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      核酸適配體比色傳感器快速檢測(cè)貝類中大田軟海綿酸

      2022-05-20 08:45:32王曉煜勞敏軍胡慧利吳益春鄧尚貴
      關(guān)鍵詞:比色貝類光度

      王曉煜,勞敏軍,胡慧利,周 勇,吳益春,鄧尚貴,胡 藝,于 瑾

      (1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江舟山 316022;2.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司,浙江舟山 316000;3.杭州市質(zhì)量技術(shù)協(xié)會(huì),浙江杭州 310019;4.舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,浙江舟山 316000;5.浙江恒和食品有限公司,浙江舟山 316000;6.龍游縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心,浙江龍游 324000)

      大田軟海綿酸(okadaic acid,OA)是腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poisons,DSP)的1 種,是一種主要存在于藻類植物中的小分子腹瀉性貝類毒素,主要是由利瑪原甲藻Procentrum lima 產(chǎn)生[1],經(jīng)貝類攝入后富集在消化腺內(nèi)[2]。OA 是無(wú)色晶體,能溶于甲醇、乙醇和乙醚等有機(jī)溶劑,不溶于水,無(wú)色,無(wú)味,容易誤食,導(dǎo)致食物中毒[3],引起腹瀉、惡心、嘔吐、腹痛等癥狀[4]。此外,OA 具有脂溶性和熱穩(wěn)定性,在加工過程中很難通過尋常的加工技術(shù)將其去除,甚至可能因貝類脫水及酯化態(tài)毒素向游離態(tài)的轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致毒素的毒性增強(qiáng)。

      目前OA 常見的檢測(cè)方法如小鼠生物測(cè)定法(MBA)[5]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[6]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)[7]、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制分析(PPIA)[8]、高效液相色譜(HPLC)[9]、電泳法[10]等。傳統(tǒng)的OA 檢測(cè)技術(shù)存在一定的局限性,通常需要昂貴的儀器,或者需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間,無(wú)法滿足快速檢測(cè)的要求。

      生物傳感器因其靈敏度高、快速便攜等優(yōu)勢(shì)在檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注,核酸適配體也因其能與目標(biāo)物如重金屬離子、毒素、抗生素或病毒等高親和力、高特異性結(jié)合的特點(diǎn),得到廣泛的應(yīng)用[11]。本研究基于磁分離富集核酸適配體技術(shù),構(gòu)建了一種核酸適配體比色傳感器,用于快速檢測(cè)大田軟海綿酸。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      大田軟海綿酸(okadaic acid,OA,(8.4±0.4)μg·mL-1)、鰭藻毒素-1(dinophysistoxin1-b,DTX-1(10.4±0.8)μg·mL-1)和鰭藻毒素-2(dinophysistoxin2-b,DTX-2,(3.8±0.2)μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自加拿大國(guó)家海洋研究中心,大田軟海綿酸適配體序列為5′-GGTCACCAACAACAGGGAGCGCTACGCGAAGGGTCAATGTGACGTCATGCGGATGTGTGG-3′,固定鏈序列為5′-GTAGCGCTCCCTGTTGTTGGTGACC-(CH)3-SH-3′,探針鏈序列為5′-SH-(CH)6-CCACACATCCGCATGACGTCACATTGAC-3′由上海生工生物工程股份有限公司合成,Tris-EDTA 緩沖液,四氧化三鐵磁性納米微球(-NH,5 mg·mL-1),6-巰基-1-己醇(MCH,98%),三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP,98%),均購(gòu)自百塞生物,過氧化物酶購(gòu)自阿拉丁,實(shí)驗(yàn)所需其他分析純級(jí)化學(xué)品和試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,樣本來(lái)源于舟山市市場(chǎng)在售貝類。

      1.2 儀器與設(shè)備

      UV-2600 紫外可見光分光光度計(jì)(日本島津企業(yè)管理有限公司);MS-3 渦旋振蕩器(德國(guó)IKA 公司);UVR 超純水機(jī)(法國(guó)Millipore 公司);電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);KQ-600DV 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);離心機(jī)Centrifuge 5920R 型(德國(guó)Eppendorf 公司);萬(wàn)用電熱器(嘉興市鳳橋電熱器廠)。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

      分別吸取一定體積的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇制備成1.0 μg·mL-1和100 ng·mL-1濃度的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,儲(chǔ)存于4 ℃以下避光。

      吸取一定體積的鰭藻毒素-1 標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇制備成100 ng·mL-1濃度的鰭藻毒素-1 標(biāo)準(zhǔn)溶液,儲(chǔ)存于4 ℃以下避光。

      吸取一定體積的鰭藻毒素-2 標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇制備成100 ng·mL-1濃度的鰭藻毒素-2 標(biāo)準(zhǔn)溶液,儲(chǔ)存于4 ℃以下避光。

      1.3.2 樣品制備

      該研究的社會(huì)經(jīng)濟(jì)數(shù)據(jù)來(lái)源為2005—2013年《山東省統(tǒng)計(jì)年鑒》。區(qū)域土地利用結(jié)構(gòu)的變化由自然因素和社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素共同決定,由于研究期內(nèi)區(qū)域內(nèi)自然因素條件的變化很小,所以該研究主要考察社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素指標(biāo)的影響,選擇了11項(xiàng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展指標(biāo)[12-13]:總?cè)丝?X1)、人口密度(X2)、農(nóng)村人口(X3)、地區(qū)總產(chǎn)值(X4)、糧食總產(chǎn)量(X5)、城鎮(zhèn)居民人均可支配收入(X6)、第一產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值(X7)、第二產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值(X8)、第三產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值(X9)、人均GDP(X10)、固定資產(chǎn)總投資(X11)。

      根據(jù)《GB 5009.212-2016 貝類中腹瀉性貝類毒素的測(cè)定》對(duì)樣品進(jìn)行制備。用清水洗凈貝類樣品外表,切斷閉殼肌,開殼,用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他異物,取出貝肉。不要破壞閉殼肌以外的組織,尤其是中腸腺(組織呈暗綠色或褐綠色)。將去殼貝肉置于篩網(wǎng)上,瀝水5 min,將貝肉剪碎。-20 ℃密封保存。

      1.3.3 毒素提取

      將處理后的試樣解凍后均質(zhì),準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.1 g)于50 mL 帶蓋離心管中,加入9 mL 80%甲醇,渦旋混合1 min,超聲提取10 min,8 000 r·min-1離心5 min,移出上清液于20 mL 刻度玻璃器皿中。殘?jiān)屑尤? mL 80%甲醇,重復(fù)提取1 次,合并提取液,用80%甲醇定容至20 mL。

      1.3.4 納米金制備

      參考張萬(wàn)方等[12]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改,具體如下:首先將需要使用的玻璃器皿在王水里面浸泡不少于12 h,用超純水清洗,干燥備用。將1 g 氯金酸溶解在100 mL 超純水中,配成1%(g/g)的氯金酸貯存液,儲(chǔ)存于避光4 ℃以下。取4.12 mL 的氯金酸貯存液加入100 mL 超純水溶液中攪拌加熱至沸騰。然后快速加入10 mL 1%(g/g)的檸檬酸三鈉溶液,發(fā)現(xiàn)溶液在5 min 內(nèi)由無(wú)色變成黑色再變成酒紅色。煮沸15 min 后,停止加熱,冷卻至室溫,并在4 ℃避光保存。

      1.3.5 納米金標(biāo)記活化巰基探針鏈

      參考DITTMER W U[13]和關(guān)樺楠[14]方法進(jìn)行適當(dāng)結(jié)合修改,具體如下:取15 mL 的帶具塞離心管加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液里面浸泡1 h 后用純水沖洗干凈,干燥備用。將探針鏈1 000 r·min-1離心60 s 后,使用TE緩沖液配制成100 μmol·L-1的儲(chǔ)備液。取9 μL 濃度為1 μmol·L-1的巰基化的探針鏈加入1.5 mL 的離心管中,然后再加入10 μL 500 mmol·L-1醋酸鈉溶液(pH 5.2)和15 μL 10 mmol·L-1TCEP 溶液,室溫下孵育活化1 h,孵育結(jié)束后,將上述反應(yīng)液與5 mL 納米金溶液(用K2CO3調(diào)節(jié)pH 為9.0)加入被氫氧化鈉浸泡過的帶具塞離心管中,蓋上蓋子后輕輕搖勻,再加入10 μL 0.5 mg·mL-1HRP 室溫下避光孵育16 h。

      1.3.6 制備納米金磁珠(AuMNPs)

      取1 mL 5 mg·mL-1四氧化三鐵磁性納米微球,磁分離后去除上清液,用純水洗滌后加入3 mL 納米金溶液,避光保存8 h。

      1.3.7 AuMNPs-Apt 的合成

      先將固定鏈1 000 r·min-1離心60 s 后,使用TE 緩沖液配制成100 μmol·L-1的儲(chǔ)備液。再將100 μmol·L-1的儲(chǔ)備液稀釋成50 μmol·L-1。取9 μL 50 μmol·L-1固定鏈和10 μL 10 mmol·L-1TCEP,活化1 h。磁珠與納米金混合液離心后用純水重懸,加入活化后的固定鏈,4 ℃孵育過夜。加入500 μL 1 mmol·L-1MCH 30 min以封閉多余活性點(diǎn)位。用純水沖洗2~3 次,加入10 μL 1 μmol·L-1OA 適配體鏈,孵育8 h。

      1.3.8 制備檢測(cè)OA 的比色適配體傳感器

      取過量的含活化探針鏈的納米金溶液和200 μL AuMNPs 于1.5 mL 離心管孵育2 h。配制待測(cè)溶液,加入上述溶液混勻1 h。加入100 μL 顯色液(15% H2O2,2 mmol·L-1TMB,pH 4.0)混勻。等待10~15 min,測(cè)定吸光度。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 檢測(cè)原理

      DNA 適配體能識(shí)別和靶向特異性分子并形成特異性三級(jí)結(jié)構(gòu),DNA 適配體同時(shí)也能形成雙鏈結(jié)構(gòu)及其互補(bǔ)鏈,但適配體鏈與靶分子間的結(jié)合作用大于雙鏈DNA,因此,由于它處于互補(bǔ)的雙鏈核酸適配體中,并且處于靶分子環(huán)境中,它們更有可能特異性地與靶分子結(jié)合,形成適配體靶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此,利用這一特性,設(shè)計(jì)了一種夾心式DNA 適配體來(lái)檢測(cè)溶液中OA 的濃度。首先,通過Au-S 鍵將補(bǔ)充OA適體5 端的巰基修飾的固定鏈自組裝到磁珠上[15]。然后用MCH 阻斷多余活性位點(diǎn),與適體鏈進(jìn)行雜交。與OA 適配體鏈雜交后,加入一定濃度的HRP-金納米顆粒標(biāo)記的探針鏈,與OA 適配體鏈的3 端結(jié)合,因此,形成了具有HRP 納米金標(biāo)記的適體傳感器。探針鏈能夠特異性識(shí)別OA 分子,適配體鏈與OA 結(jié)合并在磁性作用下分離。溶液中存在HRP 酶,HRP 對(duì)TMB-H2O2混合溶液發(fā)生氧化還原反應(yīng),產(chǎn)生顏色變化[16]。

      2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

      2.2.1 核酸適配體濃度的優(yōu)化

      適配體含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果有顯著影響。當(dāng)適體含量過低時(shí),它不能與納米金膠體溶液完全連接。因此,不管目標(biāo)物是否存在,納米金膠體溶液在鹽溶液的作用下都會(huì)聚集變色,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[17]。適體的含量太高時(shí),溶液中的游離適體首先與靶目標(biāo)完全結(jié)合,使得吸附在金納米孔膠體溶液表面的適體不能完全解吸,導(dǎo)致納米金膠體溶液的分離受到適體的保護(hù),導(dǎo)致假陰性結(jié)果[18]。因此,需要優(yōu)化適體的濃度。

      分別取50 μL 不同濃度的核酸適配體溶液,濃度分別為0.1、1、10 和100 μmol·L-1。進(jìn)行1.3.5~1.3.8 步驟實(shí)驗(yàn)進(jìn)行,最后,分別掃描400~800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜,重復(fù)3 次,結(jié)果如圖1。隨著適體含量的增加,AuNPs 溶液在520 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值逐漸增大,而在650 nm 波長(zhǎng)處吸光度值逐漸減小。結(jié)果表明,隨著適體濃度的增加AuNPs 的聚集被逐漸抑制。因此,最佳的適體濃度為1.0 μmol·L-1AuNPs。

      圖1 核酸適配體溶液對(duì)吸光度的影響(n=3)Fig.1 Influence of aptamer solution on absorbance(n=3)

      2.2.2 HRP 濃度的優(yōu)化

      HRP 對(duì)TMB-H2O2混合溶液會(huì)產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)變色,而HRP 的濃度會(huì)對(duì)變色反應(yīng)產(chǎn)生影響[19]。保持其他條件不變,只改變HRP 濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖2,可得HRP 的濃度對(duì)整體的顯色反應(yīng)影響不大,通過吸光度來(lái)看0.5 mg·mL-1的HRP 對(duì)顯色效果較好。如圖3,隨著HRP 的濃度增大,反應(yīng)時(shí)間縮短,但濃度過大會(huì)抑制反應(yīng)速率,從而增加反應(yīng)時(shí)間。因此,選擇0.5 mg·mL-1為最佳的HRP 濃度。

      圖2 HRP 的濃度對(duì)吸光度的影響Fig.2 Influence of HRP concentration on absorbance

      圖3 HRP 的濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間的影響(n=3)Fig.3 Influence of HRP concentration on reaction time(n=3)

      2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶劑曲線

      在最佳條件下,采用610 nm 和520 nm 之間的吸收比(A610/A520)來(lái)確定OA 濃度。配置不同濃度的OA 溶液(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 和100 ng·mL-1),加入制備好的比色生物傳感器,再加入顯色液,進(jìn)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。見圖4,5 顯示了不同OA 濃度的生物傳感器的吸附光譜和顏色變化,隨著OA 濃度的增加,觀察到傳感器的明顯分散現(xiàn)象,610 nm 處的吸光值(表示聚集的AuNP)和520 nm 處的吸光度增加(表示分散的AuNP)。圖6 表示OA 濃度在0~10 ng·mL-1范圍內(nèi)吸光度比(A610/A520)可以看出0.2~2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有線性關(guān)系,圖7 表示在0.2~2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2=0.995 8。根據(jù)分光光度法檢出限計(jì)算,算得檢出限(LOD)為0.045 ng·mL-1。

      圖4 不同濃度OA 溶液的吸收光譜圖Fig.4 Absorption spectra of OA solutions with different concentrations

      圖5 不同濃度OA 溶液的顏色Fig.5 Colors of OA solutions with different concentrations

      圖6 OA 濃度在0 到10 ng·mL-1 范圍內(nèi)吸光度比(A610/A520)Fig.6 Absorbance ratio of OA concentration in the range of 0 to 10 ng·mL-1(A610/A520)

      圖7 OA 濃度在0.2 到2.0 ng·mL-1 范圍內(nèi)吸光度比(A610/A520)Fig.7 Absorbance ratio of OA concentration in the range of 0.2 to 2.0 ng·mL-1(A610/A520)

      2.4 傳感器分析性能

      根據(jù)2.3 在最佳條件下,采用吸光度比值(A610/A520)來(lái)確定OA 濃度。用陰性的貽貝基質(zhì)配置不同濃度的OA 溶液(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10 和20 ng·mL-1),加入制備好的比色生物傳感器,再加入顯色液,進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。圖8 表示在0.2~2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2=0.998 9。根據(jù)分光光度法進(jìn)行檢出限計(jì)算,算得檢出限(LOD)為0.044 ng·mL-1。從圖8 可以得出基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本方法的OA 影響較小。

      圖8 OA 濃度在0.2 到2.0 ng·mL-1 范圍內(nèi)吸光度比(A610/A520)Fig.8 Absorbance ratio of OA concentration in the range of 0.1 to 2.0 ng·mL-1(A610/A520)

      為了進(jìn)一步檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)際樣品中OA 的新方法的可行性,選取3 種陰性的貝類樣本進(jìn)行加標(biāo)回收,設(shè)置(0.5、1.0、2.0 ng·mL-1)3 個(gè)濃度,每個(gè)濃度3 個(gè)平行,按照最佳的試驗(yàn)方案進(jìn)行,計(jì)算回收率,如表1,平均回收率為82.23%~98.73%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為3.34%~10.88%,表明本方法有較好回收率和精密度。

      表1 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.1 Sample spiked recovery test results(n=3)

      2.5 特異性研究

      OA 與其衍生物鰭藻毒素DTX-1 和DTX-2 的分子結(jié)構(gòu)非常相似,分別配制濃度為10 ng·mL-1的DTX-1 和DTX-2 進(jìn)行測(cè)試,以考察傳感器的特異性。結(jié)果如圖9 表明,研制的傳感器對(duì)OA 具有高度特異性,對(duì)DTX-1 和DTX-2 的吸光度接近納米金的測(cè)試背景值,表明此傳感器能夠?qū)R恍宰R(shí)別OA,其衍生物毒素的存在不干擾OA 的檢測(cè)。

      圖9 核酸適配體傳感器對(duì)不同貝類毒素和納米金溶液的吸光度比(A610/A520)Fig.9 Absorbance ratio of nucleic acid aptamer sensor to different shellfish toxin and nano-gold solution(A610/A520)

      2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

      采用自制的比色型適配體生物傳感器對(duì)市售的4 種貝類樣品測(cè)定,結(jié)果見表2。10 個(gè)實(shí)際樣品中,除9、10 號(hào)盲樣外均未檢出。

      表2 實(shí)際樣品檢測(cè)Tab.2 Actual sample detection

      3 總結(jié)

      本次研究開發(fā)了一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的快速且靈敏的比色適配體生物傳感器。在0.2~2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9,檢測(cè)限為0.044 ng·mL-1。在對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)中平均回收率在82.23%~98.73%之間,表明該方法具有較好的回收率。適配體的特異性識(shí)別與顯色反應(yīng)體系保證了生物傳感器檢測(cè)OA 有良好選擇性和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,該方法快速、方便、靈敏,為OA 的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了新思路。

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