jī)氮作為氮源，所以粗蛋白含量的增加是必然的，并不能準(zhǔn)確反映發(fā)酵后產(chǎn)物真蛋白含量的實際變化。本試驗以紅薯渣為研究對象，通過單因素試驗分析微生物種類、微生物組合、接種比例以及接種量對紅薯渣發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。旨在充分利用農(nóng)業(yè)食品業(yè)副產(chǎn)品資源，同時緩解我國高蛋白飼料的壓力，為微生物復(fù)合發(fā)酵紅薯渣提高真蛋白含量提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

紅薯渣：由浙江省寧波寧興涌優(yōu)飼料有限公司提供，水分含量73.2%，真蛋白含量2.02%。

麩皮：市售麩皮，水分含量10.0%，真蛋白含量10.32%。

尿素、（NH4）2SO4、K2HPO4、MgSO4、MnSO4：北京化工廠生產(chǎn)的化學(xué)純試劑。

1.2 菌種

黑曲霉（Aspergillus nigerCGMCC 3.01858）、米曲霉（Aspergillus oryazeKU320673）、里氏木霉（Trichoder?ma reeseiCGMCC 3.3711）、康寧木霉（Trichoderma kon?ingiiCGMCC 3.11416）、黃孢原毛平革菌（Phanero?chaete chrysosporiumCGMCC 5.829）、糙皮側(cè)耳（Pleuro?tus ostreatusCGMCC 5.374）、槭射脈革菌（Phlebia aceri?naCGMCC 5.927）、白囊耙齒菌（Irpex lacteusCGMCC 5.809）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisKU 239979）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisMN 658807）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megateriumCGMCC 1.7993）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae KC 881067）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisCGMCC 2.1012）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Picha kudriavzeviiMK 592835）均為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院飼料調(diào)制與加工實驗室購買或保藏菌株。

1.3 種子液的制備

1.3.1 霉菌種子液

4 ℃斜面保存的霉菌接種于PDA培養(yǎng)基（Nissui，日本）上活化，28 ℃培養(yǎng)5～7 d 以獲得高密度的分生孢子，用0.9%生理鹽水溫和洗滌，從培養(yǎng)基中收集孢子，經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)使孢子濃度為107CFU/mL。孢子懸浮液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 白腐真菌瓊脂塊

4 ℃斜面保存的白腐菌用接種鏟取一小塊長滿菌絲的培養(yǎng)基（約3 mm×3 mm），將其轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上活化，置于28 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，待菌絲長滿平板后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 芽孢桿菌種子液

4 ℃斜面保存的芽孢桿菌接種于NB培養(yǎng)基（奧博星生物技術(shù)有限公司，北京）上活化，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，作為一級培養(yǎng)種子；再將一級種子液接種于NB培養(yǎng)基于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，使其濃度為107CFU/mL 作為二級種子培養(yǎng)液。置于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 酵母菌種子液

4 ℃斜面保存的酵母菌接種于PDB培養(yǎng)基（奧博星生物技術(shù)有限公司，北京）上活化，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，作為一級培養(yǎng)種子；再將一級種子液接種于PDB 培養(yǎng)基于30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，使其濃度為107CFU/mL 作為二級種子培養(yǎng)液，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 固態(tài)發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵在250 mL 錐形瓶中進(jìn)行。培養(yǎng)基組成（干物質(zhì)）為：16 g 紅薯渣、4 g 麩皮、0.3 g 尿素、0.3 g（NH4）2SO4、0.12 g K2HPO4、0.01 g MgSO4、0.02 g MnSO4。在121 ℃下高壓蒸汽滅菌30 min。按照試驗具體設(shè)計在超凈工作臺接入菌種，用無菌水調(diào)節(jié)水分至60%，并用無菌玻璃棒混勻，用封口膜密封，在28 ℃、75%濕度的霉菌培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物置于65 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干48 h，粉碎過1 mm 篩，用于后續(xù)成分測定。每個處理設(shè)置3 個平行。

1.5 單因素試驗

1.5.1 單菌篩選

利用1.2節(jié)中的14株菌對紅薯渣進(jìn)行單菌發(fā)酵，接種量為1×106CFU/g DM。測定發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量。

1.5.2 菌種組合篩選

利用1.5.1 節(jié)中篩選出的菌株，對紅薯渣進(jìn)行菌種復(fù)合發(fā)酵，每種組合為等比例接種，總接種量為1×106CFU/g DM。測定發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量。

1.5.3 接種比例優(yōu)化

利用1.5.2節(jié)中篩選的菌株組合，設(shè)計不同接種比例對紅薯渣進(jìn)行發(fā)酵，總接種量為1×106CFU/g DM。測定發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量。

1.5.4 接種量優(yōu)化

按照篩選出的菌種組合及比例，設(shè)計不同接種量，對紅薯渣進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

利用Design Expert 10.0 設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗方案，確定發(fā)酵溫度、初始含水量、發(fā)酵時間三者的最佳組合，優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量。變量定義為發(fā)酵溫度（X1，℃）、初始含水量（X2，%）和發(fā)酵時間（X3，h），響應(yīng)變量為真蛋白含量（Y，%）。試驗數(shù)據(jù)根據(jù)以下二階多項式方程進(jìn)行回歸：

式中：β0——設(shè)計中心點(diǎn)（0，0，0）的擬合響應(yīng)值，為常數(shù)；

βi——線性值；

βii——二次項；

βij——叉積回歸項。

1.7 真蛋白的測定

稱取10 g 三氯乙酸溶于500 mL 燒杯中，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入1 L容量瓶中定容，后轉(zhuǎn)入帶蓋廣口瓶，制得三氯乙酸溶液，并置于4 ℃冰箱備用。準(zhǔn)確稱取0.5 g粉碎后樣品置于125 mL 錐形瓶中，加入50 mL 預(yù)冷的純化水放置30 min，再加入10 mL配好的三氯乙酸溶液放置30 min。采用定量濾紙重力過濾，用三氯乙酸溶液沖洗2次，用預(yù)冷的純化水沖洗2次。65 ℃將濾紙烘干，再將濾紙和殘渣轉(zhuǎn)入消化管，用凱式定氮法測定氮含量，以濾紙作為空白對照。

1.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以3個平行的平均值表示。數(shù)據(jù)使用Excel 2019進(jìn)行處理后，使用IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。使用Design Expert 13.0軟件建立真蛋白含量的響應(yīng)面模型，并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵

14株菌單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵紅薯渣的結(jié)果見表1。未發(fā)酵的培養(yǎng)基的真蛋白含量為3.68%，作為對照組。4種霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05），且米曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量最高。4種白腐真菌和3種芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量與對照組沒有顯著性差異（P>0.05）。酵母菌中，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

表1 單菌發(fā)酵結(jié)果（%）

2.2 菌株組合篩選

根據(jù)單菌發(fā)酵的結(jié)果，挑選黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、巨大芽孢桿菌、畢赤酵母、產(chǎn)朊假絲酵母設(shè)計了9 種不同的菌種組合，發(fā)酵結(jié)果見表2。所有復(fù)合菌種發(fā)酵組的真蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中，以米曲霉、巨大芽孢桿菌、畢赤酵母為組合的發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量最高，達(dá)到8.81%。

表2 復(fù)合菌發(fā)酵結(jié)果（%）

2.3 接種比例

以米曲霉、巨大芽孢桿菌、畢赤酵母為組合，以不同的接種比例對紅薯渣進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見表3。所有處理組的發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，當(dāng)米曲霉∶巨大芽孢桿菌∶畢赤酵母為3∶2∶1時，真蛋白含量最高，達(dá)到9.62%。

表3 不同接種比例發(fā)酵結(jié)果（%）

2.4 接種量

固定菌種的比例為米曲霉∶巨大芽孢桿菌∶畢赤酵母為3∶2∶1，以不同接種量對紅薯渣進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見表4。所有處理組的真蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。隨著接種量的增加，真蛋白含量呈先升高后降低的趨勢。其中，以接種量為1×106CFU/g DM時效果最佳，真蛋白含量為9.62%。

表4 不同接種量發(fā)酵結(jié)果（%）

2.5 基于響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

以Design Expert 軟件設(shè)計出的三因素三水平中心組合試驗見表5，共20 組試驗，其中包括6 個中心點(diǎn)。自變量的值表示為編碼值和實際值。方差分析結(jié)果見表6，通過ANOVA 分析，該模型的F值為27.57，表明模型是極顯著的（P＜0.000 1）。失擬項不顯著（P>0.05）。R2、R和R分別為0.961 3、0.926 4和0.846 8，均接近于1，表明試驗值與預(yù)測值之間具有良好的相關(guān)性。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析得出回歸方程。

表5 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果

表6 方差分析表

根據(jù)F檢驗，發(fā)酵溫度、初始含水量和發(fā)酵時間的線性項和二次項均極顯著(P＜0.01)，說明這3 個因素及他們的平方項均對響應(yīng)變量有顯著影響。發(fā)酵溫度和初始含水量之間的交互作用顯著（P＜0.05），其他的交互項沒有顯著影響（P>0.05）。兩兩之間對真蛋白含量的交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面如圖1～圖3 所示。發(fā)酵溫度和含水量之間有一定的交互效應(yīng)，表現(xiàn)為曲線有一定坡度；溫度和時間、含水量和時間的交互作用較小，曲線較為平滑，響應(yīng)值變化較小，圖形結(jié)果與模型分析結(jié)果相吻合。

圖1 發(fā)酵溫度和初始含水量對真蛋白含量的影響

圖2 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對真蛋白含量的影響

圖3 初始含水量和發(fā)酵時間對真蛋白含量的影響

2.6 驗證試驗

為了進(jìn)一步驗證模型的可靠性，進(jìn)行驗證試驗。Design Expert 軟件模擬的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度33.10 ℃、初始含水量66.12%、發(fā)酵時間86.04 h，預(yù)測此條件下的真蛋白含量為12.06%。選擇發(fā)酵溫度33 ℃、初始含水量66%、發(fā)酵時間86 h 條件驗證，真蛋白含量為12.11%，接近模型的最優(yōu)預(yù)測值。

3 討論

3.1 菌種篩選

不同種類的微生物對紅薯渣固態(tài)發(fā)酵有著不同的效果。霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量顯著高于其他類型的微生物，表明霉菌發(fā)酵有利于發(fā)酵中真蛋白含量的增加。白腐真菌沒有產(chǎn)生類似的效果，可能是由于發(fā)酵時間短，白腐真菌還未能在發(fā)酵基質(zhì)上完全生長[10]。Zuo 等[9]使用不同種類的微生物發(fā)酵紅薯飲料渣，米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量從6.49%增加到13.78%，本試驗的結(jié)果與其基本一致。

本試驗篩選的菌種組合為米曲霉、巨大芽孢桿菌、畢赤酵母，且以3∶2∶1的比例接種1×106CFU/g DM時效果最佳，該結(jié)果與前人的研究相似。Ding等[11]使用枯草芽孢桿菌、黑曲霉和釀酒酵母的混合菌株對茶渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，粗蛋白含量顯著增加。Lei 等[12]使用白地霉、扣囊腹膜酵母和熱帶假絲酵母對馬鈴薯淀粉渣進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵終產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量為20.96%，達(dá)到馬鈴薯淀粉渣原料的3 倍以上。Shi 等[13]研究了黑曲霉、假絲酵母和枯草芽孢桿菌對鼓槌樹葉的固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵后粗蛋白、小肽和氨基酸的濃度明顯增加。許多研究都表明，與單菌發(fā)酵相比，混合菌株發(fā)酵對固態(tài)發(fā)酵有著更好的效果。因為微生物共同培養(yǎng)時，會對代謝途徑產(chǎn)生潛在的協(xié)同作用。霉菌和芽孢桿菌酶系統(tǒng)發(fā)達(dá)[14]，酵母菌含有蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分[15]，且可以利用小分子糖類物質(zhì)生成蛋白，這或許是復(fù)合發(fā)酵更能產(chǎn)生高蛋白含量的原因。合適的菌種比例可以使微生物將協(xié)同作用發(fā)揮得更好。合適的接種量也是發(fā)酵過程中的一個重要因子，接種量過少，微生物不能發(fā)揮效果；接種量過多，微生物會競爭有限的生長底物。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

中心組合試驗等響應(yīng)面法是近年來使用較多的試驗優(yōu)化方法，它能通過多變量試驗來模擬真實極限狀態(tài)面。本試驗采用三因素三水平中心組合試驗對發(fā)酵溫度、初始含水量和發(fā)酵時間進(jìn)行了優(yōu)化。方差分析結(jié)果表明該模型是合理的。等高線圖和三維響應(yīng)面圖解釋了真蛋白含量與所涉及的3 個變量之間的關(guān)系，它們可以直觀反映各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響程度，等密度線越密，曲面越陡，影響越顯著[16]。本試驗中發(fā)酵溫度和初始含水量之間有一定的交互效應(yīng)，表現(xiàn)為P＜0.05，曲線有一定坡度，說明發(fā)酵溫度和初始含水量對紅薯渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量有潛在影響。對軟件分析的最優(yōu)條件的多次驗證試驗具有穩(wěn)定性，這表明模型具有良好的可靠性和重現(xiàn)性。

4 結(jié)論

米曲霉、巨大芽孢桿菌和畢赤酵母以3∶2∶1的比例接種1×106CFU/g DM 時可以提高紅薯渣發(fā)酵后的真蛋白含量。響應(yīng)面法優(yōu)化的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度33 ℃、初始含水量66%、發(fā)酵時間86 h。此條件下發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量最高，為12.11%，約為未發(fā)酵底物的3倍。因此，復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵紅薯渣可作為提高真蛋白含量的有效生產(chǎn)工藝。