方 晉，朱平平，彭慧倩，覃智恒，劉育文，彭 穎

(南華大學(xué)藥學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

艾葉，為菊科蒿屬植物艾ArtemisiaargyiLevl.etVant.的葉，味辛、苦，性溫，有溫經(jīng)止血、祛濕止癢、散寒止痛等功效[1]。艾葉廣泛分布于亞洲東部，全草入藥，是我國傳統(tǒng)的預(yù)防鼠疫、炎癥、癌癥、痛經(jīng)等疾病的中草藥[2-3]。此外，艾葉還可用于艾灸、驅(qū)趕蚊蟲，用艾水洗澡或熏蒸可止癢消毒、防治皮膚病[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，艾葉的主要化學(xué)成分為多糖、黃酮、揮發(fā)油及三萜類，藥理作用較廣[5-6]。其中，艾葉多糖具有抗菌消炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，具有廣泛的應(yīng)用前景[7-8]。本文通過單因素考察，對苯酚-濃硫酸法測定艾葉多糖含量的顯色條件進行了優(yōu)化，并進一步探究了紫外分光光度法測定艾葉多糖含量的可行性，可為后續(xù)艾葉多糖的提取研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

FA224電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-2450紫外分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；SY-1220恒溫電熱水浴鍋，美國精騏有限公司。

艾葉，湖北蘄陽河蘄艾科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇，湖南匯虹試劑有限公司；苯酚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸，湖南匯虹試劑有限公司；純凈水，實驗室自制。

1.2 試液配制

1.2.1 艾葉供試品試液的配制

精密稱取粉碎后的艾葉粉末5 g置于圓底燒瓶內(nèi)，按料液比1:25加入125 mL 40%的乙醇溶液，加熱至91 ℃保持微沸狀態(tài)回流2 h，趁熱抽濾，濾液倒入具塞錐形瓶內(nèi)，置于冰箱備用。移取以上艾葉提取液1 mL，放置于25 mL容量瓶中，使用純凈水稀釋定容，作為艾葉供試品試液。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試液的配制

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.0113 g置于50 mL容量瓶中并加入純凈水定容，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試液。

1.3 苯酚-濃硫酸法測定艾葉多糖含量的最適條件考察

1.3.1 苯酚-濃硫酸法

精密移取稀釋后的艾葉供試品試液1.0 mL，放于20 mL的具塞比色管中，加入純凈水補至2 mL。同時加入5%的苯酚溶液1.0 mL，快速振蕩均勻，后迅速沿管壁加入濃硫酸7 mL，靜置10 min后置于40 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出后迅速冰浴3 min，再保持在室溫下靜置30 min，用紫外分光光度計測定吸光度值[9-10]。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 取樣量考察

艾葉供試品試液取樣量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL，其他操作同“1.3.1”。實驗表明，取樣量為1.0 mL時吸光度為0.289，在0.2～0.8之間可滿足朗伯比爾定律紫外吸光度測定要求，故艾葉供試品取樣量可定為1.0 mL。

表1 取樣量考察

1.3.2.2 苯酚用量考察

5%苯酚用量分別取0.4、0.7、1、1.3、1.6 mL，其他操作同“1.3.1”。結(jié)果表明，苯酚取1.0～1.3 mL時，吸光度數(shù)據(jù)接近。為節(jié)省苯酚用量，可選用1.0 mL作為適宜的苯酚用量。

圖1 苯酚用量考察

1.3.2.3 濃硫酸用量考察

濃硫酸用量分別取5、6、7、8 mL，其他操作同“1.3.1”。實驗表明濃硫酸用量為7 mL、8 mL時吸光度A數(shù)據(jù)接近，為節(jié)省硫酸用量，適宜的硫酸用量選用7 mL。

圖2 濃硫酸用量考察

1.3.2.4 水浴溫度考察

水浴溫度分別為20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃，其他操作同“1.3.1”。實驗表明水浴溫度為40 ℃時為宜。

圖3 水浴溫度考察

1.3.2.5 水浴時間(反應(yīng)時間)考察

水浴時間分別為10、20、30、40、50 min，其他操作同“1.3.1”。實驗表明水浴時間對實驗結(jié)果影響并不大，故可選用20 min作為反應(yīng)時間。

圖4 水浴時間考察

1.3.2.6 靜置狀態(tài)考察

通過查閱藥典以及文獻可知，水浴后有迅速冰浴降至室溫以及在室溫下冷卻兩種方法，本研究據(jù)此進行考察，其他操作同“1.3.1”。實驗表明冰浴或室溫冷卻的吸光度值數(shù)據(jù)接近，但為防止季節(jié)性室溫不同的干擾，選用冰浴條件可以控制實驗條件的一致性。

表2 靜置狀態(tài)考察

1.3.2.7 紫外檢測前最短等待時間考察

根據(jù)預(yù)實驗以及查閱文獻后可知，在冰浴冷卻后的30 min內(nèi)，溶液能夠逐漸變得澄清，吸光度變化較大[11]。故本研究考慮存在紫外檢測前最短等待時間這一影響因素，并設(shè)計了以下考察試驗。

冰浴后分別在室溫下靜置10、20、30、40、50 min，其他操作同“1.3.1”。實驗表明冰浴后等待30 min以上吸光度A趨于穩(wěn)定，故冰浴后適宜等待30 min，再于紫外分光光度計下進行吸光度A的測定。

圖5 紫外檢測前最短等待時間考察

1.3.2.8 產(chǎn)物穩(wěn)定性(紫外檢測前最長等待時間)考察

苯酚-濃硫酸法作用原理為生成橙黃色化合物的顯色反應(yīng)[12]。而產(chǎn)物穩(wěn)定性考察是為了探究從冰浴結(jié)束到利用紫外分光光度計測定吸光度的最長時間。如果產(chǎn)物在一定時間內(nèi)發(fā)生降解變質(zhì)等反應(yīng)，則需要控制最遲測定時間，以避免實驗誤差的產(chǎn)生。

分別在冰浴結(jié)束1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后，利用紫外分光光度計測定吸光度A值，其他操作同“1.3.1”。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知，顯色反應(yīng)產(chǎn)物在4 h內(nèi)穩(wěn)定，故應(yīng)該控制反應(yīng)后4 h內(nèi)于紫外分光光度計下測定吸光度A值。

圖6 紫外檢測前最長等待時間考察

1.3.3 總結(jié)苯酚-濃硫酸法測定艾葉總多糖最優(yōu)實驗條件

綜上所述，處理艾葉多糖的最優(yōu)顯色條件為：精密移取稀釋后的艾葉供試品試液1.0 mL，放于20 mL的具塞比色管中，加入純凈水補至2 mL。同時加入含量為5%的苯酚溶液 1.0 mL，快速振蕩均勻，后迅速順著管壁加入濃硫酸7 mL，靜置10 min后置于40 ℃水浴鍋中加熱20 min，取出后迅速冰浴3 min，再保持在室溫下靜置30 min，并應(yīng)在冰浴結(jié)束4 h內(nèi)，用紫外分光光度計測定吸光度值。

1.4 紫外分光光度法測定艾葉總多糖含量系統(tǒng)方法學(xué)考察

1.4.1 專屬性考察

分別對空白試劑(純凈水)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試液、艾葉供試品試液，按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行顯色，同時取未經(jīng)顯色處理的艾葉供試品試液，利用紫外可見分光光度計在600～200 nm波長范圍內(nèi)對上述四種試液進行光譜掃描，結(jié)果為圖7所示，選擇葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長487 nm作為本系統(tǒng)方法學(xué)考察的測定波長。

圖7 專屬性考察光譜圖

1.4.2 線性范圍考察

分別依次移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試液于20 mL具塞比色管中，按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行顯色。用空白試液調(diào)零，在波長487 nm處測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖8可得，本實驗條件下線性回歸方程為y=1.5764x+0.0145，r=0.9996，表明葡萄糖濃度在22.6～226 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值的線性關(guān)系良好。

圖8 線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.4.3 精密度考察

艾葉供試品精密度考察的平均吸光度值為0.339(n=6)，RSD=0.15%，表明本實驗儀器精密度非常好。

1.4.4 重復(fù)性考察

艾葉供試品重復(fù)性考察的平均吸光度值為0.345(n=6)，RSD=1.66%，可知該方法重復(fù)性良好。

1.4.5 加樣回收試驗

平行移取6份0.5 mL艾葉供試品試液，分別精密加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試液0.1 mL并按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行處理，可得平均吸光度值為0.347(n=6)，加樣回收率平均值為97.63%，RSD=1.67%，故表明本方法的加樣回收率較好。

1.4.6 穩(wěn)定性考察

分別于1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后對新配制的艾葉供試品試液按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行顯色處理并測定吸光度A值，計算可得穩(wěn)定性考察的平均吸光度值為0.352(n=6)，RSD=1.43%，表明艾葉供試品試液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2 結(jié) 論

苯酚-濃硫酸法是多糖含量測定中的普遍使用的顯色方法。其原理為：在濃硫酸的作用下，多糖可以水解變?yōu)閱翁牵笳吣軌蜓杆倜撍?，形成糠醛衍生物，生成的糠醛衍生物可與苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)，從而形成橙黃色化合物[12]。該物質(zhì)顏色穩(wěn)定，且一定濃度范圍內(nèi)，多糖含量(濃度)與吸光度值成線性正比，可用比色法測定。

根據(jù)對苯酚-濃硫酸法最適反應(yīng)條件考察可知：①為保證苯酚-濃硫酸法處理多糖時的顯色產(chǎn)物穩(wěn)定，應(yīng)在30 min至4 h內(nèi)利用紫外分光光度計進行測定；②具塞比色管體積應(yīng)超過反應(yīng)溶液總體積兩倍以上，以避免由于液體混合不勻所造成的誤差；③操作中的每一步均應(yīng)該充分振蕩，控制操作手法盡量一致；④在加入濃硫酸后，應(yīng)該在室溫下靜置10 min，后再于水浴鍋中加熱。

根據(jù)紫外分光光度法對艾葉多糖含量測定系統(tǒng)方法學(xué)考察可知：以純凈水為空白，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照且取樣量為0.2 mL，艾葉供試品取樣量為1 mL，采用上述苯酚-濃硫酸法最佳顯色條件處理試液，在波長487 nm處，用紫外分光光度計測定艾葉多糖含量。本方法專屬性強，簡單易操作，重復(fù)性較好，穩(wěn)定可靠，可滿足對艾葉多糖含量測定的要求。