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      Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的實驗條件優(yōu)化

      2020-05-21 04:19:12閆朝陽馬鈺柯金凱旋王元秀
      關(guān)鍵詞:冰浴顯色劑比色法

      閆朝陽,李 旭,馬鈺柯,金凱旋,王元秀

      (濟南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟南 250022)

      γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸,廣泛存在于動、植物和微生物中[1]。在哺乳動物體內(nèi),GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2],參與多種代謝活動,具有多種功效[3-4],因此與之相關(guān)的研究成果很多。

      GABA的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)法、Berthelot比色法、紙電泳法、紙層析法、氨基酸分析法等[5-10]。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的GABA檢測方法是HPLC法,主要是利用鄰苯二甲醛與GABA發(fā)生柱前衍生反應(yīng),再利用紫外反相HPLC來測定GABA的含量。HPLC法的檢測精度、準(zhǔn)確度都很高,但檢測過程繁瑣、費時,不適合大批量GABA樣品的檢測[11-12]。Berthelot比色法是利用苯酚(C6H5OH)和次氯酸鈉(NaClO)與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)來檢測GABA的含量,檢測的靈敏度較高,簡單易行,可快速檢測大批量GABA樣品[13-14]。相比之下,紙電泳法、紙層析法測定GABA含量的準(zhǔn)確度太低[15-17],氨基酸分析法與HPLC法優(yōu)、缺點類似[18-19],所以,Berthelot比色法是檢測GABA含量最方便、快捷、易操作的方法[20-21]。李秀娟等[22]對Berthelot比色法中苯酚、次氯酸鈉的用量進行了優(yōu)化,但未對加熱溫度、沸水浴時間、冰浴時間等因素進行研究。趙國群等[23]嘗試建立一種快速測定GABA濃度的方法,利用乙醛酸、琥珀酸和溴甲酚綠能夠與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)的原理,制成了由不同濃度的乙醛酸、琥珀酸、溴甲酚綠組成的混合顯色劑,在波長為617 nm處檢測GABA的濃度,但所使用的顯色劑毒性很大,且檢測精度較低。本文中通過顯色劑的組成含量、加熱時間、加熱溫度、冰浴時間的單因素與響應(yīng)面實驗優(yōu)化Berthelot比色法,并將優(yōu)化后的Berthelot比色法測定結(jié)果與HPLC法的測定結(jié)果進行t檢驗,比較二者數(shù)據(jù)的差異性。

      1 實驗材料與儀器

      1.1 實驗試劑

      實驗所用試劑包括:γ-氨基丁酸(GABA),分析純,上海麥克林生化科技有限公司;苯酚(C6H5OH),分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;次氯酸鈉(NaClO),分析純,天津市科密歐試劑有限公司;硼酸(H3BO3),分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;乙醇(C2H5OH),分析純,浙江中山化工集團有限公司;鄰苯二甲醛(OPA),分析純,天津市科密歐試劑有限公司;乙腈(C2H3N),色譜純,天津大茂化學(xué)試劑廠;乙酸鈉(CH3COONa),分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;甲醇(CH3OH),色譜純,天津大茂化學(xué)試劑廠;巰基乙醇(C2H6OS),分析純,天津市科密歐試劑有限公司。

      1.2 實驗儀器

      實驗所需儀器包括:UV2600型紫外可見分光光度計,日本島津公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海百典儀器有限公司;PHS-3B型酸度計,上海雷磁儀器廠;YP2102型電子天平,上海光正醫(yī)療儀器有限公司;FA1104型分析天平,上海精科實業(yè)有限公司;Therm-3000型高效液相色譜儀,美國賽默飛公司。

      2 實驗方法

      2.1 GABA樣品溶液的配制

      用分析天平準(zhǔn)確稱取3.00 mg的GABA樣品,溶解后倒入100 mL容量瓶中定容,4 ℃下避光保存,作為GABA的待測樣品溶液。

      2.2 HPLC法測定[11-12]

      2.2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

      準(zhǔn)確稱取1 mg的GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品,配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,在4 ℃下避光保存。應(yīng)用時將該溶液稀釋至設(shè)定的濃度,將稀釋溶液過0.22 μm微孔濾膜后,在4 ℃下避光保存。

      2.2.2 衍生劑的配制

      向1 mL乙腈中加入0.1 mg OPA,溶解后再加入130 μL的C2H6OS,用濃度為0.4 mol/L的H3BO3緩沖溶液至10 mL容量瓶定容;將該溶液過0.22 μL微孔濾膜,4 ℃下避光保存。

      2.2.3 柱前衍生反應(yīng)

      取500 μL的GABA稀釋液,加入50 μL OPA衍生劑,振蕩后靜置10 s,然后將該溶液過0.22 μm微孔濾膜后進樣。

      2.2.4 色譜條件

      色譜柱采用C18柱。

      流動相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、pH為(7.2±0.2)的乙酸鈉溶液。流動相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、pH為(7.2±0.2)的乙酸鈉溶液、乙腈、甲醇(三者體積比為1 ∶2 ∶2)混合后過濾備用。梯度洗脫順序見表1。

      表1 色譜流動相梯度洗脫表

      以GABA稀釋液的響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      2.2.5 GABA樣品的測定

      取GABA樣品溶液過0.22 μm微孔濾膜后進樣,按照設(shè)置的色譜條件進行梯度洗脫,重復(fù)14次,得到HPLC法測試數(shù)據(jù)。

      2.3 Berthelot比色法測定

      2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

      將配制的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L,然后各取0.5 mL加入pH為9.0、濃度為0.2 mol/L的H3BO3緩沖液0.2 mL, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的C6H5OH溶液1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的NaClO溶液0.4 mL,充分振蕩后沸水浴加熱10 min,之后迅速在冰水浴中冷卻20 min,待出現(xiàn)藍綠色后再加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液2 mL,以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照組,在波長為630 nm處測定吸光度(OD)。以測定的OD值為縱坐標(biāo),GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。之后檢測GABA樣品溶液14次,并記錄實驗數(shù)據(jù)。

      采用t檢驗驗證2種方法的測定結(jié)果是否具有顯著性差異,比較測試數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差、方差、平均值。

      2.4 Berthelot比色法反應(yīng)條件的優(yōu)化

      為了避免溶液體積變化對實驗結(jié)果的影響,選用相同體積、不同濃度的C6H5OH、NaClO、乙醇溶液來探究顯色劑組成含量對比色反應(yīng)的影響,并且以GABA溶液的平均OD值作為優(yōu)化實驗的對照。

      2.4.1 單因素實驗

      采用單因素實驗[25-27]研究了C6H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,加熱溫度分別為65、70、75、80、90、95、100 ℃,加熱時間分別為4、6、8、10、12、14、16 min,冰浴時間分別為5、10、15、20、25、30、35 min等實驗條件對Berthelot比色法顯色反應(yīng)的影響。

      2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

      根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,通過Plackett-Burman實驗,確定了加熱溫度、加熱時間、冰浴時間3個因素對比色反應(yīng)的影響較為顯著,所以選擇這3個因素,利用軟件Design-Expert 8.0,進行Box-Benhnken實驗設(shè)計,其因素水平見表2。

      表2 Box-Benhnken實驗因素水平表

      采用t檢驗驗證優(yōu)化后Berthelot比色法與HPLC法檢測數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異,比較測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差、方差、平均值。

      3 結(jié)果分析

      3.1 HPLC法檢測結(jié)果

      HPLC法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=428.71x+0.927(相關(guān)系數(shù)的平方r2=0.999)。測試數(shù)據(jù)見表3。經(jīng)過計算,用HPLC法測試得到的γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度的平均值為0.029 5 g/L,方差為1.277×10-6g2/L2,標(biāo)準(zhǔn)差為0.003 53 g/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.22%。

      圖1 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

      表3 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸數(shù)據(jù)

      3.2 未優(yōu)化的Berthelot比色法檢測結(jié)果

      3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

      未優(yōu)化的Berthelot比色法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.99x-0.021 5(r2=0.992)。測試數(shù)據(jù)見表4。經(jīng)過計算,該法測定的GABA質(zhì)量濃度的平均值為0.030 2 g/L; 方差為2.290×10-6g2/L2,標(biāo)準(zhǔn)差為0.001 13 g/L,RSD為3.74%。

      圖2 未優(yōu)化的Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

      表4 未優(yōu)化的Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸數(shù)據(jù)

      該組數(shù)據(jù)的平均OD值為0.99,作為優(yōu)化實驗的對照OD值。

      3.2.2 HPLC法和未優(yōu)化的Berthelot比色法數(shù)據(jù)的比較

      首先對HPLC法和未優(yōu)化的Berthelot比色法測定的結(jié)果進行t檢驗。假設(shè)H0,2組數(shù)據(jù)存在顯著性差異,進行t檢驗,顯著性水平P值為0.551,遠遠大于0.05,拒絕H0,因此2組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異,同時2組數(shù)據(jù)的質(zhì)量濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差相近,說明數(shù)據(jù)的差異較小。

      3.3 單因素實驗優(yōu)化實驗

      3.3.1 顯色劑中C6H5OH含量對OD的影響

      圖3 顯色劑中苯酚含量對吸光度的影響

      顯色劑中C6H5OH含量對OD的影響如圖3所示。由圖可知,隨著C6H5OH含量的增大,GABA溶液的OD值增大,C6H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時對應(yīng)的OD值與0.99相近,因此確定C6H5OH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%。

      3.3.2 顯色劑中NaClO對OD的影響

      顯色劑中NaClO含量對OD的影響如圖4所示。由圖可知,隨著NaClO含量的增大,GABA溶液的OD值增大,NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時對應(yīng)的OD值與0.99相近,由此確定NaClO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%。

      圖4 顯色劑中次氯酸鈉含量對吸光度的影響

      3.3.3 顯色劑中乙醇含量對OD的影響

      顯色劑中乙醇含量對OD的影響如圖5所示。由圖可知,隨著乙醇含量的增大,GABA溶液的OD值在0.09~0.10之間波動變化,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時其OD值與0.99相近,由此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

      圖5 顯色劑中乙醇含量對吸光度的影響

      3.3.4 加熱溫度對OD的影響

      加熱溫度對OD的影響如圖6所示。由圖可知,隨著加熱溫度的升高,GABA溶液的OD值先增大,后趨于平穩(wěn),當(dāng)溫度為90~100 ℃時,其OD值與0.99相近,由此確定最低加熱溫度為90 ℃。

      圖6 加熱溫度對吸光度的影響

      3.3.5 加熱時間對OD的影響

      加熱時間對OD的影響如圖7所示。由圖可知,隨著加熱時間的延長,GABA溶液的OD值先增大后減小,加熱時間為6~10 min時其OD值與0.99相近,由此確定最短加熱時間為6 min。

      3.3.6 冰浴時間對OD的影響

      冰浴時間對OD的影響如圖8所示。由圖可看出,隨著冰浴時間的延長,GABA溶液的OD值先增大后平緩,之后又減小,冰浴時間為10~25 min時其OD值與0.99相近,由此確定最短冰浴時間為10 min。

      3.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

      響應(yīng)面優(yōu)化實驗共設(shè)計了如表5所示的17個子實驗,中心試驗進行5次,用來估計實驗的誤差,其余的實驗點均為析因點。具體設(shè)計組合及實驗結(jié)果見表5。

      圖8 冰浴時間對吸光度的影響

      表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

      3.4.1 數(shù)據(jù)分析

      采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,然后對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得加熱溫度T、加熱時間t1、冰浴時間t2的二次多項回歸方程為

      式中IOD為吸光度。

      由回歸方程的方差分析可知,比色反應(yīng)所得到的二次多項回歸方程的相關(guān)系數(shù)的平方r2=0.998,數(shù)值接近1,表明擬合良好,實驗誤差較小。該模型的P<0.000 4,說明模型的顯著性非常明顯,實驗可行; 同時失擬項的P=0.966遠大于0.100 0,構(gòu)建的響應(yīng)面模型失擬不顯著,能夠很好地描述比色反應(yīng)中反應(yīng)溫度、加熱時間、冰浴時間與OD的關(guān)系。當(dāng)模型的有效信號與噪聲的比值(RSN)大于4.00時即視為合理,本文中構(gòu)建模型的RSN為11.899,說明模型預(yù)測作用較好。在響應(yīng)面模型中,根據(jù)P值的大小,綜合各水平可以得出結(jié)論,即響應(yīng)面中3個水平因素對OD的影響由大到小的順序為加熱溫度、加熱時間及冰浴時間。

      3.4.2 響應(yīng)面立體圖分析

      對回歸方程方差進行分析,利用Design-Expert軟件畫出加熱時間、加熱溫度、冰浴時間對比色反應(yīng)OD影響的響應(yīng)面圖(見圖9—11),分析2個因素之間的交互作用對比色反應(yīng)OD的影響。比較各組響應(yīng)面及等高線可知,提取率所選范圍內(nèi)存在的極值就是響應(yīng)面的最高點,同時也是等高線橢圓的中心,同時利用等高線的形狀來反映各組條件交互作用強弱,等高線越趨向橢圓表示交互作用越強,越趨向圓形表示交互作用越弱。

      圖9 加熱時間和加熱溫度對吸光度的交互影響曲面圖

      圖10 冰浴時間和加熱溫度對吸光度的交互影響曲面圖

      圖11 冰浴時間和加熱時間對吸光度的交互影響曲面圖

      在加熱時間與加熱溫度之間的交互作用中,等高線為橢圓形,表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱溫度為98.04 ℃、加熱時間為6.44 min時,OD達到最大值,其中沿加熱時間方向的等高線密度大于沿加熱溫度方向的,說明加熱時間對OD的影響較大。在冰浴時間與加熱溫度之間的交互作用中,等高線為橢圓形,表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱溫度為98.04 ℃、冰浴時間為8.72 min時,OD達到最大值,其中沿冰浴時間方向的等高線密度大于沿加熱溫度方向的,說明冰浴時間對OD的影響較大。在冰浴時間與加熱時間之間的交互作用中,等高線為橢圓形,表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱時間為6.44 min、冰浴時間為8.72 min時,OD達到最大值,其中沿冰浴時間方向的等高線密度大于沿加熱時間方向的,說明冰浴時間對OD的影響較大。

      3.4.3 驗證實驗

      根據(jù)Design-Expert軟件優(yōu)化,得到的最佳測試條件是: 初始加熱溫度為98.04 ℃,加熱時間為6.44 min,冰浴時間為8.72 min,此時理論OD值為0.100。

      為了驗證方法的可靠性,同時又考慮實際操作的方便,本文中選取加熱溫度為98 ℃,加熱時間為7 min,冰浴時間為9 min進行驗證實驗,共進行3組平行試驗,獲得的比色反應(yīng)OD值為0.99,與預(yù)測值相比較僅小1.00%,說明優(yōu)化條件可行。

      3.4.4 優(yōu)化后Berthelot比色法與HPLC法測定結(jié)果的比較

      優(yōu)化后Berthelot比色法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖12,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.04x-0.017 8(r2=0.995)。測試數(shù)據(jù)見表6。由表中數(shù)據(jù)可知,采用優(yōu)化后Berthelot比色法測定GABA質(zhì)量濃度的平均值為0.029 4 g/L,方差為5.436×10-7g2/L2;標(biāo)準(zhǔn)差為0.000 738 g/L,RSD為2.48%。

      圖12 優(yōu)化后Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

      表6 優(yōu)化后Berthelot法檢測γ-氨基丁酸濃度數(shù)據(jù)

      對HPLC法和優(yōu)化后Berthelot比色法測定結(jié)果進行t檢驗驗證。P=0.807 6,遠遠大于0.05,表明2組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異,同時優(yōu)化后Berthelot比色法的質(zhì)量濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差與HPLC法的t檢驗值更加接近。

      優(yōu)化后的Berthelot比色法相比于未優(yōu)化方法RSD值減小了1.26%,說明優(yōu)化后的方法的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更小,穩(wěn)定性、重復(fù)性更好。

      4 結(jié)論

      優(yōu)化后的Berthelot比色法與未優(yōu)化的方法相比,顯色反應(yīng)時間縮短了46%,RSD值減小了1.26%,穩(wěn)定性、重復(fù)性更好,更加簡便快捷,并且與HPLC法無顯著性差異,是一種方便、簡潔、準(zhǔn)確的GABA含量檢測方法。

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