楊瀾波 米豫飛 鄒春雨 王戰(zhàn)朝

20 世紀(jì)90 年代，Kehlet 率先提出術(shù)后加速康復(fù)（Enhanced Recovery After Surgery，ERAS）的概念[1]。加速康復(fù)是在循證醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上，通過一系列優(yōu)化圍手術(shù)期治療的措施來加快康復(fù)過程。它最早用于胃腸道手術(shù)，取得了令人滿意的效果，近年來逐漸推廣至其他學(xué)科[2]。膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（Total Knee Arthroplasty，TKA）是終末期膝骨關(guān)節(jié)炎最有效的治療方法之一[3]。據(jù)報(bào)道，美國每年進(jìn)行TKA 手術(shù)70 萬例，預(yù)計(jì)2030年將增加到348萬例[4]。在TKA中，ERAS的核心是減少手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)，減輕圍手術(shù)期疼痛，降低深靜脈血栓等并發(fā)癥的發(fā)生率，加速功能恢復(fù)[5-6]。目前，TKA 術(shù)后抗血栓及鎮(zhèn)痛治療以藥物為主，但存在出血、抗血栓作用不足、心血管意外、肝腎功能損害、嗜睡、惡心嘔吐及長(zhǎng)期成癮等潛在風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，開發(fā)安全有效的抗血栓鎮(zhèn)痛藥物是目前TKA 術(shù)后加速康復(fù)研究中亟待解決的問題。

活血疏肝湯是國家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)平樂郭氏正骨法的經(jīng)典名方，根據(jù)骨傷科疾病三期用藥理論辨證論治組方而成，具有行氣疏肝、活血止痛的作用。杜志謙[8]等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，活血疏肝湯具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。喬清奎[9]報(bào)道，臨床應(yīng)用活血疏肝湯可顯著降低TKA術(shù)后疼痛，無明顯不良反應(yīng)。張曉輝[10]報(bào)道，活血疏肝湯具有減少腰椎術(shù)后下肢深靜脈血栓發(fā)生的作用。同時(shí)，本研究相關(guān)的臨床試驗(yàn)顯示，活血疏肝湯對(duì)TKA術(shù)后血栓及疼痛的有效率分別為85.94%及93.19%，但其抗血栓鎮(zhèn)痛的具體機(jī)制尚不清楚。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，獲取了活血疏肝湯的有效成分，并預(yù)測(cè)了這些成分的有效靶點(diǎn)，在分子水平上挖掘活血疏肝湯在TKA術(shù)后抗血栓及鎮(zhèn)痛作用方面的潛在機(jī)制，為活血疏肝湯在TKA術(shù)后快速康復(fù)中的廣泛應(yīng)用與新藥物的開發(fā)提供理論支持。

1 方法

1.1 活血疏肝湯有效成分篩選活血疏肝湯由當(dāng)歸、紅花、桃仁、柴胡、大黃、黃芩、甘草以及枳殼共8味中藥組成。在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索各味中藥所含的有效成分，根據(jù)口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 和類藥性指數(shù)（Drug Like Index，DL）≥0.18 等參數(shù)對(duì)活血疏肝湯的有效成分進(jìn)行篩選。

1.2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選獲得的有效成分轉(zhuǎn)換為PubChem_CID，導(dǎo)入中醫(yī)藥分子機(jī)制生物信息分析數(shù)據(jù)庫（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism for Traditional Chinese Medicine，BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php），將參數(shù)設(shè)定為Score cutoff＞20，P＜0.05，獲得活血疏肝湯的有效靶點(diǎn)。根據(jù)篩選獲得的有效成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 藥物與疾病共有靶點(diǎn)的獲得從毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）中獲得有關(guān)術(shù)后血栓（Venous Thrombosis）及疼痛（Postoperative Pain）的所有靶點(diǎn)，根據(jù)相關(guān)分?jǐn)?shù)（Inference Score）＞50 選取有效疾病靶點(diǎn)。從DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/home/）中獲得有關(guān)血栓（Thrombosis）及疼痛（Pain）的靶點(diǎn)，根據(jù)基因-疾病關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)（Score-gda）＞0.1 選取有效疾病靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的疾病靶點(diǎn)合并，獲得TKA 術(shù)后血栓及疼痛相關(guān)的疾病有效靶點(diǎn)。取疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)的交集，獲得共有靶點(diǎn)。

1.4 共有靶點(diǎn)的分析與篩選將獲得的共有靶點(diǎn)輸入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），種屬參數(shù)設(shè)置為人（Homo sapiens），得出共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)間相互作用（Protein Protein Interaction,PPI），以Combined Score＞0.4 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將篩選后的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)度值（Degree）＞平均值篩選出關(guān)鍵共有靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/）可用于GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析，并且具有時(shí)效性和準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)。將關(guān)鍵共有靶點(diǎn)上傳至Metascape，種屬參數(shù)設(shè)置為人（Homo species），即可獲得富集分析結(jié)果。

1.6 核心成分與高頻靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接在蛋白數(shù)據(jù)庫（The Protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org/）中獲得度值最高的前5個(gè)靶點(diǎn)的PBD結(jié)構(gòu)文件。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得靶點(diǎn)最多的8 個(gè)有效成分的Mol 2格式文件（3D結(jié)構(gòu)）。將獲得的文件導(dǎo)入在線分子對(duì)接網(wǎng)站SwissDock（http://www.swissdock.ch/docking），依次分別進(jìn)行高頻靶點(diǎn)與核心成分的分子對(duì)接，分析活血疏肝湯中的有效成分與靶蛋白的親和力。

2 結(jié)果

2.1 活血疏肝湯有效成分篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取活血疏肝湯中8味中藥的有效成分，剔除重復(fù)項(xiàng)后共獲得有效成分196 個(gè)，其中132 個(gè)具有化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將獲得的有效成分導(dǎo)入BATMAN數(shù)據(jù)庫，獲得693個(gè)有效靶點(diǎn)。依據(jù)活血疏肝湯的有效成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

2.3 藥物與疾病共有靶點(diǎn)的獲得自CTD數(shù)據(jù)庫中獲得175個(gè)血栓靶點(diǎn)及38個(gè)疼痛靶點(diǎn)。自DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得36 個(gè)血栓靶點(diǎn)及209 個(gè)疼痛靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)合并，獲得TKA 術(shù)后血栓及疼痛靶點(diǎn)共計(jì)389 個(gè)。取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，獲得79 個(gè)活血疏肝湯與TKA術(shù)后血栓及疼痛的共有靶點(diǎn)。

2.4 共有靶點(diǎn)的分析與篩選通過STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)79個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。結(jié)果顯示，79個(gè)靶點(diǎn)之間存在644 種相互作用，靶點(diǎn)的最高度值為50，平均度值為16.51。根據(jù)大于平均度值篩選出35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，為IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B、EDN1、CRP、IL10、F2、FGF2、IL4、SERPINE1、ESR1、PPARG、TGFB1、CNR1、CAT、NR3C1、CTNNB1、VCAM1、OXT、IFNG、OPRK1、DRD2、AVP、ENSG00000196689、CYP3A4、HTR1A、SLC6A4、C3、BDKRB2、FASLG、NFKB1、HTR3A以及ABCB1。

2.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析GO 功能富集分析結(jié)果主要分為生物過程（Biological Progress）、分子功能（Molecular Function）、細(xì)胞組成（Cellular Component）三個(gè)方面，主要涉及定位的維持（maintenance of location）、受體配體活性對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)（Receptor ligand activity response to bacterium）、細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控（Regulation of cytokine production）、細(xì)胞對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)（Cellular response to organic cyclic compound）以及血液循環(huán)（Blood circulation）等，見圖3。KEGG通路富集分析顯示，涉及的主要通路依次為“hsa 05142:Chagas disease（American trypanosomiasis）”“hsa 05200:Pathways in cancer”“hsa 05140:Leishmaniasis”“hsa 04080:Neuroactive ligandreceptor interaction”“hsa 05205:Proteoglycans in cancer”以及“hsa 04066:HIF-1 signaling pathway”等，見圖4。

圖3 GO功能富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

2.6 核心成分與高頻靶點(diǎn)的分子對(duì)接將PDB數(shù)據(jù)庫中獲得度值最高的前5 個(gè)靶點(diǎn)（IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B）與TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得靶點(diǎn)最多的8個(gè)有效成分（beta-sitosterol、CLR、Supraene、betacarotene、Phytoene、icos-5-enoic acid、gadelaidic acid、7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5，6-g]quinoxaline-2,4-dione），依次分別通過SwissDock 獲取其結(jié)合能，見圖5。其中Phytoene、beta-carotene 與PTGS2 的結(jié)合能最?。ǎ?10 kJ/mol），其分子對(duì)接結(jié)果顯示，有效成分與靶蛋白充分嵌合，具有較好的結(jié)合作用，見圖6。

圖5 高頻靶點(diǎn)與核心成分對(duì)接結(jié)合能（kJ/mol）

圖6 PTGS2分別與Phytoene（圖a）和beta-carotene（圖b）的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是研究藥物作用機(jī)制的有效途徑，通過網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)庫或早期研究獲得的數(shù)據(jù)來解釋功能藥物的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略符合中醫(yī)對(duì)疾病完整性的認(rèn)識(shí)[11-12]。分子對(duì)接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法，主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力的一種理論模擬方法。活血疏肝湯作為中藥復(fù)方，含有多種具有復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)的有效成分，通過不同作用靶點(diǎn)與多種作用途徑，共同發(fā)揮其獨(dú)特的臨床功效。而正是由于活血疏肝湯作用機(jī)制的多面性，傳統(tǒng)的藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法難以確定其具體作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)揭示了活血疏肝湯對(duì)TKA 術(shù)后血栓及疼痛的治療作用及可能的分子機(jī)制，為活血疏肝湯在TKA加速康復(fù)中的應(yīng)用和有關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

3.1 活血疏肝湯有效成分抗血栓及鎮(zhèn)痛的藥理作用分析活血疏肝湯中含有的多種中藥與抗血栓及鎮(zhèn)痛作用密切相關(guān)。黃芩是一味被廣泛應(yīng)用的中藥，具有抗炎鎮(zhèn)痛等諸多生物學(xué)作用，對(duì)多種疼痛有治療效果[13-14]。當(dāng)歸不僅具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，還具有抗血栓形成、抗血小板聚集、改善血黏度以及抗凝等生物學(xué)活性[15-16]。紅花不但能抑制血小板聚集和預(yù)防血栓，甚至能溶解已形成的血栓，同時(shí)具有強(qiáng)烈持久的鎮(zhèn)痛作用[17]。桃仁能通過抑制血小板聚集、改善血流動(dòng)力學(xué)和抗炎癥來實(shí)現(xiàn)抗血栓作用[18]。柴胡具有抗炎鎮(zhèn)痛解熱作用，以此實(shí)現(xiàn)術(shù)后鎮(zhèn)痛[19]。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中獲得靶點(diǎn)最多的5 個(gè)有效成分分別為betasitosterol、CLR、Supraene、beta-carotene、Phytoene。Beta-sitosterol 是黃芩的主要有效成分，其通過干擾前列腺素代謝來拮抗炎癥實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明確的抗血栓活性[20-21]。CLR在紅花中含量較高，作為四種肽類激素的同源受體，通過受體-配體相互作用影響血管內(nèi)皮屏障完整性和血管生成，同時(shí)也與疼痛發(fā)生有關(guān)[22]。Supraene 是黃芩的主要成分，也是一種天然的生物相容性脂質(zhì)體，本身并不具有鎮(zhèn)痛或抗凝作用，但可與鎮(zhèn)痛及抗凝相關(guān)藥物結(jié)合后實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋，從而增強(qiáng)藥理作用[23]。Beta-carotene與Phytoene 同屬于類胡蘿卜素，是紅花的主要有效成分，可以降低罹患許多疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如心血管疾病、白內(nèi)障形成、年齡依賴性黃斑變性及癌癥[24-26]。

3.2 高頻靶點(diǎn)與抗血栓及鎮(zhèn)痛機(jī)制關(guān)聯(lián)分析在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，度值最高的前5 個(gè)靶點(diǎn)被認(rèn)為是活血疏肝湯治療TKA 術(shù)后血栓及疼痛的樞紐基因，可能在TKA 術(shù)后加速康復(fù)中發(fā)揮重要作用。其中最值得注意的是，IL6 是TKA 術(shù)后炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)及影響術(shù)后疼痛的重要炎癥介質(zhì)[27-29]。AKT1 被認(rèn)為是治療下肢深靜脈血栓的關(guān)鍵基因，同時(shí)作為PI3K/Akt通路的關(guān)鍵分子與疼痛密切相關(guān)[30-32]。TNF 具有免疫調(diào)節(jié)、促炎作用，與術(shù)后疼痛密切相關(guān)且在下肢深靜脈血栓形成中起關(guān)鍵作用[33]。PTGS2 又名COX-2，已證實(shí)可引起大鼠下肢深靜脈血栓形成，同時(shí)也是TKA術(shù)后疼痛的主要靶點(diǎn)[34-35]。IL1B 是一種抗炎細(xì)胞因子，不但能緩解膝關(guān)節(jié)炎所致疼痛，也影響了下肢深靜脈血栓的形成[29,36-38]。

3.3 活血疏肝湯抗血栓及鎮(zhèn)痛機(jī)制分析Go功能富集分析挖掘了活血疏肝湯在TKA 術(shù)后抗血栓及鎮(zhèn)痛等生物學(xué)過程中的作用機(jī)制，預(yù)測(cè)了活血疏肝湯作用于血栓形成及疼痛的靶點(diǎn)，提示其作用集中發(fā)生于細(xì)胞膜內(nèi)外及細(xì)胞膜本身的脂閥，同時(shí)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)致一系列的蛋白合成，并在此基礎(chǔ)上通過受體與配體的相互作用，調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生，影響血液循環(huán)，從而干預(yù)血栓與疼痛的病理學(xué)過程。KEGG通路富集分析則提示，活血疏肝湯主要通過調(diào)控腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路、神經(jīng)活性受體-配體作用、腫瘤蛋白聚糖、缺氧誘導(dǎo)因子1 信號(hào)傳導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)TKA 術(shù)后抗血栓及鎮(zhèn)痛的作用。

3.4 活血疏肝湯核心成分與TKA 術(shù)后血栓及疼痛高頻靶點(diǎn)的結(jié)合分子對(duì)接可以評(píng)估配體和蛋白質(zhì)在熱力學(xué)上是否具有結(jié)合的能力，還能進(jìn)一步預(yù)測(cè)活血疏肝湯的作用靶點(diǎn)。若結(jié)合能＜-5.0 kJ/mol，說明結(jié)合性好。結(jié)合能越小，結(jié)合的效果越好?；钛韪螠暮诵某煞峙cTKA 術(shù)后血栓及疼痛高頻靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果顯示各成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol，說明所有核心成分與高頻靶點(diǎn)均能獲得良好結(jié)合。另外，PTGS2作為活血疏肝湯作用于TKA術(shù)后血栓及疼痛的典型受體，與Phytoene、Beta-carotene 及Supraene等核心成分的結(jié)合能均小于-10 kJ/mol，且分子結(jié)構(gòu)嵌合緊密，說明活血疏肝湯的核心成分與疾病高頻靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性，以此實(shí)現(xiàn)TKA術(shù)后抗血栓及鎮(zhèn)痛作用。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)分析了活血疏肝湯治療TKA 術(shù)后血栓及疼痛的可能機(jī)制。結(jié)果提示，活血疏肝湯中的主要有效成分在分子水平上通過多路徑發(fā)揮藥理作用，主要涉及腫瘤信號(hào)調(diào)控、抗缺氧、抗炎癥等多種機(jī)制。本研究中，活血疏肝湯表現(xiàn)出良好的抗血栓及鎮(zhèn)痛功能，提示活血疏肝湯具有成為治療TKA 術(shù)后血栓與疼痛候選藥物的潛力，也為其藥物作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。