陸文鵬 陳 民 董小耘

肺癌常年居于我國惡性腫瘤發(fā)病率和病死率首位，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是其中最常見的類型，約占原發(fā)性肺癌的85%[1]。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌病機屬本虛標(biāo)實，病位在肺，與肝、脾、腎關(guān)系密切[2]。小陷胸湯由黃連、半夏、瓜蔞組成，黃連苦寒，能泄熱除痞，半夏辛溫，可化痰散結(jié)，降逆水飲；三藥合用可清熱化痰散結(jié)，熊繼柏教授曾應(yīng)用小陷胸湯加減治療肺癌肝火犯肺、痰熱壅盛之證，并取得較好的療效[3]。臨床應(yīng)用當(dāng)把握其“痰熱互結(jié)”的病機，運用異病同治，可緩解多種心胸、脅下、胃脘不適疾病[4]。研究表明，小陷胸湯抗腫瘤的作用主要機制有：抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬，阻滯腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤血管生成，調(diào)節(jié)免疫抑制腫瘤微環(huán)境等[5]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，獲取有關(guān)NSCLC 患者跟正常人肺組織細(xì)胞的芯片，分析兩者中存在基因表達的差異，篩選小陷胸湯的主要活性成分，并探究其對NSCLC 的作用靶點及生物通路，以期進一步闡明小陷胸湯緩解NSCLC 的可能作用機制。

1 方 法

1.1 NSCLC 差異基因篩選 利用NCBI 子網(wǎng)站GEO數(shù)據(jù)庫，以“non-small cell lung cancer”為檢索詞，通過篩選，下載其相關(guān)GSE、GPL 平臺文件，使用R軟件利用“packages”“pheatmap”及“Limma”包以lgFC＞1（FC 表示差異倍數(shù)）、矯正后P 值＜0.05 為條件篩選出差異表達基因，并導(dǎo)出文件，后利用ggplot2包繪制差異基因火山圖；pheatmap 包繪制差異基因的熱圖。

1.2 小陷胸湯藥物成分及靶點篩選 以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為有效活性成分篩選條件，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選，獲取黃連、半夏、瓜蔞3 味中藥有效成分。結(jié)合TCMSP 中Relate Targets 的文件得到有效成分對應(yīng)的靶點，再通過uniprot 注釋文件，將靶點轉(zhuǎn)化為基因ID。

1.3 藥物與疾病共同靶點篩選及作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將1.1 中的NSCLC 靶點與1.2 中小陷胸湯潛在藥物靶點繪制韋恩圖，得到小陷胸湯與NSCLC 的共同靶點，將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.2，同時將上述“1.2”獲得的活性成分及靶點關(guān)系導(dǎo)入以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.4 蛋白互作與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將共同靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)。再利用Cytoscape 3.8.2 軟件對PPI 信息進行網(wǎng)絡(luò)可視化，并對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行分析，篩選出核心靶點。

1.5 靶點通路分析 利用Bioconductor 平臺將靶點基因ID 轉(zhuǎn)化為entrez ID。通過R 軟中相關(guān)Bioconductor 安裝包，設(shè)置P=0.05、Q=0.05 進行GO 富集分析，保存富集結(jié)果并選取生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）各自前10 位繪圖。同樣方法進行KEGG 分析，再利用Cytoscape3.8.2 軟件進行KEGG 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

1.6 分子對接驗證 從PDB 數(shù)據(jù)庫中篩選得到的關(guān)鍵靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)“.pdb”格式文件，在PubChem中得到小陷胸湯中對應(yīng)關(guān)鍵靶點蛋白的化合物的2D 結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Chem3D 軟件得到優(yōu)化后的3D 結(jié)構(gòu)；通過SYBYL-X 2.0 軟件對靶點蛋白去水、加氫、計算電荷等處理，再導(dǎo)入化合物3D 結(jié)構(gòu)，使用Surflex-Dock 模塊對藥物小分子和靶蛋白受體進行分子對接分析。根據(jù)Total-Score 打分函數(shù)對活性成分與靶標(biāo)蛋白相互作用進行評分，Total-Score 值愈大，說明小分子化合物與大分子蛋白的匹配結(jié)合作用越好。以Total-Score＞5 為閾值，進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 肺癌疾病靶點篩選結(jié)果 在GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取GSE1987 數(shù)據(jù)集，所采用的平臺為GPL91，共有9例正常人樣本及28 例NSCLC 患者樣本。共篩選出差異表達基因520 個，其中上調(diào)基因200 個、下調(diào)基因320 個。熱圖（見圖1）中橫坐標(biāo)是樣本名稱（正常對照組在前，腫瘤組在后），縱坐標(biāo)為基因名稱。表達程度由低到高用綠色、黑色、紅色標(biāo)注。如差異基因MMP1 在腫瘤組高表達，在正常對照組為低表達?；鹕綀D（見圖2）中，橫坐標(biāo)中l(wèi)ogFC＞1 時，表示在腫瘤組上調(diào)；logFC＜-1 時，表示在腫瘤組下調(diào)。

圖1 正常對照組與非小細(xì)胞腫瘤患者差異基因熱圖

圖2 正常對照組與非小細(xì)胞腫瘤患者差異基因火山圖注：黑色為在正常對照組與腫瘤組無差異基因；綠色為在正常對照組上調(diào)，在腫瘤組下調(diào)；紅色為在正常對照組下調(diào)，在腫瘤組上調(diào)

2.2 藥物成分及靶點篩選結(jié)果 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜索藥物的成分，篩選后得到有效成分：黃連14個，半夏13 個，瓜蔞11 個，見表1。結(jié)合Relate Targets 文件得到184 個靶點基因。

表1 藥物成分及靶點篩選結(jié)果

2.3 小陷胸湯緩解NSCLC 活性成分與作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖 將小陷胸湯與NSCLC 差異基因取交集后，得到交集Venn 圖（見圖3）及交集數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2，繪制分子基因網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4）。共得到潛在基因靶點20 個，對應(yīng)的有效成分19 個。其中對應(yīng)靶點較多的是黃連的活性成分槲皮素（對應(yīng)16個靶點），其次是半夏的活性成分松柏苷和卡維丁（各對應(yīng)4 個靶點）；對應(yīng)活性成分較多的靶點ADRB2（對應(yīng)10 個活性成分）、NR3C2 和F10（分別對應(yīng)7 個活性成分）可能為小陷胸湯緩解NSCLC的關(guān)鍵靶點。

圖3 小陷胸湯與非小細(xì)胞肺癌Venn 圖

圖4 小陷胸湯對非小細(xì)胞肺癌作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 小陷胸湯緩解NSCLC 基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖 將上一步所得20 個共同靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置置信度為Highest≥0.9，并剔除獨立于網(wǎng)絡(luò)以外的靶點，獲取PPI 相關(guān)信息，可得到PPI 圖（見圖5），利用Cytoscape3.8.2 軟件對PPI 信息進行網(wǎng)絡(luò)可視化，并對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行ClosenessDegree、Betweenness、Eigenvector 算法拓?fù)浞治稣页雒總€條件大于中位值的基因，并進行可視化（見圖6）。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖中，有20 個節(jié)點，202 條邊，其中黃色基因位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置為關(guān)鍵基因，其算法拓?fù)浞治鲋袀€數(shù)值均大于中位數(shù)，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖5 小陷胸湯緩解非小細(xì)胞肺癌基因的PPI 圖

圖6 小陷胸湯緩解非小細(xì)胞肺癌基因的蛋白拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點通路分析 使用R 軟件對小陷胸湯治療胃癌的基因進行GO 富集分析（見圖7）。靶點顯著富集于對類固醇、多細(xì)胞生物過程、對金屬離子的反應(yīng)等生物過程；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等細(xì)胞組成；絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸型水解酶活性等分子功能。

圖7 GO 富集分析氣泡圖

使用R 軟件，進行KEGG 富集分析，共富集到11 條通路關(guān)系（見圖8）。將KEGG 的11 條通路導(dǎo)入Cytoscape3.8.2。根據(jù)degree 值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖（見圖9）。其中液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（5 個靶點、13.5%）、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGERAGE）信號通路（4 個靶點10.8%）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（4 個靶點10.8%）、細(xì)胞衰老（4 個靶點10.8%）、p53 信號通路（3 個靶點8.1%）、IL-17 信號通路（3 個靶點8.1%）、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟（3 個靶點8.1%）、腫瘤壞死因子信號通路（3 個靶點8.1%）、細(xì)胞周期（3 個靶點8.1%）、松弛素信號通路（3 個靶點8.1%）、膀胱癌（2 個靶點5.4%）等，對應(yīng)的MMP9、CCL2、CDK1、CCNB1、MMP1、SELE 基因數(shù)目較多。

2.8 分子對接結(jié)果 將核心靶點CCL2、CAV1、IGFBP3、MMP9、SPP1、MMP1 與其對應(yīng)的化合物進行分子對接分析，其中CAV1、IGFBP3 在uniprot 中未找到合適的蛋白結(jié)構(gòu)。經(jīng)過計算Total-Score＞5 的有槲皮素與靶點MMP1（1HFC）以及槲皮素與靶點SPP1（3CXD）。見圖10。

圖10 槲皮素與MMP1（1HFC）及SPP1（3CXD）分子對接模型

3 討論

NSCLC 發(fā)病隱匿，胸部CT 作為早期篩查方案在我國常規(guī)體檢中并未完全普及，導(dǎo)致約有70%的NSCLC 患者確診時已是晚期[6]。目前治療多采用靶向治療、免疫治療和含鉑類雙藥化療等全身治療為主的綜合治療模式[7]，但這些藥物的使用對患者身體狀況要求較高。而中醫(yī)多作為輔助療法，能減輕西藥的不良反應(yīng)、增加治療效果、延緩病情進展，以延長患者的生存時間，改善患者生活質(zhì)量[8]。

本研究共篩選出小陷胸湯有效成分38 個，其中作用最顯著的是槲皮素，其余成分還有松柏苷、卡維丁、β-谷甾醇、小檗堿等。槲皮素為黃酮類化合物，其有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[9]。槲皮素可抑制肺癌細(xì)胞增殖生長和侵襲轉(zhuǎn)移、促進肺癌細(xì)胞凋亡、增加各項治療的敏感性，對肺癌裸鼠動物移植瘤也有明顯的抑制作用[10]。槲皮素能夠增強LAP3 基因沉默抗NSCLSC 中A549 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用，抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程[11]。松柏苷抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與其有抗炎[12]、抗氧化[13]的作用相關(guān)。卡維丁能明顯抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和NO 生成[14]，這是否是其抗腫瘤的機制可進一步研究。β-谷甾醇可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡性死亡[15]。小檗堿可通過調(diào)控Hedgehog 信號通路抑制肺癌干細(xì)胞增殖，促進其凋亡[16]。小檗堿在NSCLSC 化療中能協(xié)同降低p-STAT3 及其下游信號分子HIF-1α 和cyclin D1 的表達以增加化療敏感性[17]。氧化小檗堿通過下調(diào)Src-FAK-Ras-Raf-MEK-ERK 通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖，從而達到抗NSCLC 的作用[18]。

根據(jù)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖，MMP9、CAV1、MMP1、SPP1、CCL2、IGFBP3 可能是小陷胸湯緩解NSCLC 的關(guān)鍵作用靶點。MMP9 可作為NSCLC 診斷的潛在生物標(biāo)志物[19]，其與腫瘤細(xì)胞的侵襲性有關(guān)[20]。CCL2 能增強炎癥單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等特定細(xì)胞類型的抗腫瘤能力[21]。IGFBP3 是胰島素生長調(diào)控結(jié)合蛋白，其能阻斷癌細(xì)胞膜上糖蛋白配體，從而避免癌細(xì)胞內(nèi)第二信使激活，癌細(xì)胞增殖活性降低，升高IGFBP3 蛋白水平，能夠增加NSCLC 一線化療方案的敏感性[22]。根據(jù)GEO 數(shù)據(jù)庫所得NSCLC 基因熱圖，可見MMP1、SPP1 為NSCLC 高表達蛋白。

GO 富集分析顯示，小陷胸湯可通過多個靶點來緩解NSCLC。根據(jù)KEGG 通路分析，小陷胸湯治療NSCLC 主要涉及11 條通路，主要通路為糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、p53 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、松弛素信號通路等。AGERAGE 信號通路與炎癥反應(yīng)有關(guān)，該通路可以調(diào)節(jié)炎癥增殖階段發(fā)展[23]，有學(xué)者在探索薤白治療肺癌過程中發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE 信號通路是治療肺癌的重要通路之一，并繪制了AGE-RAGE 信號通路圖[24]。p53是目前較明確的與腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因，有研究表明肺癌與p53 表達水平有一定相關(guān)性[25]。抑制p53 信號通路可以抑制A549 細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡從而緩解NSCLS[26]。此外有研究表明，抑制通過該通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，對損傷的心肌、神經(jīng)元有一定保護作用[27-28]，這些在肺癌的治療過程中能緩解他臟并發(fā)癥。IL-17 高表達是肺癌患者無病生存的危險因素[29]，抑制IL-17 信號通路持續(xù)活化能有效調(diào)節(jié)腫瘤遷徙微環(huán)境，起到緩解肺癌的作用[30]。TNF 通路與多種免疫性疾病相關(guān)，TNF 是一種促炎因子，其在體內(nèi)外對多種腫瘤均有明顯的抑制和殺傷作用[31]，TNF-α 可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物之一[32]。肺癌治療中，激活TNF-α 通路可促進A549 細(xì)胞增殖和遷移能力[33]。松弛素為內(nèi)源性肺保護因子，可減輕肺纖維化，抑制氣道重塑[34]。

綜上所述，本研究為小陷胸湯中有效成分，通過聯(lián)合GEO 差異分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探究了小陷胸湯在NSCLC 治療中的作用機制，為小陷胸湯緩解NSCLC 提供了新的參考依據(jù)，但本研究仍存在一定局限性，相關(guān)作用靶點及通路仍需進一步驗證。