楊繼華 胡鵬博 劉 力 楊鄭鴻*

（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，腦與認(rèn)知科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）是神經(jīng)生物學(xué)，遺傳發(fā)育學(xué)和基因?qū)W等學(xué)科的重要模式動(dòng)物，在神經(jīng)發(fā)育，學(xué)習(xí)與記憶，甚至精神類(lèi)疾病方面都有重要研究?jī)r(jià)值。

習(xí)得性無(wú)助（learned helplessness）是用來(lái)描述動(dòng)物經(jīng)歷過(guò)了不可逃避厭惡型刺激后產(chǎn)生的無(wú)助狀態(tài)，并導(dǎo)致它們之后也無(wú)法完成可逃避的任務(wù)［1］。最早的實(shí)驗(yàn)中，狗被分為兩組，其中一組（Master 組）經(jīng)歷可逃避的電擊，它們可以通過(guò)踩壓面前的踏板終止電擊，而另一組（Yoked組）踩壓面前的踏板沒(méi)有任何作用，它們將經(jīng)歷和Master組在時(shí)間與時(shí)長(zhǎng)上相同的電刺激——這些刺激對(duì)Yoked 組是不可逃避的。Yoked 組無(wú)法完成接下來(lái)的穿梭箱測(cè)試（shuttle box test），這是因?yàn)樗鼈儗W(xué)習(xí)到自身的行為無(wú)法終止電擊或使自己逃離懲罰，進(jìn)而將此學(xué)習(xí)結(jié)果應(yīng)用于之后的情形中。此現(xiàn)象被稱(chēng)為習(xí)得性無(wú)助。習(xí)得性無(wú)助行為在其他物種中也得到研究，如小鼠［2-3］、斑馬魚(yú)［4］、蜜蜂［5］和果蠅［6-7］。因習(xí)得性無(wú)助而改變的行為與狀態(tài)有很多，包括對(duì)厭惡型刺激的躲避減少、糖水偏好降低［8-10］、快感缺失、食物攝入變化［11-12］、睡眠紊亂［13-14］、社交行為減少［15-16］、免疫系統(tǒng)紊亂［17］、認(rèn)知能力和注意力下降［18-19］、情緒變化［20-21］等。

Heatbox 是一種研究果蠅操作式條件化的實(shí)驗(yàn)儀器，它根據(jù)果蠅是否運(yùn)動(dòng)或所處的空間位置對(duì)果蠅進(jìn)行高溫厭惡型刺激，以訓(xùn)練果蠅形成對(duì)運(yùn)動(dòng)或特 定 空 間 位 置 的 偏 好［22-23］。Yang 等［6］利 用Heatbox 對(duì)果蠅的習(xí)得性無(wú)助行為進(jìn)行了研究。經(jīng)歷過(guò)不可逃避刺激的Yoked組果蠅與可以控制環(huán)境溫度的Master 組果蠅相比，行為模式發(fā)生變化，如活躍度降低、爬行速度下降、逃離高溫懲罰的反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)。此外，使用Heatbox能夠?qū)壍目臻g位置學(xué)習(xí)能力進(jìn)行檢測(cè)［23］。野生型果蠅具有很強(qiáng)的空間位置學(xué)習(xí)能力，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練可快速形成短時(shí)程記憶，在檢測(cè)階段避免進(jìn)入之前被懲罰的區(qū)域。然而，對(duì)于果蠅習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)是否對(duì)其學(xué)習(xí)認(rèn)知能力產(chǎn)生影響，目前依然未知。本文在Heatbox基礎(chǔ)上建立了全新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，既可以研究果蠅的習(xí)得性無(wú)助，也可以研究果蠅的空間位置學(xué)習(xí)能力，因此可以通過(guò)給予果蠅不可逃避刺激來(lái)建立其習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)，再檢測(cè)這種無(wú)助狀態(tài)對(duì)果蠅的空間位置記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置組成與工作原理

實(shí)驗(yàn)裝置主要由兩個(gè)模塊構(gòu)成：

a.果蠅運(yùn)動(dòng)檢測(cè)模塊

果蠅運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的基礎(chǔ)是一個(gè)半導(dǎo)體制冷片（40 mm×40 mm），它被厚度為2 mm的亞克力框架分隔成兩個(gè)相等區(qū)域（30 mm×12.5 mm），每個(gè)區(qū)域被定義為一只果蠅的運(yùn)動(dòng)空間，上方的透明石英玻璃片防止它們爬出運(yùn)動(dòng)空間（圖1）。同一個(gè)制冷片上允許兩只果蠅同時(shí)單獨(dú)運(yùn)動(dòng)。整個(gè)模塊由多個(gè)果蠅運(yùn)動(dòng)平臺(tái)組成。上方設(shè)置紅外高清攝像機(jī)，同時(shí)采集多個(gè)果蠅運(yùn)動(dòng)平臺(tái)內(nèi)所有果蠅的位置信息，并傳輸給實(shí)驗(yàn)軟件。全部運(yùn)動(dòng)平臺(tái)和攝像機(jī)由長(zhǎng)方形框架（60 cm×70 cm×80 cm，L×W×H）覆蓋黑色遮光布罩住，避免外部光線和視覺(jué)信息的影響，內(nèi)部由兩個(gè)紅外光源補(bǔ)光。每個(gè)半導(dǎo)體制冷片均連接水冷散熱裝置，保證熱量快速被排出。

b.控制模塊

控制模塊包括數(shù)模轉(zhuǎn)換單元、繼電器開(kāi)關(guān)單元、溫度感應(yīng)器和電源，可對(duì)系統(tǒng)溫度進(jìn)行精確控制。因半導(dǎo)體制冷片具有溫度升降慣性，若僅簡(jiǎn)單控制流經(jīng)半導(dǎo)體制冷片電流的方向和電源開(kāi)關(guān)，雖然可以使溫度最終達(dá)到目標(biāo)值，但卻帶來(lái)因慣性而大幅超出目標(biāo)溫度后才能緩慢穩(wěn)定的問(wèn)題，這一過(guò)程可以長(zhǎng)達(dá)十余秒，這相比果蠅的運(yùn)動(dòng)行為顯著滯后。如果半導(dǎo)體制冷片的溫度變化不能與果蠅行為精準(zhǔn)匹配，將使果蠅無(wú)法把溫度變化與自身行為相關(guān)聯(lián)，直接影響行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。為避免以上情況的出現(xiàn)，本文使用了增量式PID控制算法實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度升降的快速精準(zhǔn)控制，進(jìn)而達(dá)到溫度與果蠅行為的精準(zhǔn)匹配效果。

Fig.1 Two moving arenas on one Peltier element

完整實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，位于運(yùn)動(dòng)平臺(tái)上方的紅外高清攝像機(jī)連續(xù)采集果蠅的位置信息，通過(guò)Noduls EthoVision?軟件進(jìn)行邏輯判斷果蠅是否處于懲罰區(qū)（空間位置學(xué)習(xí)范式）或是否處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)（習(xí)得性無(wú)助范式），進(jìn)而決定是否對(duì)果蠅進(jìn)行高溫懲罰；依據(jù)是否懲罰的實(shí)際情況將升降溫命令最終發(fā)送至繼電器開(kāi)關(guān)單元，控制輸出正向電流（升溫）或負(fù)向電流（降溫），自行編寫(xiě)的溫度控制軟件可對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行自動(dòng)、精確的控制，使半導(dǎo)體制冷片達(dá)到并保持在目標(biāo)溫度。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，果蠅自身所處位置或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)由其環(huán)境溫度變化而得到保持或規(guī)避，因而屬于操作式條件化實(shí)驗(yàn)范式。

1.2 溫度變化評(píng)估

為了客觀、準(zhǔn)確的評(píng)估儀器設(shè)備中溫度變化的速度與穩(wěn)定性，對(duì)半導(dǎo)體制冷片從起始溫度至目標(biāo)溫度所用時(shí)間，以及達(dá)到目標(biāo)溫度后的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)算。 使用以下公式計(jì)算穩(wěn)定指數(shù)SI(stability index)，指數(shù)越接近0，表示溫度越穩(wěn)定。

T為實(shí)際溫度，Ttarget為目標(biāo)溫度，Ttarget+ 1 和Ttarget- 1為目標(biāo)溫度正負(fù)1℃之內(nèi)的偏差。

1.3 空間位置學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)范式

果蠅空間位置學(xué)習(xí)是訓(xùn)練果蠅將運(yùn)動(dòng)空間內(nèi)的部分區(qū)域與厭惡型刺激偶聯(lián)起來(lái)，從而在檢測(cè)階段即使沒(méi)有厭惡型刺激的條件下也避免進(jìn)入該區(qū)域的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。首先實(shí)驗(yàn)軟件將果蠅運(yùn)動(dòng)空間分為兩個(gè)相等的區(qū)域（各15 mm×12. 5 mm）：一個(gè)為懲罰區(qū)，另一個(gè)為非懲罰區(qū)。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期（Pretest）、訓(xùn)練期（Training）和檢測(cè)期（Test）3個(gè)階段。為了使果蠅適應(yīng)所處運(yùn)動(dòng)空間，適應(yīng)期允許果蠅在25℃的半導(dǎo)體制冷片上自由運(yùn)動(dòng)30 s。在隨后進(jìn)行的訓(xùn)練期中，計(jì)算機(jī)通過(guò)對(duì)攝像頭采集的果蠅位置圖像進(jìn)行實(shí)時(shí)處理，一旦果蠅進(jìn)入懲罰區(qū)域，就控制半導(dǎo)體制冷片整體從25℃升溫至懲罰溫度，若果蠅在非懲罰區(qū)域一側(cè)，則整體溫度保持在25℃。訓(xùn)練期可以分為連續(xù)訓(xùn)練方式和間隔訓(xùn)練方式，在連續(xù)訓(xùn)練方式中為連續(xù)的5 個(gè)1 min，而在間隔訓(xùn)練方式中，訓(xùn)練過(guò)程以［1 min 訓(xùn)練+30 s 測(cè)試］的方式重復(fù)5 次。在第5 個(gè)測(cè)試期（5 Te）檢測(cè)果蠅的行為表現(xiàn)指數(shù)（performance index，PI）與0是否有顯著性差異。檢測(cè)期果蠅運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的溫度穩(wěn)定于25℃。

Fig.2 Process of experimental procedure

通過(guò)下列公式計(jì)算出果蠅在適應(yīng)期、訓(xùn)練期和檢測(cè)期的PI，t為果蠅在不同區(qū)域停留的時(shí)間。根據(jù)測(cè)試階段中的PI是否顯著性大于0來(lái)判斷果蠅是否形成了空間位置記憶。

1.4 習(xí)得性無(wú)助行為實(shí)驗(yàn)范式

1.4.1 Master/Yoked 組果蠅配對(duì)習(xí)得性無(wú)助行為范式

一對(duì)Master/Yoked組的果蠅被分別置于同一個(gè)半導(dǎo)體制冷片上的兩個(gè)運(yùn)動(dòng)空間內(nèi)。Master組果蠅如果停止運(yùn)動(dòng)超過(guò)1 s，半導(dǎo)體制冷片將迅速升溫，對(duì)該制冷片上的Master組和Yoked組的果蠅同時(shí)施于40℃高溫懲罰。Master 果蠅再次開(kāi)始運(yùn)動(dòng)時(shí)，此對(duì)果蠅所處的制冷片溫度下降至25℃。Yoked組果蠅被施予了無(wú)法逃避的熱懲罰，從而最終表現(xiàn)出習(xí)得性無(wú)助。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期、訓(xùn)練期和檢測(cè)期3個(gè)階段。果蠅先在30 s 的適應(yīng)期內(nèi)熟悉25℃的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在訓(xùn)練期Yoked組的果蠅隨著Master組果蠅被動(dòng)接受不可逃避的熱懲罰，分為短時(shí)程訓(xùn)練期和長(zhǎng)時(shí)程訓(xùn)練期。短時(shí)程訓(xùn)練期的時(shí)間為一次連續(xù)的10 min；長(zhǎng)時(shí)程訓(xùn)練期中一次訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)至1 h，同時(shí)一只果蠅連續(xù)3 日每天9～10 點(diǎn)和15～16點(diǎn)分別接受1 h 的訓(xùn)練，即每只果蠅共經(jīng)歷6 次訓(xùn)練。在整個(gè)訓(xùn)練期間，保持Master/Yoked組果蠅的配對(duì)。熱懲罰溫度為40℃。果蠅習(xí)得性無(wú)助的行為檢測(cè)在每次訓(xùn)練后的測(cè)試期完成。測(cè)試期中溫度不再發(fā)生變化，穩(wěn)定于25℃，時(shí)長(zhǎng)為3 min。短時(shí)程訓(xùn)練期的果蠅只檢測(cè)1次，而長(zhǎng)時(shí)程訓(xùn)練期的果蠅一共檢測(cè)6次。

通過(guò)統(tǒng)計(jì)和比較適應(yīng)期、訓(xùn)練期和檢測(cè)期中Master和Yoked組果蠅的活躍度和爬行速度來(lái)判斷Yoked組的果蠅是否表現(xiàn)出習(xí)得性無(wú)助。果蠅運(yùn)動(dòng)速度大于等于2 mm/s 被定義為處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)；活躍度是果蠅在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間占總時(shí)間的百分比，爬行速度是指果蠅在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下的每秒移動(dòng)的距離。

1.4.2 隨機(jī)熱懲罰果蠅習(xí)得性無(wú)助行為范式

由計(jì)算機(jī)程序給予果蠅運(yùn)動(dòng)平臺(tái)上的果蠅隨機(jī)的、不可逃避的熱刺激懲罰（LH 組），而對(duì)照組（Control組）果蠅不被施予熱刺激懲罰。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期、訓(xùn)練期和檢測(cè)期3個(gè)階段。果蠅在30 s的適應(yīng)期內(nèi)適應(yīng)25℃的環(huán)境。訓(xùn)練期實(shí)驗(yàn)組果蠅接受50 次1～10 s 時(shí)長(zhǎng)不等的熱刺激懲罰，每?jī)纱螒土P之間的間隔為2～10 s的隨機(jī)時(shí)長(zhǎng)。熱懲罰溫度為40℃。

隨機(jī)刺激實(shí)驗(yàn)流程中的檢測(cè)期需要果蠅完成逃避行為。當(dāng)制冷片溫度自動(dòng)升高時(shí)，果蠅需要穿越運(yùn)動(dòng)空間中線移動(dòng)至空間另一側(cè)，以使熱懲罰停止，制冷片溫度隨之降低至25℃。10 s后下次熱刺激再次開(kāi)始，共重復(fù)30 次。果蠅從溫度升高開(kāi)始到逃離至另一側(cè)的時(shí)間為逃離時(shí)間（escape latency）。如果一只果蠅始終沒(méi)有穿過(guò)中線完成逃離任務(wù)，溫度在達(dá)到目標(biāo)溫度40℃后保持30 s，然后自動(dòng)降低至25℃，并記為一次逃離失?。╡scape failure）。逃離失敗時(shí)的30 s不計(jì)入逃離時(shí)間。對(duì)照組果蠅沒(méi)有經(jīng)歷隨機(jī)熱刺激懲罰，直接進(jìn)行逃避行為檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)和對(duì)比兩組果蠅的逃離時(shí)間與逃離失敗次數(shù)判斷果蠅是否表現(xiàn)出習(xí)得性無(wú)助。此外還可以統(tǒng)計(jì)比較適應(yīng)期和訓(xùn)練后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組果蠅的活躍度和爬行速度。

1.5 果蠅及果蠅飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用果蠅均以標(biāo)準(zhǔn)食物配方［24］飼養(yǎng)，培養(yǎng)間溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度保持在60%，光照條件為12 h∶12 h的明暗周期。實(shí)驗(yàn)中所用果蠅品系包括野生型CantonS品系和突變體rut2080品系（來(lái)自德國(guó)Heisenberg教授實(shí)驗(yàn)室）。所有果蠅均為3～6日齡，實(shí)驗(yàn)中不區(qū)分性別。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用單樣本t檢驗(yàn)單組果蠅的行為指數(shù)PI與隨機(jī)水平0是否有顯著差異。柱狀圖中的誤差線為均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。使用t檢驗(yàn)Master 組和Yoked 組果蠅以及LH 組和control 組果蠅之間的行為差異。顯著性水平如下：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.P>0.05。

2 結(jié)果

2.1 新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)可進(jìn)行空間位置學(xué)習(xí)和習(xí)得性無(wú)助行為實(shí)驗(yàn)

2.1.1 新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)可精確控制溫度

在新建立的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)中采用了數(shù)字繼電器開(kāi)關(guān)、高靈敏度溫控、大功率水冷系統(tǒng)和PID控制算法等措施。通過(guò)升降溫曲線可以看出，半導(dǎo)體制冷片溫度可以在升降溫過(guò)程中快速的達(dá)到目標(biāo)溫度并保持穩(wěn)定。從25℃升溫至40℃需要（0.45±0.04）s，從40℃降溫至25℃需要（0.56±0.03）s；在達(dá)到目標(biāo)溫度后具有較高的穩(wěn)定性，目標(biāo)溫度40℃時(shí)，穩(wěn)定指數(shù)為0.16，目標(biāo)溫度25℃時(shí)，穩(wěn)定指數(shù)為0.23（圖3）。結(jié)果顯示，系統(tǒng)在升降溫速度和維持目標(biāo)溫度值的穩(wěn)定性兩方面均達(dá)到了精準(zhǔn)控制的效果。升降溫速度和溫度穩(wěn)定性的提高有助于加強(qiáng)果蠅自身所處位置或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與其所處環(huán)境溫度的偶聯(lián)，進(jìn)而增強(qiáng)訓(xùn)練效果。

Fig.3 New control system with PID algorithm improves the temperature heating/cooling speed and its stability(a) Temperature changes in heating process. (b) Temperature arrived from 25℃to 40℃in (0.45±0.04) s. (c) SI at 40℃was 0.16. (d)Temperature changes in cooling process. (e) Temperature arrived from 40℃to 25℃in(0.56±0.03)s.(f)SI at 25℃was 0.23.n=80-89.

2.1.2 空間位置記憶能力隨著懲罰溫度升高而增強(qiáng)

在經(jīng)典條件化和操作式條件化中，刺激越強(qiáng)烈，效果就越明顯［23，25］。本文使用不同的溫度作為懲罰，對(duì)果蠅進(jìn)行空間位置學(xué)習(xí)的訓(xùn)練。每個(gè)運(yùn)動(dòng)空間被等分為懲罰與非懲罰兩個(gè)區(qū)域，使用的4種懲罰溫度分別為30℃、35℃、40℃和45℃。當(dāng)果蠅在訓(xùn)練階段進(jìn)入懲罰區(qū)域時(shí)，溫度作為厭惡型懲罰會(huì)上升到相應(yīng)的數(shù)值，果蠅離開(kāi)懲罰區(qū)域溫度降為25℃。在訓(xùn)練階段，使用35℃及更高的溫度作為懲罰溫度時(shí)，從第2 分鐘（2 Tr）可檢測(cè)到PI值與0 具有顯著性差異（t檢驗(yàn)，35℃、40℃和45℃分別P=0.0026、0.0032、0.0001），即可觀察到果蠅的躲避行為（圖4）；而在使用30℃的懲罰溫度時(shí)，只有在第4 和第5 分鐘（4 Tr 和5 Tr）的PI值顯著高于0（t檢驗(yàn)，P= 0.0167 和P=0.0054），果蠅表現(xiàn)出對(duì)高溫區(qū)域的躲避行為。使用30℃作為懲罰溫度時(shí)，第2～5分鐘（2 Tr-5 Tr）PI值顯著低于40℃組（t檢驗(yàn)，2 Tr中P=0.0291，3 Tr 中P=0.0194，4 Tr 中P=0.0011，5 Tr 中P=0.0041）和45℃組（t檢驗(yàn)，2 Tr中P=0.002，3 Tr中P< 0.0001，4 Tr 中P= 0.0109，5 Tr 中P=0.0007）。40℃和45℃組的PI值在訓(xùn)練階段第5分鐘時(shí)也顯著高于35℃組（t檢驗(yàn)，40℃vs. 35℃P=0.0109，45℃vs.35℃P=0.0023）。在檢測(cè)階段，40℃組和45℃組的PI值顯著高于0（t檢驗(yàn)，40℃P=0.0016，45℃P=0.0021）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，懲罰溫度35～45℃組的果蠅更快也更強(qiáng)烈的表現(xiàn)出對(duì)高溫的逃避行為，而其中選擇用40℃和45℃作為懲罰溫度時(shí)果蠅具有更強(qiáng)的空間位置學(xué)習(xí)行為表現(xiàn)。考慮到45℃的高溫可能會(huì)對(duì)果蠅造成的物理傷害，最終影響其運(yùn)動(dòng)能力，我們?cè)谥髮?shí)驗(yàn)中均采用40℃作為懲罰溫度。

Fig.4 PI in place-learning paradigm with different punishing temperatures（n=22-30）

2.1.3 間隔性訓(xùn)練的空間位置學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)范式可形成長(zhǎng)時(shí)程記憶

Fig.5 Flies showed robust escape behavior in training phases and high preference index in 5 Te phase（n=56）

間斷性訓(xùn)練可以幫助動(dòng)物形成長(zhǎng)時(shí)程記憶［23，25］?？臻g位置學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)范式中的間隔性訓(xùn)練由5 次［1 min 訓(xùn)練+ 30 s 測(cè)試］組成，研究這樣是否能夠進(jìn)一步提高果蠅的空間位置記憶指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從第一次訓(xùn)練開(kāi)始（1 Tr）果蠅的PI均顯著性大于0，果蠅能夠快速學(xué)習(xí)到空間位置和熱懲罰的偶聯(lián)關(guān)系，且在5次訓(xùn)練和測(cè)試循環(huán)的過(guò)程中PI值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在測(cè)試階段PI值顯著高于0（圖5）。果蠅在間隔性訓(xùn)練流程中表現(xiàn)出明顯的躲避行為以及在熱刺激停止后表現(xiàn)出優(yōu)秀的空間位置學(xué)習(xí)記憶。

2.1.4rutabaga突變果蠅不可完成空間位置學(xué)習(xí)

在之前的研究中，果蠅被證明可以在Heatbox中完成空間位置學(xué)習(xí)任務(wù)，快速分辨出與熱懲罰偶聯(lián)的區(qū)域并且避免進(jìn)入該區(qū)域，從而免受高溫懲罰［23］。而與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的突變體果蠅，如rutagaba品系，無(wú)法在該范式中表現(xiàn)出正常的學(xué)習(xí)能力［22，26］。在新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，我們檢測(cè)了野生型果蠅和rut2080突變品系果蠅的空間位置學(xué)習(xí)能力。野生型果蠅在連續(xù)5 min的訓(xùn)練階段具有很強(qiáng)的對(duì)高溫的躲避行為，PI值顯著大于0（t檢驗(yàn)，P<0.0001）。在停止高溫懲罰的測(cè)試階段，PI值依然與0 有顯著性差異（t檢驗(yàn)，P<0.0001）。這說(shuō)明野生型果蠅在訓(xùn)練階段，將運(yùn)動(dòng)區(qū)域的懲罰一側(cè)與厭惡型刺激高溫偶聯(lián)，通過(guò)較少進(jìn)入該范圍而躲避高溫懲罰。在訓(xùn)練之后的測(cè)試階段它們形成了空間位置的記憶，更多的時(shí)間停留在之前不會(huì)受到懲罰的區(qū)域。而rut2080品系的PI值在訓(xùn)練和測(cè)試階段均與0沒(méi)有顯著性差異（t檢驗(yàn)，訓(xùn)練階段P=0.0955，測(cè)試階段P=0.1641），沒(méi)有表現(xiàn)出空間位置學(xué)習(xí)記憶能力（圖6）。

Fig.6 PI in wild type and rut2080 flies（n=21-28）(a)CS flies learned to stay on the unpunished side of moving arena after 10 min training phase.(b)rut2080 mutant flies could not learn in this paradigm.

2.1.5 果蠅表現(xiàn)出習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)

在新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上進(jìn)行了Master/Yoked組果蠅配對(duì)習(xí)得性無(wú)助的行為實(shí)驗(yàn)。Master組和Yoked組的活躍度雖然在訓(xùn)練階段均緩慢降低，但Master組的活躍度始終顯著高于Yoked組。在測(cè)試階段的第1分鐘Master組依然顯著比Yoked組更加活躍（t檢驗(yàn)，P=0.0141），第2和第3分鐘二者沒(méi)有顯著性差異（t檢驗(yàn)，P= 0.19 和P= 0.4105）。Master 組果蠅的爬行速度在訓(xùn)練階段比Yoked組高，其中第2、7、8、10、11 分鐘二者有顯著性差異（t檢驗(yàn)，P< 0.0001，P=0.0156，P=0.0047，P=0.0028，P=0.0002）。測(cè)試階段的第1分鐘Master組的爬行速度也顯著性高于Yoked 組果蠅（t檢驗(yàn)，P=0.0005）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然在訓(xùn)練階段兩組果蠅經(jīng)歷了同樣的高溫刺激，但Yoked 果蠅的活躍度、運(yùn)動(dòng)速度在訓(xùn)練階段均低于可以控制環(huán)境溫度的Master果蠅。在沒(méi)有熱刺激的測(cè)試階段Yoked果蠅仍然在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)上與Master 果蠅有顯著差異（圖7）。

2.2 隨機(jī)刺激實(shí)驗(yàn)流程可訓(xùn)練果蠅習(xí)得性無(wú)助行為

為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，本文改進(jìn)了習(xí)得性無(wú)助行為范式實(shí)驗(yàn)方法，去除Master果蠅組，僅保留Yoked果蠅組，并使用隨機(jī)產(chǎn)生的熱刺激作為懲罰，之后檢測(cè)果蠅對(duì)高溫的逃避行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)歷過(guò)不可逃避隨機(jī)熱刺激的果蠅（LH），逃離時(shí)間顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)熱刺激的對(duì)照組（t檢驗(yàn)，P<0.001）；同時(shí)，不可逃避的熱懲罰也使LH 組果蠅的逃離失敗次數(shù)顯著增加（t檢驗(yàn)，P<0.001）（圖8a，b）。而且LH果蠅在高溫懲罰和非懲罰時(shí)間內(nèi)，爬行速度均顯著性低于對(duì)照組（t檢驗(yàn)，高溫P=0.0035，低溫P=0.0019）（圖8c）。兩組果蠅在適應(yīng)期中的的活躍度沒(méi)有顯著性差異（t檢驗(yàn)，P=0.824）（圖8d）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新實(shí)驗(yàn)流程同樣可以驗(yàn)證果蠅習(xí)得性無(wú)助行為，而且因?yàn)楦咏咏驯粡V泛采用的訓(xùn)練方式，具有更高的物種間可比性。

Fig.7 Master flies showed higher activity and walking speed in training phase and first test minute than yoked flies（n=109）(a) Master flies were more active in the 10 min training time than yoked flies. This difference lasted in first test minute. (b) The velocity of master flies was significantly higher than yoked flies,both in training phase and first test minute.*P<0.05;**P<0.01.

Fig.8 LH flies showed learned helplessness after random heat pulses（n=79）(a)LH flies reacted slower than control group to heat pulses and showed longer escape latency.(b)LH flies made more escape failures than control.(c)Walking speed of LH flies was lower both under high and low temperature.(d)No difference in activity in Pretest could be observed between two groups.*P<0.05;**P<0.01;n.s.P>0.05.

2.3 習(xí)得性無(wú)助行為使空間位置學(xué)習(xí)能力下降

前期的研究證明經(jīng)過(guò)不可逃避高溫刺激的果蠅的運(yùn)動(dòng)和逃離行為產(chǎn)生變化，為了研究習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)是否在學(xué)習(xí)等認(rèn)知方面也有表現(xiàn)，本文對(duì)表現(xiàn)出習(xí)得性無(wú)助的果蠅進(jìn)行了空間位置學(xué)習(xí)的檢測(cè)。

首先，為了延長(zhǎng)果蠅的習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)，使用長(zhǎng)時(shí)程訓(xùn)練流程。在隨機(jī)刺激試驗(yàn)流程中，雖然經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的果蠅在適應(yīng)期中活躍度和對(duì)照組沒(méi)有顯著差別（圖8d），但在空間位置學(xué)習(xí)范式訓(xùn)練階段活躍度過(guò)低，不適合作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（數(shù)據(jù)未展示），所以在此使用Master/Yoked分組的空間位置學(xué)習(xí)范式。歷時(shí)3 d的實(shí)驗(yàn)中，每只果蠅經(jīng)歷6次共6 h的訓(xùn)練，每次訓(xùn)練檢測(cè)Master/Yoked組的果蠅活躍程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Yoked組的果蠅在每個(gè)測(cè)試階段的活躍度與Master 組的果蠅相比均有顯著降低（t檢驗(yàn)，第1 天上午P< 0.001，第1 天下午P=0.0053；第2 天上午P=0.0437，第2 天下午P=0.0112；第3 天上午P=0.0125，第3 天下午P=0.005）（圖9）。

Fig.9 Master showed higher activities in test phase after 1 h training in day 1-3，respectively（n=45-47）(a-c)In long term training protocol,flies were trained in morning and afternoon for 3 d,1 h for each training session.Master flies were more active in the test phase after 1 h training phase in all 3 d.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.

長(zhǎng)時(shí)程習(xí)得性無(wú)助訓(xùn)練之后進(jìn)行空間位置記憶檢測(cè)。在空間位置訓(xùn)練中，之前的Master與Yoked組的果蠅均可以通過(guò)避免進(jìn)入與高溫偶聯(lián)的懲罰區(qū)域而免于高溫懲罰，在間隔性訓(xùn)練之后測(cè)試其PI。結(jié)果顯示，在空間位置學(xué)習(xí)范式中，雖然兩組果蠅都能較好的訓(xùn)練中躲避熱懲罰區(qū)域，但之前經(jīng)歷過(guò)隨機(jī)的、不可逃避的熱懲罰的Yoked 組果蠅，在5次訓(xùn)練之后的測(cè)試階段（5 Te）記憶指數(shù)顯著低于Master組果蠅的記憶指數(shù)（t檢驗(yàn)，5 TeP=0.0011）（圖10a）。而兩組果蠅在訓(xùn)練和測(cè)試階段的活躍度并沒(méi)有顯著性差異（圖10b）。

3 討論與展望

隨著習(xí)得性無(wú)助行為模型在不同物種中的建立，該行為范式已逐漸發(fā)展為最重要的人類(lèi)抑郁癥動(dòng)物模型之一，并得到越來(lái)越深入的研究。本研究首先建立了新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，能夠精準(zhǔn)控制溫度并高效對(duì)果蠅進(jìn)行行為測(cè)試。其次，使用新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和新實(shí)驗(yàn)流程，能檢測(cè)到果蠅的空間位置記憶和習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)。最后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)程不可逃避刺激訓(xùn)練的果蠅，能夠檢測(cè)到活動(dòng)性降低等習(xí)得性無(wú)助表現(xiàn)，隨后的空間位置記憶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，果蠅空間位置記憶能力下降。

3.1 建立新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

在新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)中使用40 mm×40 mm 的半導(dǎo)體制冷片，使單只果蠅的運(yùn)動(dòng)空間達(dá)到30 mm×12.5 mm，面積約為Heatbox 中運(yùn)動(dòng)范圍的3.2 倍。果蠅可在此空間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)更接近其自然爬行狀態(tài)。運(yùn)動(dòng)空間上方配備的紅外攝像機(jī)，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可觀察每一只果蠅的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，如出現(xiàn)果蠅在實(shí)驗(yàn)中死亡等特殊情況可根據(jù)需要排除特定果蠅或者終止實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，完整實(shí)驗(yàn)過(guò)程可被全程錄像記錄，用于實(shí)驗(yàn)后再次對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理或者確認(rèn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程等。習(xí)得性無(wú)助實(shí)驗(yàn)中，同一個(gè)半導(dǎo)體制冷片上的兩個(gè)運(yùn)動(dòng)空間分別放置一對(duì)Master組和Yoked組的果蠅，可達(dá)到兩只果蠅經(jīng)歷升降溫事件的高度一致的效果，避免因不同半導(dǎo)體制冷片而產(chǎn)生的系統(tǒng)性誤差。數(shù)字繼電器、高精度溫度傳感器、水冷等部件使溫度得到精準(zhǔn)控制，配合PID算法溫控軟件和Noduls EthoVision?實(shí)驗(yàn)軟件，半導(dǎo)體制冷片可以根據(jù)果蠅自身運(yùn)動(dòng)快速升降溫，在0.6 s 之內(nèi)達(dá)到并穩(wěn)定在25℃或40℃的目標(biāo)溫度。

本文使用新平臺(tái)重復(fù)了野生型和突變體果蠅的空間位置學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)和習(xí)得性無(wú)助行為實(shí)驗(yàn)。此外，新平臺(tái)不僅能使用間隔性訓(xùn)練流程對(duì)果蠅的空間位置學(xué)習(xí)進(jìn)行測(cè)試，還能使用長(zhǎng)時(shí)程不可逃避刺激訓(xùn)練流程，檢測(cè)果蠅習(xí)得性無(wú)助行為對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力和學(xué)習(xí)認(rèn)知能力方面的影響。

3.2 果蠅學(xué)習(xí)認(rèn)知能力受習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)影響

本文使用新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)對(duì)果蠅空間位置學(xué)習(xí)進(jìn)行了研究，并且使用間隔訓(xùn)練方式使果蠅更易形成長(zhǎng)時(shí)程記憶。在習(xí)得性無(wú)助范式中，檢測(cè)到果蠅經(jīng)過(guò)3 d長(zhǎng)時(shí)程不可逃避熱刺激后，其空間位置學(xué)習(xí)能力降低。其原因首先是重復(fù)的訓(xùn)練過(guò)程加強(qiáng)果蠅的學(xué)習(xí)效果，將高溫與不可逃避刺激進(jìn)行更強(qiáng)烈的偶聯(lián)，使果蠅面對(duì)之后的可逃避的高溫刺激時(shí)有更高的概率放棄逃跑，表現(xiàn)出無(wú)助狀態(tài)。另一個(gè)原因可能是經(jīng)歷連續(xù)3 d的訓(xùn)練后，相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，使果蠅行為模式發(fā)生改變。在長(zhǎng)時(shí)程習(xí)得性無(wú)助訓(xùn)練中，依然使用Master/Yoked 組合，而非隨機(jī)刺激的實(shí)驗(yàn)流程。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)程隨機(jī)刺激后，果蠅的活躍度顯著下降，在之后的空間位置學(xué)習(xí)范式中，它們會(huì)在非懲罰區(qū)域保持長(zhǎng)時(shí)間的靜止，而無(wú)法在訓(xùn)練階段得到足夠的熱刺激，所以隨機(jī)刺激流程并不適合此范式。但隨機(jī)刺激流程因更加簡(jiǎn)潔方便，并且和小鼠等動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作更相似，依然是有效的習(xí)得性無(wú)助實(shí)驗(yàn)范式。

3.3 展望

習(xí)得性無(wú)助行為在1967 年利用狗作為動(dòng)物模型被發(fā)現(xiàn)后，隨后在包括小鼠、果蠅等多種動(dòng)物中都建立了研究該行為的實(shí)驗(yàn)范式［2，6-7］。因?yàn)榱?xí)得性無(wú)助動(dòng)物模型中的許多行為表現(xiàn)與人類(lèi)抑郁癥癥狀有相似之處，且基于單胺假說(shuō)的多種抗抑郁藥物被證明對(duì)習(xí)得性無(wú)助范式模型中的動(dòng)物行為有改善效果，所以習(xí)得性無(wú)助成為廣泛應(yīng)用的抑郁癥動(dòng)物模型和抑郁癥藥物篩選模型之一［27-28］。5-羥色胺［29-31］，多巴胺［32-33］還有去甲腎上腺素［34］都對(duì)小鼠的習(xí)得性無(wú)助行為有顯著影響。不可逃避的刺激也會(huì)引起動(dòng)物腦神經(jīng)回路廣泛的變化，包括下丘腦、腹側(cè)被蓋、伏隔核、海馬、杏仁核、新皮質(zhì)以及中縫背核、藍(lán)斑和韁核等［35-36］。在果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)，蕈形體在習(xí)得性無(wú)助行為中起到重要作用［37］。激 活 蕈 形 體α 和β 葉 中5-羥 色 胺 受 體5-HT1A或γ葉中5-HT1B受體神經(jīng)元可以分別阻止或加重果蠅的習(xí)得性無(wú)助行為表現(xiàn)。然而，對(duì)抑郁癥和習(xí)得性無(wú)助行為動(dòng)物模型的理解和認(rèn)知依然有限，也缺乏對(duì)重度抑郁障礙的有效治療方法。相信隨著果蠅習(xí)得性無(wú)助行為新平臺(tái)的建立，結(jié)合果蠅神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單、便于轉(zhuǎn)基因操作等特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)相關(guān)神經(jīng)元的阻斷和挽回實(shí)驗(yàn)，可以快速完成對(duì)不同神經(jīng)遞質(zhì)的突變體（包括神經(jīng)遞質(zhì)合成酶、轉(zhuǎn)運(yùn)酶和遞質(zhì)受體等突變體）的篩選工作；再通過(guò)對(duì)果蠅不同腦區(qū)的神經(jīng)阻斷，研究具體神經(jīng)遞質(zhì)在果蠅腦中起作用的位置。這將對(duì)進(jìn)一步加深對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的理解和治療方法的探求起到重要推進(jìn)作用。

對(duì)果蠅的空間位置學(xué)習(xí)能力的研究較為深入。有研究提示果蠅的腹神經(jīng)節(jié)、中間束和嗅球可能在空間位置學(xué)習(xí)中起到重要作用［26］。同時(shí)，5-羥色胺和多巴胺能影響果蠅的空間位置學(xué)習(xí)能力，章胺等神經(jīng)遞質(zhì)則不參與其中［38-39］。然而，神經(jīng)遞質(zhì)是如何在此過(guò)程中發(fā)揮作用，怎么影響果蠅的空間學(xué)習(xí)和記憶卻仍然不清楚。利用新建立的果蠅空間位置學(xué)習(xí)范式，可以首先對(duì)不同腦區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行阻斷，驗(yàn)證并確定在果蠅空間位置學(xué)習(xí)中真正起重要作用的神經(jīng)元，然后再繼續(xù)篩選各種神經(jīng)遞質(zhì)在此范式中的影響，最后找到參與空間位置學(xué)習(xí)的神經(jīng)遞質(zhì)，在相關(guān)神經(jīng)元中分別進(jìn)行阻斷和挽回實(shí)驗(yàn)，尋找作用位點(diǎn)進(jìn)而確定果蠅空間位置學(xué)習(xí)的神經(jīng)環(huán)路作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)建立高效穩(wěn)定的溫度懲罰實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，首先對(duì)果蠅的空間位置學(xué)習(xí)能力進(jìn)行了檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)不同溫度下，果蠅空間位置學(xué)習(xí)能力不同。隨著溫度的升高，它們可以更快更久的找到并停留在正常溫度區(qū)域內(nèi)。而學(xué)習(xí)記憶突變體，如rutabaga，是無(wú)法完成這一學(xué)習(xí)過(guò)程的。隨后在習(xí)得性無(wú)助行為檢測(cè)中，利用Master/Yoked配對(duì)范式以及電腦給予隨機(jī)刺激范式，均可測(cè)得果蠅表現(xiàn)出習(xí)得性無(wú)助狀態(tài)。最后，研究發(fā)現(xiàn)在接受長(zhǎng)時(shí)程的不可逃避熱刺激后，果蠅的空間位置學(xué)習(xí)能力受到影響。本研究可進(jìn)一步加深對(duì)習(xí)得性無(wú)助行為和其影響的理解，進(jìn)而對(duì)了解和治療抑郁癥起到一定推進(jìn)作用。

致謝感謝劉繼勇博士和焦仁杰教授提供用于本文摘要配圖和刊物封面設(shè)計(jì)的果蠅照片。