Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的實驗條件優(yōu)化

閆朝陽，李 旭，馬鈺柯，金凱旋，王元秀

(濟南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟南 250022)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動、植物和微生物中[1]。在哺乳動物體內(nèi)，GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2]，參與多種代謝活動，具有多種功效[3-4]，因此與之相關(guān)的研究成果很多。

GABA的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)法、Berthelot比色法、紙電泳法、紙層析法、氨基酸分析法等[5-10]。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的GABA檢測方法是HPLC法，主要是利用鄰苯二甲醛與GABA發(fā)生柱前衍生反應(yīng)，再利用紫外反相HPLC來測定GABA的含量。HPLC法的檢測精度、準(zhǔn)確度都很高，但檢測過程繁瑣、費時，不適合大批量GABA樣品的檢測[11-12]。Berthelot比色法是利用苯酚(C6H5OH)和次氯酸鈉(NaClO)與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)來檢測GABA的含量，檢測的靈敏度較高，簡單易行，可快速檢測大批量GABA樣品[13-14]。相比之下，紙電泳法、紙層析法測定GABA含量的準(zhǔn)確度太低[15-17]，氨基酸分析法與HPLC法優(yōu)、缺點類似[18-19]，所以，Berthelot比色法是檢測GABA含量最方便、快捷、易操作的方法[20-21]。李秀娟等[22]對Berthelot比色法中苯酚、次氯酸鈉的用量進行了優(yōu)化，但未對加熱溫度、沸水浴時間、冰浴時間等因素進行研究。趙國群等[23]嘗試建立一種快速測定GABA濃度的方法，利用乙醛酸、琥珀酸和溴甲酚綠能夠與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)的原理，制成了由不同濃度的乙醛酸、琥珀酸、溴甲酚綠組成的混合顯色劑，在波長為617 nm處檢測GABA的濃度，但所使用的顯色劑毒性很大，且檢測精度較低。本文中通過顯色劑的組成含量、加熱時間、加熱溫度、冰浴時間的單因素與響應(yīng)面實驗優(yōu)化Berthelot比色法，并將優(yōu)化后的Berthelot比色法測定結(jié)果與HPLC法的測定結(jié)果進行t檢驗，比較二者數(shù)據(jù)的差異性。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗試劑

實驗所用試劑包括：γ-氨基丁酸(GABA)，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；苯酚(C6H5OH)，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；次氯酸鈉(NaClO)，分析純，天津市科密歐試劑有限公司；硼酸(H3BO3)，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；乙醇(C2H5OH)，分析純，浙江中山化工集團有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，分析純，天津市科密歐試劑有限公司；乙腈(C2H3N)，色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠；乙酸鈉(CH3COONa)，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；甲醇(CH3OH)，色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠；巰基乙醇(C2H6OS)，分析純，天津市科密歐試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

實驗所需儀器包括：UV2600型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海百典儀器有限公司；PHS-3B型酸度計，上海雷磁儀器廠；YP2102型電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；FA1104型分析天平，上海精科實業(yè)有限公司；Therm-3000型高效液相色譜儀，美國賽默飛公司。

2 實驗方法

2.1 GABA樣品溶液的配制

用分析天平準(zhǔn)確稱取3.00 mg的GABA樣品，溶解后倒入100 mL容量瓶中定容，4 ℃下避光保存，作為GABA的待測樣品溶液。

2.2 HPLC法測定[11-12]

2.2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1 mg的GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4 ℃下避光保存。應(yīng)用時將該溶液稀釋至設(shè)定的濃度，將稀釋溶液過0.22 μm微孔濾膜后，在4 ℃下避光保存。

2.2.2 衍生劑的配制

向1 mL乙腈中加入0.1 mg OPA，溶解后再加入130 μL的C2H6OS，用濃度為0.4 mol/L的H3BO3緩沖溶液至10 mL容量瓶定容；將該溶液過0.22 μL微孔濾膜，4 ℃下避光保存。

2.2.3 柱前衍生反應(yīng)

取500 μL的GABA稀釋液，加入50 μL OPA衍生劑，振蕩后靜置10 s，然后將該溶液過0.22 μm微孔濾膜后進樣。

2.2.4 色譜條件

色譜柱采用C18柱。

流動相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、pH為(7.2±0.2)的乙酸鈉溶液。流動相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、pH為(7.2±0.2)的乙酸鈉溶液、乙腈、甲醇(三者體積比為1 ∶2 ∶2)混合后過濾備用。梯度洗脫順序見表1。

表1 色譜流動相梯度洗脫表

以GABA稀釋液的響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 GABA樣品的測定

取GABA樣品溶液過0.22 μm微孔濾膜后進樣，按照設(shè)置的色譜條件進行梯度洗脫，重復(fù)14次，得到HPLC法測試數(shù)據(jù)。

2.3 Berthelot比色法測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L，然后各取0.5 mL加入pH為9.0、濃度為0.2 mol/L的H3BO3緩沖液0.2 mL, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的C6H5OH溶液1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的NaClO溶液0.4 mL，充分振蕩后沸水浴加熱10 min，之后迅速在冰水浴中冷卻20 min，待出現(xiàn)藍綠色后再加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液2 mL，以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照組，在波長為630 nm處測定吸光度(OD)。以測定的OD值為縱坐標(biāo)，GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。之后檢測GABA樣品溶液14次，并記錄實驗數(shù)據(jù)。

采用t檢驗驗證2種方法的測定結(jié)果是否具有顯著性差異，比較測試數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差、方差、平均值。

2.4 Berthelot比色法反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了避免溶液體積變化對實驗結(jié)果的影響，選用相同體積、不同濃度的C6H5OH、NaClO、乙醇溶液來探究顯色劑組成含量對比色反應(yīng)的影響，并且以GABA溶液的平均OD值作為優(yōu)化實驗的對照。

2.4.1 單因素實驗

采用單因素實驗[25-27]研究了C6H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，加熱溫度分別為65、70、75、80、90、95、100 ℃，加熱時間分別為4、6、8、10、12、14、16 min，冰浴時間分別為5、10、15、20、25、30、35 min等實驗條件對Berthelot比色法顯色反應(yīng)的影響。

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，通過Plackett-Burman實驗，確定了加熱溫度、加熱時間、冰浴時間3個因素對比色反應(yīng)的影響較為顯著，所以選擇這3個因素，利用軟件Design-Expert 8.0，進行Box-Benhnken實驗設(shè)計，其因素水平見表2。

表2 Box-Benhnken實驗因素水平表

采用t檢驗驗證優(yōu)化后Berthelot比色法與HPLC法檢測數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異，比較測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差、方差、平均值。

3 結(jié)果分析

3.1 HPLC法檢測結(jié)果

HPLC法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=428.71x+0.927(相關(guān)系數(shù)的平方r2=0.999)。測試數(shù)據(jù)見表3。經(jīng)過計算，用HPLC法測試得到的γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度的平均值為0.029 5 g/L，方差為1.277×10-6g2/L2，標(biāo)準(zhǔn)差為0.003 53 g/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.22%。

圖1 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸數(shù)據(jù)

3.2 未優(yōu)化的Berthelot比色法檢測結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

未優(yōu)化的Berthelot比色法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.99x-0.021 5(r2=0.992)。測試數(shù)據(jù)見表4。經(jīng)過計算，該法測定的GABA質(zhì)量濃度的平均值為0.030 2 g/L； 方差為2.290×10-6g2/L2，標(biāo)準(zhǔn)差為0.001 13 g/L，RSD為3.74%。

圖2 未優(yōu)化的Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 未優(yōu)化的Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸數(shù)據(jù)

該組數(shù)據(jù)的平均OD值為0.99，作為優(yōu)化實驗的對照OD值。

3.2.2 HPLC法和未優(yōu)化的Berthelot比色法數(shù)據(jù)的比較

首先對HPLC法和未優(yōu)化的Berthelot比色法測定的結(jié)果進行t檢驗。假設(shè)H0，2組數(shù)據(jù)存在顯著性差異，進行t檢驗，顯著性水平P值為0.551，遠遠大于0.05，拒絕H0，因此2組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，同時2組數(shù)據(jù)的質(zhì)量濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差相近，說明數(shù)據(jù)的差異較小。

3.3 單因素實驗優(yōu)化實驗

3.3.1 顯色劑中C6H5OH含量對OD的影響

圖3 顯色劑中苯酚含量對吸光度的影響

顯色劑中C6H5OH含量對OD的影響如圖3所示。由圖可知，隨著C6H5OH含量的增大，GABA溶液的OD值增大，C6H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時對應(yīng)的OD值與0.99相近，因此確定C6H5OH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%。

3.3.2 顯色劑中NaClO對OD的影響

顯色劑中NaClO含量對OD的影響如圖4所示。由圖可知，隨著NaClO含量的增大，GABA溶液的OD值增大，NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時對應(yīng)的OD值與0.99相近，由此確定NaClO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%。

圖4 顯色劑中次氯酸鈉含量對吸光度的影響

3.3.3 顯色劑中乙醇含量對OD的影響

顯色劑中乙醇含量對OD的影響如圖5所示。由圖可知，隨著乙醇含量的增大，GABA溶液的OD值在0.09～0.10之間波動變化，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時其OD值與0.99相近，由此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

圖5 顯色劑中乙醇含量對吸光度的影響

3.3.4 加熱溫度對OD的影響

加熱溫度對OD的影響如圖6所示。由圖可知，隨著加熱溫度的升高，GABA溶液的OD值先增大，后趨于平穩(wěn)，當(dāng)溫度為90～100 ℃時，其OD值與0.99相近，由此確定最低加熱溫度為90 ℃。

圖6 加熱溫度對吸光度的影響

3.3.5 加熱時間對OD的影響

加熱時間對OD的影響如圖7所示。由圖可知，隨著加熱時間的延長，GABA溶液的OD值先增大后減小，加熱時間為6～10 min時其OD值與0.99相近，由此確定最短加熱時間為6 min。

3.3.6 冰浴時間對OD的影響

冰浴時間對OD的影響如圖8所示。由圖可看出，隨著冰浴時間的延長，GABA溶液的OD值先增大后平緩，之后又減小，冰浴時間為10～25 min時其OD值與0.99相近，由此確定最短冰浴時間為10 min。

3.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化實驗共設(shè)計了如表5所示的17個子實驗，中心試驗進行5次，用來估計實驗的誤差，其余的實驗點均為析因點。具體設(shè)計組合及實驗結(jié)果見表5。

圖8 冰浴時間對吸光度的影響

表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

3.4.1 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，然后對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得加熱溫度T、加熱時間t1、冰浴時間t2的二次多項回歸方程為

式中IOD為吸光度。

由回歸方程的方差分析可知，比色反應(yīng)所得到的二次多項回歸方程的相關(guān)系數(shù)的平方r2=0.998，數(shù)值接近1，表明擬合良好，實驗誤差較小。該模型的P<0.000 4，說明模型的顯著性非常明顯，實驗可行； 同時失擬項的P=0.966遠大于0.100 0，構(gòu)建的響應(yīng)面模型失擬不顯著，能夠很好地描述比色反應(yīng)中反應(yīng)溫度、加熱時間、冰浴時間與OD的關(guān)系。當(dāng)模型的有效信號與噪聲的比值(RSN)大于4.00時即視為合理，本文中構(gòu)建模型的RSN為11.899，說明模型預(yù)測作用較好。在響應(yīng)面模型中，根據(jù)P值的大小，綜合各水平可以得出結(jié)論，即響應(yīng)面中3個水平因素對OD的影響由大到小的順序為加熱溫度、加熱時間及冰浴時間。

3.4.2 響應(yīng)面立體圖分析

對回歸方程方差進行分析，利用Design-Expert軟件畫出加熱時間、加熱溫度、冰浴時間對比色反應(yīng)OD影響的響應(yīng)面圖(見圖9—11)，分析2個因素之間的交互作用對比色反應(yīng)OD的影響。比較各組響應(yīng)面及等高線可知，提取率所選范圍內(nèi)存在的極值就是響應(yīng)面的最高點，同時也是等高線橢圓的中心，同時利用等高線的形狀來反映各組條件交互作用強弱，等高線越趨向橢圓表示交互作用越強，越趨向圓形表示交互作用越弱。

圖9 加熱時間和加熱溫度對吸光度的交互影響曲面圖

圖10 冰浴時間和加熱溫度對吸光度的交互影響曲面圖

圖11 冰浴時間和加熱時間對吸光度的交互影響曲面圖

在加熱時間與加熱溫度之間的交互作用中，等高線為橢圓形，表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱溫度為98.04 ℃、加熱時間為6.44 min時，OD達到最大值，其中沿加熱時間方向的等高線密度大于沿加熱溫度方向的，說明加熱時間對OD的影響較大。在冰浴時間與加熱溫度之間的交互作用中，等高線為橢圓形，表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱溫度為98.04 ℃、冰浴時間為8.72 min時，OD達到最大值，其中沿冰浴時間方向的等高線密度大于沿加熱溫度方向的，說明冰浴時間對OD的影響較大。在冰浴時間與加熱時間之間的交互作用中，等高線為橢圓形，表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱時間為6.44 min、冰浴時間為8.72 min時，OD達到最大值，其中沿冰浴時間方向的等高線密度大于沿加熱時間方向的，說明冰浴時間對OD的影響較大。

3.4.3 驗證實驗

根據(jù)Design-Expert軟件優(yōu)化，得到的最佳測試條件是： 初始加熱溫度為98.04 ℃，加熱時間為6.44 min，冰浴時間為8.72 min，此時理論OD值為0.100。

為了驗證方法的可靠性，同時又考慮實際操作的方便，本文中選取加熱溫度為98 ℃，加熱時間為7 min，冰浴時間為9 min進行驗證實驗，共進行3組平行試驗，獲得的比色反應(yīng)OD值為0.99，與預(yù)測值相比較僅小1.00%，說明優(yōu)化條件可行。

3.4.4 優(yōu)化后Berthelot比色法與HPLC法測定結(jié)果的比較

優(yōu)化后Berthelot比色法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖12，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.04x-0.017 8(r2=0.995)。測試數(shù)據(jù)見表6。由表中數(shù)據(jù)可知，采用優(yōu)化后Berthelot比色法測定GABA質(zhì)量濃度的平均值為0.029 4 g/L，方差為5.436×10-7g2/L2；標(biāo)準(zhǔn)差為0.000 738 g/L，RSD為2.48%。

圖12 優(yōu)化后Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表6 優(yōu)化后Berthelot法檢測γ-氨基丁酸濃度數(shù)據(jù)

對HPLC法和優(yōu)化后Berthelot比色法測定結(jié)果進行t檢驗驗證。P=0.807 6，遠遠大于0.05，表明2組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，同時優(yōu)化后Berthelot比色法的質(zhì)量濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差與HPLC法的t檢驗值更加接近。

優(yōu)化后的Berthelot比色法相比于未優(yōu)化方法RSD值減小了1.26%，說明優(yōu)化后的方法的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，穩(wěn)定性、重復(fù)性更好。

4 結(jié)論

優(yōu)化后的Berthelot比色法與未優(yōu)化的方法相比，顯色反應(yīng)時間縮短了46%，RSD值減小了1.26%，穩(wěn)定性、重復(fù)性更好，更加簡便快捷，并且與HPLC法無顯著性差異，是一種方便、簡潔、準(zhǔn)確的GABA含量檢測方法。